EcoR I限制性内切酶
限制性内切核酸酶消化DNA及从琼脂糖凝胶中回收DNA
紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，将切下的胶条置于1.5ml离 心管中； 加入3体积溶胶液，50~60℃数分钟直至无可见凝胶块； 冷却至室温； 加入到离心吸附柱中，室温放置1min后，5000～10000rpm 1~5min使 液体滤过；倒掉离心管中液体； 向离心柱中加入600ul漂洗液，10000rpm 2min洗涤一次；倒掉离心管 中液体 向离心柱中加入600ul漂洗液，10000rpm 2min洗涤一次；倒掉离心管 中液体； 将离心柱放入离心管中12000rpm 2min； 将离心柱放入新的1.5ml离心管中，向离心柱中滤膜上加入20~30ul洗 脱液，室温放置5min，12000rpm离心3min，液体中即为回收的核酸。
5‘…G GATCC…3’ 5‘…A GATCT…3’ 3‘…CCTAG G…5’ 3‘…TCTAG A…5’ 5‘…GGATCT…3’ 3‘…CCTAGA…5’ 这些粘性末端连接后， BamHI和BglII酶将 不能再切割，但可以利用Bfa1(酶切识别位点为 GATC)来进行再切割。
3. 酶切反应的设计一般应注意问题:
PCR产物的酶切 及琼脂糖凝胶电泳回收
限制性内切核酸酶消化DNA
限制性内切核酸酶（restriction enzyme) 是一类识别DNA上3-8个特定核苷酸序列并产 生切割反应的内切核酸酶(endonuclease)的 总称。在基因操作中，这些酶作为“剪刀” 对DNA起剪切作用，是分子生物学研究中不 可缺少的酶之一。
4. 酶切实验中的注意事项:
1) 反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时 应尽量缩短酶在室温的放置时间。
2) 反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内 切酶变性及DNA大分子的完整。
3) 反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于 管壁上的液滴全部沉至管底。 4) 终止酶反应可根据需要采用不同的方法： ①酶切后不需进行下一步反应，可加入含EDTA的终 止液终止反应。 ②若需进一步反应(如连接，切割等)，可将反应管 置65℃保温20-30分钟，以灭活酶，终止反应。
PCR
限制性内切酶的酶切与鉴定研究条件：材料：EcoRI酶及其缓冲液，HindIII酶及其缓冲液仪器：移液枪及吸头，水平式电泳装置，电泳仪，台式高速离心机，恒温水浴锅，微波炉，紫外透射仪。
试剂：5xTBE电泳缓冲液，6x电泳载样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液，贮存于4℃。
EB溶液操作步骤1、将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入质粒DNA （5---14 μl）和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水使总体积为18μl,将管内溶液混匀后加入Eco RI和Hin dⅢ各1μl,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。
此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。
使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。
2、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温1-3小时,使酶切反应完全。
3、每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。
4、在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，EB染色，紫外透射仪下观察或拍照PCR扩增实验准备：材料：模板DNA，引物试剂：PCR用Taq DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶缓冲液，dNTP，灭菌重蒸水，琼脂糖，1xTAE电泳缓冲液，6xDNA点样缓冲液仪器；PCR仪，微波炉，电泳仪，离心机，制冰机，电子天平，微量移液器。
实验步骤：1.标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 10μl4种dNTP混合物 200μl引物 10～100μl模板DNA 0.1～2μgTaq DNA聚合酶 2.5 μlMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水 100 μl2.将反应混合物于离心机上轻甩混匀。
3.在PCR仪上进行PCR反应4.程序完成后，取5uL于1%琼脂糖凝胶上进行电泳。
限制性内切酶酶切反应的标准操作规程
限制性内切酶酶切反应的标准操作规程（编号：007）1、目的及适用范围利用限制性内切酶在特异性的识别位点上或附近切割双链DNA分子，用于特定基因的克隆等分子生物学研究。
2、主要试剂及仪器微量移液器、恒温水浴锅、限制性内切酶 EcoR I, BamH I 等、通用缓冲液10× Buffer3、操作步骤按顺序加入下列反应物，放入37℃水浴锅内反应2h。
反应物体积（μL）灭菌水3DNA4010× Buffer K 5EcoR I1BamH I1总体积504、问题向导4.1 建立一个标准的酶切反应：目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。
通常，一个50μL的反应体系中，1μL的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1h即可降解1μg已纯化好的DNA。
如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16h）也可完全反应。
4.2 选择正确的酶：选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。
识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。
假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。
内切酶的产物可以是粘端的（3\'或5\'突出端），也可以是平端的片段。
粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。
4.3 内切酶：内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。
酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。
酶的用量视在底物上的切割频率而定。
例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。
21。
ecori名词解释
"ECORI"是一个生物学中常用的术语，它代表了一种特定的酶。
ECORI是一种限制性内切酶（restriction endonuclease），也被称为EcoRI酶。
限制性内切酶是一类能够识别DNA分子中特定的核酸序列，并在该序列上切割DNA链的酶。
ECORI 酶属于E. coli（大肠杆菌）中发现的一类限制性内切酶。
ECORI酶的作用是识别并切割DNA中的G/AATTC序列，切割后产生两个黏性末端（sticky ends），这些末端具有未配对的碱基，可以与其他DNA分子的相应末端互相结合。
ECORI酶的活性可用于DNA重组、DNA克隆等分子生物学技术中。
ECORI酶在分子生物学研究和实验室操作中被广泛使用，它是一种常见而重要的限制性内切酶，有助于DNA分析、基因工程和遗传学研究等领域的进展。
酶切鉴定-BamHI and EcoRI
注意事项
1. 直接在抽提的质粒 直接在抽提的质粒DNA管中加入酶切体系。 管中加入酶切体系。 管中加入酶切体系 2. 为使微量操作更精确，可以4个人（8 tubes）一起做 为使微量操作更精确，可以 个人 个人（ ）一起做9 体系混合液，然后再分装10ul于各质粒管中。 于各质粒管中。 份酶切 体系混合液，然后再分装 于各质粒管中 3. 上样时要小心操作，防止样品溢出。 上样时要小心操作，防止样品溢出。 4. 接触凝胶时，因其中含有EB或荧光染料，要戴手套， 接触凝胶时，因其中含有 或荧光染料 要戴手套， 或荧光染料， 废物丢弃要在固定位置。不接触凝胶时不需戴手套！ 废物丢弃要在固定位置。不接触凝胶时不需戴手套！ 5. EB是极强致癌物！小心！ 是极强致癌物！小心！ 是极强致癌物
限制性内切 酶切割DNA 酶切割
A: Strategy of construction
f1 ori Ampr pGEX Vector (4900 bp)
BamH I EcoR I
B: The product of PCR
1 2 3
4900 bp
X-gene cDNA
Primer1
740 bp
Primer2
体积（ ） 体积（µl） 10 2 1 1 1 5 20
酶切一小时后，每管加入 酶切一小时后，每管加入5 ul的6xloading 的 buffer，中止反应，混匀。 ，中止反应，混匀。 20~25 ul上样，在一个泳道中加入 ul DNA 上样， 上样 在一个泳道中加入10 Marker。 。
核酸电泳 根据核酸的解离性质， 根据核酸的解离性质，用中性或偏碱性的缓冲液使核 酸解离成阴离子，置于电场中便向阳极移动， 酸解离成阴离子，置于电场中便向阳极移动，这就是 电泳。 电泳。 凝胶电泳有许多优点：简单、快速、灵敏、成本低。 凝胶电泳有许多优点：简单、快速、灵敏、成本低。 常用的凝胶电泳有琼脂糖 琼脂糖(agarose)凝胶电泳和聚丙烯 凝胶电泳和 常用的凝胶电泳有琼脂糖 凝胶电泳 酰胺(poly-acrylamide)凝胶电泳。可以在水平或垂直 凝胶电泳。 酰胺 凝胶电泳 的电泳槽中进行。 的电泳槽中进行。凝胶电泳兼分子筛和电泳双重效 果，所以分离效率很高。 所以分离效率很高。
限制性内切酶分类指南
30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。
细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种"限制"病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。
首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I 和EcoR II，以及来源于Heamophilus influenzae的Hind II和Hind III。
这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。
研究者很快发现内切酶是研究限制性内切酶的主要功能是保护细菌不受噬菌体的感染，这一观点已被人们广泛接受。
它们作为微生物免疫机制的一部分行使其功能。
当一个没有限制性内切酶的细菌被病毒感染时，大部分病毒颗粒都能成功地进行感染。
然而一个有限制性内切酶的同种细菌被成功感染的比率显著下降。
出现更多的限制性内切酶将会起到多重保护作用;而一个拥有4到5种各自独立的限制性内切酶将会使细胞坚不可摧。
限制性内切酶常常伴随一到两种修饰酶(甲基化酶)出现。
后者的作用是保护细胞自身的DNA 不被限制性内切酶破坏。
修饰酶识别的位点与相应的限制性内切酶相同，但只甲基化每条链中的一个碱基，而不是切开DNA链。
限制性内切酶识别位点处的甲基基团伸入到双螺旋的大沟中去，阻碍了限制性内切酶的作用。
这样，限制性内切酶和它的"搭档"--甲基化酶一起就构成了限制-修饰(R-M)系统。
在一些R-M系统中，限制性内切酶和修饰酶是两种不同的蛋白，它们各自独立行使自己的功能;而在另一些系统中，两种功能由同一种限制-修饰酶的不同亚基，或是同一亚基的不同结构域来执行。
传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。
然而，蛋白测序的结果表明，限制性内切酶的变化多种多样，若从分子水平上分类，则应当远远不止这三种。
I型限制性内切酶是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多个亚基的蛋白复合体。
EcoRI限制性内切酶的
什么是黏性末端？为什么叫黏性末端？ 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带
有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对， 这样的切口叫黏性末端。
DNA连接酶——“分子缝合针”
1. 常用种类 2. 作用：
E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
形成磷酸二酯键 E.coli DNA连接酶
E.coli DNA连接酶把黏性末端之间的缝隙 “缝合” 起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一 个重组的DNA分子就形成了。
SmaI限制酶的作用特点是什么？
什么Байду номын сангаас平末端？
当限制酶从识别序列的中心轴线处切 开时，切开的DNA两条单链的切口，是 平整的，这样的切口叫平末端。
常见限制性内切酶识别序列
常见限制性内切酶识别序列(酶切位点)（BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等）Time：2009-10-22 PM 15:38Author:bioer Hits: 7681 times在分子克隆实验中，限制性内切酶是必不可少的工具酶。
无论是构建克隆载体还是表达载体，要根据载体选择合适的内切酶（当然，使用T 载就不必考虑了）。
先将引物设计好，然后添加酶切识别序列到引物5' 端。
常用的内切酶比如BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等可能你都已经记住了它们的识别序列，不过为了保险起见，还是得查证一下。
下面是一些常用的II型内切酶的识别序列，仅供参考。
先介绍一下什么是II型内切酶吧。
The Type II restriction systems typically contain individual restriction enzymes and modification enzymes encoded by separate genes. The Type II restriction enzymes typically recognize specific DNA sequences and cleave at constant positions at or close to that sequence to produce 5-phosphates and 3-hydroxyls. Usually they require Mg 2+ ions as a cofactor, although some have more exotic requirements. The methyltransferases usually recognize the same sequence although some are more promiscuous. Three types of DNA methyltransferases have been found as part of Type II R-M systems forming either C5-methylcytosine, N4-methylcytosine or N6-methyladenine.酶类型识别序列ApaIType II restrictionenzyme5'GGGCC^C 3'BamHIType II restrictionenzyme5' G^GATCC 3'BglIIType II restrictionenzyme5' A^GATCT 3'EcoRIType II restrictionenzyme5' G^AATTC 3'HindIIIType II restrictionenzyme5' A^AGCTT 3'KpnIType II restrictionenzyme5' GGTAC^C 3'NcoIType II restrictionenzyme5' C^CATGG 3'NdeIType II restrictionenzyme5' CA^TATG 3'NheIType II restrictionenzyme5' G^CTAGC 3'NotIType II restrictionenzyme5' GC^GGCCGC 3'SacIType II restrictionenzyme5' GAGCT^C 3'SalIType II restrictionenzyme5' G^TCGAC 3'SphIType II restrictionenzyme5' GCATG^C 3'XbaIType II restrictionenzyme5' T^CTAGA 3'XhoIType II restrictionenzyme5' C^TCGAG 3'要查找更多内切酶的识别序列，你还可以选择下面几种方法：1. 查你所使用的内切酶的公司的目录或者网站；2. 用软件如：Primer Premier5.0或Bioedit等，这些软件均提供了内切酶识别序列的信息；3. 推荐到NEB的REBASE数据库去查（网址：/rebase/rebase.html）当你设计好引物，添加上了内切酶识别序列，下一步或许是添加保护碱基了，可以参考：NEB公司网站提供的关于设计PCR引物保护碱基参考表下载（也可见图片）双酶切buffer的选择（MBI、罗氏、NEB、Promega、Takara）再给大家推荐一种新的不需要连接反应的分子克隆方法，优点包括：①设计引物不必考虑选择什么酶切位点；②不必考虑保护碱基的问题；③不必每次都选择合适的酶来酶切质粒制备载体；④而且不需要DNA连接酶；⑤假阳性几率低（因为没有连接反应这一步，载体自连的问题没有了）。
限制性内切酶的说明
限制酶使用说明一、分类目前，已被发现的限制酶，根据其反应的必须因子和切断点等特性，被分为以下三大类：类别反应必须因子切点酶例 I 型 s-腺苷基蛋氨酸、ATP、Mg2+识别部位和切点不同，切断部位不定Eco B、Eco KII 型 Mg2+切断识别部位或其附近的特定部位Eco R I、Bam H I III 型 ATP、Mg2+识别部位和切点不同，但切断特定部位Eco P I、Hin f III 应用于基因工程研究用的限制酶，一般全是II型酶，现在市场上销售的酶都属于II型酶, 这些限制酶由于其反应条件和底物DNA种类的不同，其切断状况及出现Star活性的频率等各有不同，并且其程度也根据酶的不同而千差万别。
因而在使用限制酶时，必须对这些要素充分注意，确保目标序列的切断反应能顺利进行，下面具体介绍一下使用限制酶时的一些注意点。
二、注意事项1. 甲基化的影响从带有DNA甲基化酶基因的宿主菌中制备的DNA，其碱基的一部分已经被甲基化，因此即便使用能够识别、切断被甲基化部分的序列的限制酶，也几乎无法切断被甲基化的部分。
被甲基化的部位，根据底物DNA及宿主种类的不同而不同。
例如宿主菌为大肠杆菌的情况下，根据宿主的种类有以下两种情况：在进行转化时，通常使用的菌株为C600、HB101、JM109等，因为都带有dam、dcm甲基化酶，所以使用这些菌株制备的DNA时，必须注意。
另外，动物由来的DNA，CG序列多为5m CG；植物由来的DNA，CG及CNG序列多为5m CG和5m CNG。
2. Star活性限制酶在一些特定条件下使用时，对于底物DNA的特异性可能降低。
即可以把与原来识别的特定的DNA序列不同的碱基序列切断，这个现象叫Star活性。
Star活性出现的频率，根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同，可以说几乎所有的限制酶都具有Star活性。
并且，它们除了识别序列的范围增大之外，还发现了在DNA的一条链上加入切口的单链切口活性，所以为了极力抑制Star活性，一般情况下，即使会降低反应性能，我们也提倡在低甘油浓度、中性pH、高盐浓度条件下进行反应。
DNA 的限制性内切酶酶切分析
观察酶切后与未酶切质粒的DNA带位置。
100bp DNA Marker 未酶切质粒
已酶切质 粒
点样孔
3000bp 1500bp 1000bp
500bp
2.96kp 1.9kp
注意事项
1. 第一步确保样品加到反应体系中,若有粘壁，用掌型离心机离 心到底部!
EcoR I
Bcl-2 (1.9kb)
操作步骤（改动）
1.酶切:
20ul反应体系
组分
加入体积
灭菌双蒸水
11ul
10×buffer H(含BSA） 2ul
质粒DNA
5ul
10U/ul EcoRI 2ul
掌型离心机混匀，37℃水浴反应1h
2.制胶(0.8%)：称取0.48g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1×TAE缓 冲液60ml，微波炉加热至沸腾，摇匀，至无颗粒。
3.倒胶：胶冷却至60℃左右(不烫手)，缓缓倒入电泳槽 (先胶布 封口，放好梳子)。 4.点样：1 ul含SYBR Green I的载样buffer
+5ul酶切产物 或+5ul 未酶切的质粒, 混匀。 （点样孔置负极端）
5.电泳：稳压条件下90V电泳，待染料(指示过5V/cm胶长度）
6.电泳时电场强度不超过5V/cm胶长
思考题：
1. DNA的纯度会不会影响酶切产物的质量？如果会，请 说明原因。
2. 比较本实验酶切后与未酶切质粒的电泳图谱，综合前 两个实验，分析可能的原因
2. 当样品在37℃ 水浴时，要盖紧盖子，否则水汽进入管内，使 反应体积大大增加，造成酶切失败
3. RE一定要在低温(－20℃)下贮存(含50％甘油) ，每次吸取后 应放在冰盒，用完后立即放在-20℃，新购的大包装酶应先分装
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶:是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
限制性核酸内切酶的分类:根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型(Type I)、第二型(Type II)及第三型(Type III)。
第一型限制酶同时具有修饰(modification)及认知切割(restriction)的作用;另有认知(recognize)DNA上特定碱基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距离认知位(recognition site)可达数千个碱基之远,并不能准确定位切割位点，所以并不常用。
例如:EcoB、EcoK。
第二型限制酶只具有认知切割的作用，修饰作用由其他酵素进行。
所认知的位置多为短的回文序列(palindrome sequence);所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。
是遗传工程上，实用性较高的限制酶种类。
例如:EcoRI、HindIII。
第三型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。
可认知短的不对称序列，切割位与认知序列约距24-26个碱基对，并不能准确定位切割位点，所以并不常用。
例如:EcoPI、HinfIII。
限制酶在遗传学方面的应用:1、在甚因工程方面利用能产生“粘性末端” 的限制酶, 进行DNA的体外重组, 是较为方便的, 只要用同一限制酶处理不同来源的DNA, 由于所产生的水解片段具有相同的粘性末端, 可以彼此“粘合”,再经连接酶处理, 就成为重组DNA分子了. 目前, 基因工程上, 限制酶主要应用于以下两方面?(1)目的基因与载体的重组细菌细胞中的限制酶能水解外源DNA , 因此必须通过适当的载体(质粒或噬菌体)的帮助才能将外源DNA引人受体细胞并在其中增殖和表达。
将供体DNA与载体用同样的限制酶处理, 使载体带上各种各样的外源DNA片断, 然后引人受体细菌细胞增殖, 菌细胞增殖, 再筛选出所需的菌株, 便获得带有某一目的基因的繁殖系.用这种方法, 已成功地将酵母菌的咪哇甘油磷酸脱水酶基因、夕一异丙基苹果酸脱氢酶基因和色氨酸合成酶基因通过几噬菌体转人大肠杆菌,并表达了信息.(2)建造新的基因载体作为基因载体,在引人受体细胞后, 必须有较高的复制率, 以求获得大量的基因产物;必须具备一个选择性标志, 以便筛选;还要有一至多种限制酶的作用位点(每种酶只有一个切口);也要求使用安全。
ECoRI限制性内切酶的使用
5
0
1
1
1
1
1
Protocol for Fast Digestion of Different DNA
1. Combine the following reaction components at room temperature in the order indicated:
Water, nuclease-free (#R0581) 10X FastDigest® or 10X FastDigest® Green Buffer DNA FastDigest® enzyme Total volume: Plasmid DNA 15 µl 2 µl 2 µl (up to 1 µg) 1 µl 20 µl PCR product 17 µl 2 µl 10 µl (~0.2 µg) 1 µl 30 µl Genomic DNA 30 µl 5 µl 10 µl (5 µg) 5 µl 50 µl
Description
FastDigest® enzymes are an advanced line of restriction enzymes for rapid DNA digestion. All FastDigest® enzymes are 100% active in the universal FastDigest® and FastDigest® Green buffers and are able to digest DNA in 5-15 minutes. This enables any combination of restriction enzymes to work simultaneously in one reaction tube and eliminates the need for sequential digestions. FastDigest® enzymes can be used to digest plasmid, genomic and viral DNA as well as PCR products and do not show star activity even in prolonged incubations. Enzymes used in common downstream applications such as ligation, blunting and dephosphorylation reactions also have 100% activity in FastDigest® and FastDigest® Green Buffer. FastDigest® Green Buffer includes a density reagent along with blue and yellow tracking dyes that allow for direct loading of the reaction mixtures on a gel. The blue dye of the FastDigest® Green Buffer migrates with 3-5 kb DNA fragments in a 1% agarose gel and has an excitation peak at 424 nm. The yellow dye of the FastDigest® Green Buffer migrates faster than 10 bp DNA fragments in a 1% agarose gel and has an excitation peak at 615 nm. For applications that require analysis by fluorescence excitation FastDigest® Buffer is recommended, as the dyes of the FastDigest® Green Buffer may interfere with some fluorescence measurements.
EcoR I限制性内切酶
Eco R IG A A T T CC T T A A GTaKaRa Code：D1040A包 装 量：4,000 Units附带试剂： 10×H Buffer 500 μl10×Loading Buffer 500 μl纯 度：1） Overdigestion Test：≥12 Units2） Ligation-Recutting Test：Ligation Effi.：100%,Recutting Effi.：100%3） pKF3 Cloning Test：＜2%●酶贮存液：10 mM Tris-HCl, pH7.5100 mM KCl0.1 mM EDTA1 mM DTT0.01 % BSA0.15 % TritonX-10050 % Glycerol●起 源：Escherichia coli RY13●一般反应体系：Eco R I 1 μl10×H Buffer 2 μlDNA ≤1 μg灭菌水 up to 20 μl●反应温度：37℃●反应时间：在上述20 μl的反应体系中，37℃反应5分钟可以完全切断λDNA，满足各种实验需求。
针对特殊酶切底物DNA，如果得不到良好的酶切效果时，可以将反应时间延长至1小时。
●活性确认：在50 μl反应液中，37℃温度下反应1小时，将1 μg的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
●纯度检测：1） Overdigestion Test：在1 μg DNA中加入过量的该限制酶，进行长时间（24小时）酶切反应，然后进行琼脂糖电泳，确认切出的DNA片段的电泳谱带不发生变化。
2） Ligation-Recutting Test：在经过10倍量该酶切出的DNA片段中，加入 T4 DNA Ligase，使其连接，然后再使用该酶进行切断反应，判断Ligation-Recutting效率。
3） pKF3 Enforcement Cloning Test：使用10倍量的该酶，将Enforcement Cloning Vector pKF3 DNA切开，然后再进行连接后，转化至TH2感受态细胞中，判断该酶切位点受到影响的重组体所占的比率。
影响限制性内切酶活性的因素
识别位点
绝大多数的II型核酸内切限制酶，都能够识 别由4～8个核苷酸组成的特定的核苷酸序 列。我们称这样的序列为核酸内切限制酶 的识别序列。而限制酶就是从其识别序列 内切割DNA分子的，因此识别序列又称为 核酸内切限制酶的切割位点或靶序列。
1）有些识别序列是连续的(如GATC)， 2）有些识别序列则是间断的(如GANTC)，N
在“非最适的”反应条件下(包括高浓度的核酸内切限制酶、 高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH 值等等)，有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生 “松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割 DNA分子。
有些核酸内切限制酶的切割特异性，受所用的缓冲液成份的 影响比较明显。例如，最常用的EcoRI限制酶，在正常的 情况下，是在G AATTC识别序列处发生切割作用的，但 如果缓冲液中的甘油浓度超过5％(V／V)，那么其识别序 列的特异性就会发生松动，可在AATT或PuPuATPyPy序 列处发生切割作用。EcoRI限制酶的这种特殊的识别能力， 通常叫做星号活性，以EcoRI*表示。
基因工程突出的优点
• 打破了常规育种难以突破的物种之间的界限 可以使原核生物与真核生物之间的遗传信 息进行相互重组和转移 可以使动物与植物之间的遗传信息进行相 互重组和转移 可以使人与其他生物间的遗传信息进行相 互重组和转移
基因工程的主要理论依据
不同基因具有相同的遗传物质(DNA/RNA) 基因是可以从DNA上切割下来的 基因是可以转移的 多肽与基因之间存在对应关系 遗传密码是通用的(绝少数除外) 可以通过DNA复制把遗传信息传递给下一代
酶切消化反应的温度
DNA消化反应的温度，是影响核酸内切限制酶活性的另 一个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有不同的最适 反应温度，而且彼此之间有相当大的变动范围。大多数核 酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃，但也有许多例外 的情况，它们要求37℃以外的其它反应温度。其中有些核 酸内切限制酶的最适反应温度低于标准的37℃，例如 SmaI是25℃、ApaI是30℃；有些核酸内切限制酶的最适 反应温度则高于标准的37℃，例如MaeI是45℃、Bcl I是 50℃、MaelII是55℃；还有些核酸内切限制酶的最适反应 温度可高达60℃以上，消化反应的温度低于或高于最适温 度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至最终导致完全 失活。
限制性内切酶原理
Dam甲基化酶在 GATC 序列中的腺嘌呤上引入
甲基。一些限制酶（如BamHⅠ、BclⅠ、Sau3AⅠ等）
的识别位点中含 GATC 序列。 有些限制酶对Dam甲基化的DNA 敏感，不能切割
相应的序列，如 BclⅠ。有些限制酶对Dam甲基化 的DNA不敏感，如 BamHⅠ、Sau3AⅠ等。
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甲基化酶对限制酶的影响： 1.修饰酶切位点。
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限制酶的发现
30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性 的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制 性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种 “限制”病毒生存的办法则可归功于细胞内部可 摧毁外源DNA的限制性内切酶。首批被发现的限 制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）的Hind II和Hind III。这些酶可 在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片 段。
基因工程中，很多情况下，基因组中靠近目 的基因两侧的碱基并没有合适的酶切位点。怎么 办？ 通常是设计合适的PCR引物，让目的基因在 PCR扩增后，两侧含有酶切位点。 Hsp70A ：Ex-F 5' CGCCA^TATGCCAGCTATCGGAATCGATTTGG 3'
Nde I Hsp70A ：Ex-R 5' GC^GGCCGCATAAAGGTGGGGAGAGCTTACAAC3'
GT↓ATCGAC CATAGC↑TG
BbvCⅠ 的识别切割位点分别为CCTCAGC和GGAGTCG
CC↓TCAGC GGAGT↑CG
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影响限制性酶活性的因素
1) DNA的纯度 2) DNA的甲基化程度 3) 酶切消化反应的温度 4) DNA的分子结构 5) 限制性核酸内切酶的缓冲液 6) Star活性（星活性）
限制性内切酶的发现
酶分子
I类酶
II类酶
三亚基双功能 内切酶与甲基化酶分离
III类酶 二亚基双 能
识别位点 二分非对称序列 4-6bp序列，回文结构 5-7bp非对称序列
切割位点 距识别位点1000bp 在识别位点中或靠识别位点 在识别位点 下游24-26bp
限制性反应 互斥 与甲基化反应
分开反应
同时竟争
限制作用 需要ATP 需要
需要
不需要
五．I类酶，III类酶限制-修饰酶基本特怔
1）I类酶，EcoK，EcoB。 （1）异源多聚体，亚基R.M.S分别具有限制,修饰酶的作用，特
异性位点识别活性。
（2）I类酶与 DNA识别位点结合依赖亚基 M与辅助因子S—腺 苷甲硫氨酸(SAM)相互作用。
（3）S—腺苷甲硫氨酸(SAM)通过变构作用使酶处于活性状态， 酶与 DNA识别位点结合后，根据甲基化状态发挥相应酶的活 性，或限制, 或限修饰，或不限制不限修饰
2） hsdR编码限制性核酸内切酶---识别DNA分子特定位点， 将双链DNA切断。（DNA分子转化细胞：受体细胞去掉 hsdR基因位点）
3） hsdM编码产物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特定位点 的碱基甲基化反应。
4） hsdS表达产物的功能是---协助限制性核酸内Hale Waihona Puke 酶和甲基 化酶，识别特殊的作用位点。
六．甲基化酶的基本特征：
1)Ⅱ类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴， a)限制性内切酶，甲基化酶的识别位点相同，序列内使碱 基甲基化，封闭酶切口。
b)甲基化酶封闭一个限制性内切酶切口同时产生另一种酶 切口。
c) DNA腺嘌呤甲基化酶 Darn DNA胞嘧啶甲基化酶 Dcm
七．酶切图谱示意图
常用限制性内切酶酶切位点保护残基
酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶发布: 2010-05-24 20:19| 来源:生物吧| 编辑:刘浩| 查看: 161 次本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，AflIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。
限制性核酸内切酶
目 录
• 限制性核酸内切酶的概述 • 限制性核酸内切酶的分类 • 限制性核酸内切酶的工作原理 • 限制性核酸内切酶的应用 • 限制性核酸内切酶的未来发展
01
限制性核酸内切酶的概述
定义和特性
定义
限制性核酸内切酶是一类能识别并附着特定的核苷酸序列，并对每条链中特定 部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。
在生物科学领域的应用
基因克隆和DNA重组技 术
限制性核酸内切酶是基因克隆和DNA重组 技术中的关键工具，用于切割和重组DNA 片段。
基因诊断和基因治疗
限制性核酸内切酶可用于检测和纠正基因突变，为 基因诊断和基因治疗提供有效手段。
生物制药和生物技术
限制性核酸内切酶在生物制药和生物技术领 域中用于生产重组蛋白、抗体和治疗性核酸 等生物制品。
双活性酶
02
同时具有切割和磷酸酶活性，如BstAPI。
多活性酶
03
同时具有多种活性，如FokI同时具有切割、磷酸酶和甲基化酶
活性。
03
限制性核酸内切酶的工作原理
识别和切割DNA的过程
识别
限制性核酸内切酶能够识别特定的 DNA序列，通常是4-6个核苷酸组成 的序列。
切割
在识别位点处，限制性核酸内切酶将 DNA链切开，形成两个断开的磷酸二 酯键。
产生黏性末端
限制性核酸内切酶切割DNA后，通常产生具有突出末端的片段，也称为黏性末端 。这种黏性末端可以用于DNA的连接和重组。
04
限制性核酸内切酶的应用
在基因工程中的应用
1 2 3
基因克隆
限制性核酸内切酶能够将DNA分子切割成特定序 列的片段，为基因克隆提供精确的DNA片段。
限制性核酸内切酶和核酸外切酶
核酸外切酶exonuclease核酸外切酶是一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3、5-磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。
其水解的最终产物是单个的核苷酸（DNA为dNTP，RNA为NTP）。
按作用的特性差异可以将其分为单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶。
核酸内切酶endonuclease核酸内切酶是在核酸水解酶中，水解DNA分子链内部磷酸二酯键生成寡/寡聚核苷酸的酶。
限制性核酸酶在原核和真核细胞中都有发现，按其性质可分为三大类。
所谓Ⅰ型的酶要求DNA分子上有特定的识别顺序，但是切点却不在此识别顺序之中，而与之有一定距离。
在反应中,它还要求有ATP和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。
酶由不同的α，β，γ亚基组成。
全酶兼有限制性内切酶的活性和甲基化酶的活性。
Ⅲ型的酶与Ⅰ型的酶有相似特征，只是切点距识别顺序距离是严格的。
Ⅱ型的酶，可说是独立的限制性核酸内切酶。
因为，它并不兼有甲基化酶的活性。
它切断DNA时不需ATP,也不需SAM。
它的切点是严格的，而且就在识别顺序之中。
所认知的位置多为短的回文序列，下面对Ⅱ型酶作进一步的介绍。
常用的限制性核酸酶有EcoRⅠ,HindⅢ,AluⅠ,HaeⅢ等。
EcoRⅠ来自Escherichia coli RY13之酶ⅠHindⅢ来自Haemophilius influenzae Rd之酶ⅢAluⅠ来自Arthrobacter luteus之酶ⅠHaeⅢ来自Haemophilus aegyptius之酶Ⅲ这些酶的识别顺序多数是4或6个碱基对。
有的酶要5或7个甚至更长的识别顺序。
识别顺序短的在DNA分子上出现的几率多，酶可把DNA分子切成较多的小片段。
识别顺序长的则往往只切出少数大片段。
这些酶切片段统称为限制性片段。
根据不同限制性核酸酶在某DNA分子上的切点分布，可以绘出该DNA分子的“限制性图谱”即“酶切图谱”，也称“物理图谱”。
限制性图谱可以反映出一个DNA片段或基因结构的基本特征。
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Eco R I
G A A T T C
C T T A A G
TaKaRa Code：D1040A
包 装 量：4,000 Units
附带试剂： 10×H Buffer 500 μl
10×Loading Buffer 500 μl
纯 度：
1） Overdigestion Test：≥12 Units
2） Ligation-Recutting Test：
Ligation Effi.：100%,Recutting Effi.：100%
3） pKF3 Cloning Test：＜2%
●酶贮存液：
10 mM Tris-HCl, pH7.5
100 mM KCl
0.1 mM EDTA
1 mM DTT
0.01 % BSA
0.15 % TritonX-100
50 % Glycerol
●起 源：Escherichia coli RY13
●一般反应体系：
Eco R I 1 μl
10×H Buffer 2 μl
DNA ≤1 μg
灭菌水 up to 20 μl
●反应温度：37℃
●反应时间：
在上述20 μl的反应体系中，37℃反应5分钟可以完全切断λDNA，满足各种实验需求。
针对特殊酶切底物DNA，如果得不到良好的酶切效果时，可以将反应时间延长至1小时。
●活性确认：
在50 μl反应液中，37℃温度下反应1小时，将1 μg的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。
●纯度检测：
1） Overdigestion Test：在1 μg DNA中加入过量的该限制酶，进行长时间（24小时）酶切反应，然后进行琼脂糖电泳，确认切出的DNA片段的电泳谱带不发生变化。
2） Ligation-Recutting Test：在经过10倍量该酶切出的DNA片段中，加入 T4 DNA Ligase，使其连接，然后再使用该酶进行切断反应，判断Ligation-Recutting效率。
3） pKF3 Enforcement Cloning Test：使用10倍量的该酶，将Enforcement Cloning Vector pKF3 DNA切开，然后再进行连接后，转化至TH2感受态细胞中，判断该酶切位点受到影响的重组体所占的比率。
●在各种Universal Buffer中的相对活性：
L M H K T（+BSA）相对活性(%)(20)(100) 100 (120) (80)
●各种DNA的切断数：
●甲基化的影响：
根据识别序列后续碱基的不同，有时受CG methylase影响。
●Star活性：
高甘油浓度、Mn2+存在、低离子强度条件下，识别序列会发生变化。
如果在反应液中添加Spermine （0.2 mM左右），活性降低20～30%，但可以抑制30～50%的Star活性。
●Basal Buffer组成：
100 mM Tris-HCl, pH7.5
7 mM MgCl2
50 mM NaCl
7 mM 2-Mercaptoethanol
0.01 % BSA
●Universal Buffer组成（-20℃保存）：
1.10 × L 100 mM Tris-HCl,pH7.5 4.10 × K 200 mM Tris-HCl,pH8.5
100 mM MgCl2100 mM MgCl2
10 mM Dithiothreitol 10 mM Dithiothreitol 2.10 × M 100 mM Tris-HCl,pH7.5 1,000 mM KCl
100 mM MgCl2 5.10 × T 330 mM Tris-Ac,pH7.9
10 mM Dithiothreitol (BSA 100 mM Mg-Ac
500 mM NaCl －Free) 5 mM Dithiothreitol 3.10 × H 500 mM Tris-HCl,pH7.5 660 mM K-Ac
100 mM MgCl2 6. 0.1% BSA
10 mM Dithiothreitol 7. 0.1% Triton X-100
1,000 mM NaCl
●10×Loading Buffer组成
（开封后室温保存）
0.9% SDS
50% Glycerol
0.05% Bromophenol Blue
使用时添加反应液量的1/10，即可停止反应，进行电泳。
-20℃保存时，会出现SDS沉淀，请于温水浴中溶解后使用。
在室温下保存时，SDS有时也会出现沉淀，此时同样请在温水浴中溶解后使用。
λ Ad2SVφX pBR pUC pUC M13Col
40174322 19 119 mp18E1
5 5 1 0 1 1 1 1 1
V2010.10。