人参皂苷生物合成和次生代谢工程

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８］参皂苷为“ 椅－椅－椅” 式构型［。根据三萜苷元骨架
４５０单加氧酶的催化下形成达玛烷型皂苷细胞色素Ｐ三萜苷元—原人参二醇（Ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ），原人参二醇在Ｐ４５０的催化下转变为原人参三醇（Ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｔｒｉｏｌ）。因此，推测至少有两个Ｐ４５０参与
中图分类号Ｑ８１９人参皂苷（ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ）是五加科（Ａｒａｌｉａｃｅａｅ）植物人参（Ｐａｎａｘｇｉｎｓｅｎｇ）和西洋参（Ｐａｎａｘｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ）的
１．２三萜碳环骨架的合成途径从活性ＤＭＡＰＰ作为起始单位，通过烯丙基转移酶（ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）和萜类环化酶的催化生成达玛烷型和齐墩果酸型碳环骨架（图２）。烯丙基转移酶（ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）催化两个底物分子间Ｃ－Ｃ键的形ＰＰ双键富含电成，特点是底物分子的碳阳离子结合到Ｉ子的碳原子上。烯丙基转移酶包括ＧＰＰ合成酶、ＦＰＰ合成酶和ＧＧＰＰ合成酶，差别在于丙烯基底物长度不同（图２）。在牦牛儿基焦磷酸合成酶（ＧＰＰＳ）的作用下，Ｃ５骨架ＤＭＡＰＰ和异构体ＩＰＰ以头－尾方式缩合生成Ｃ ?牛１０
２＋（ＨＭＧＣｏＡ），上述反应需要Ｆｅ和质体醌（ｑｕｉｎｏｎｅ）的３］协助完成［（图１）。在ＮＡＤＰＨ的协助下，３羟基３甲
４０余种，然而作为人参皂苷的主要来源，人参、西洋参１５年的生长栽培阶段，生产上由于连作障碍需要４～和病虫害的困扰，其品质及其生长环境受到严重限制；同时，具有独特药理活性的人参皂苷含量稀少，如Ｒｇ３、Ｒｂ２、Ｒｈ２等抗癌成分含量甚微
［１５］
合成的调控作用。通过构建转基因人参不定根来上调ＳＳ）基因的表达，结果所有的下游基因表鲨烯合成酶（达都得到了上调。本实验室采用以转录组分析为主的方法已成功克隆了西洋参和人参中３羟基３甲基戊二法呢基焦磷酸合成酶、鲨烯合成酶、酰辅酶Ａ还原酶、鲨烯环氧酶、达玛烷合成酶、香树酯合成酶以及Ｐ４５０ β 和糖基转移酶的候选基因，并且建立了基因表达与鉴定体系，相关基因的鉴定与外源表达正在进行中，为阐明人参皂苷合成酶的基因表达与调控机制奠定了基
［２］
。近年来，植物次生
代谢工程发展迅速，应用分子生物学和基因工程方法，在微生物中重建药用次生代谢物生物合成途径已有初步的研究和实践。随着三萜皂苷生物合成途径及其关键酶的研究不断取得进展，为通过次生代谢工程手段生产稀有人参皂苷奠定了基础。深入揭示人参皂苷的生物合成途径，构建适宜的微生物表达体系，对大规模工业化生产人参皂苷具有重要意义，鉴于缺乏相关报道，本文综述了人参皂苷生物合成途径及其关键酶基因研究的最新进展，并探讨了人参皂苷生物合成的前景。
基戊二酰辅酶Ａ还原酶（ＨＭＧＲ）催化ＨＭＧＣｏＡ生成６碳中间体甲羟戊酸（ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ，ＭＶＡ），这一步是ＭＶＡ途径中的第一个关键步骤。在ＡＴＰ的存在下，甲羟戊酸激酶（ＭＶＫ）和磷酸甲羟戊酸激酶（ＰＭＫ）依次催化ＭＶＡ生成磷酸甲羟戊酸（ｍｅｖａｌｏｎａｔｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＭＶＡＰ）和焦磷酸甲羟戊酸（ｍｅｖａｌｏｎａｔｅｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＭＶＡＰＰ）。焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶（ＭＶＤ）催化ＭＶＡＰＰ脱羧形成异戊烯焦磷酸（ＩＰＰ），然后在异戊烯焦磷酸异构酶（ＩＤＩ）的催化下，将Ｃ２的质子转移到Ｃ
７，９，１４］的羟基发生糖基化［。
。在三萜类
图３２，３氧化鲨烯到达玛烷型和齐墩果酸型人参皂苷的合成途径
（虚线代表推断的途径）
Ｆｉｇ．３Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐａｔｈｗａｙｆｒｏｍ２，３ｏｘｉｄｏｓｑｕａｌｅｎｅｔｏｄａｍｍａｒａｎｅａｎｄｏｌｅａｎａｎｅｔｙｐｅｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅｓ
图２从ＩＰＰ到２，３氧化鲨烯的合成途径Ｆｉｇ．２ＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐａｔｈｗａｙｆｒｏｍＩＰＰｔｏ２，３ｏｘｉｄｏｓｑｕａｌｅｎｅ
１．３达玛烷型和齐墩果酸型人参皂苷的合成途径２，３氧化鲨烯的环化是三萜皂苷与甾醇生物合成ＯＳＣｓ）催的分支点，这一步由环氧角鲨烯环化酶（化
２００９，２９（１０）
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
吴琼等：人参皂苷生物合成和次生代谢工程
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图１甲羟戊酸途径中ＩＰＰ和ＤＭＡＰＰ的生物合成Ｆｉｇ．１ＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＩＰＰａｎｄＤＭＡＰＰｉｎｍｅｖａｌｏｎａｔｅｐａｔｈｗａｙ
ＧＰＰ）；ＧＰＰ与第二个ＩＰＰ在法呢基焦磷酸儿基焦磷酸（合成酶（ＦＰＰＳ）作用下缩合生成Ｃ１５法呢基焦磷酸（ＦＰＰ）；ＦＰＰ与第三个ＩＰＰ缩合生成Ｃ２０? 牛儿基 ? 牛
［４］儿基焦磷酸（ＧＧＰＰ）。两分子ＦＰＰ头－头还原偶联
（ｄａｓｈｅｄｌｉｎｅｓｒｅｐｒｅｓｅｎｔｐｒｏｐｏｓｅｄｐａｔｈｗａｙ）
２人参皂苷生物合成途径中的关键酶
人参皂苷生物合成途径中约包括２０余步连续的酶促反应，其中关键酶有３羟基３甲基戊二酰辅酶Ａ还原酶（ＨＭＧＲ），法呢基焦磷酸合成酶（ＦＰＰＳ），角鲨烯合成酶（ＳＳ），鲨烯环氧酶（ＳＥ），达玛烷合酶（ＤＳ），香 β ＡＳ），Ｐ４５０和糖基转移酶（ＧＴ）。关键树酯合成酶（ β 酶基因的研究近年也有陆续的报道。罗志勇等
Ｖｏｌ．２９Ｎｏ．１０２００９
达玛烷型皂苷的苷元形成。在糖基转移酶的作用下，一个或几个单糖添加到原人参二醇和原人参三醇苷元上，形成不同种类的达玛烷型人参皂苷
［７，９］
３和Ｃ２０苷元生物合成皂苷时，原人参二醇型骨架Ｃ的羟基发生了糖基化，而原人参三醇则是Ｃ６和Ｃ２０
［７～９］
香树酯合成酶（ＡＳ，ａｍｙｒｉｎ生物合成途径， β β β ，ＥＣ５．４．９９．）催化２，３氧化鲨烯生成齐墩果ｓｙｎｔｈａｓｅ酸型皂苷（ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅＲ）苷元—β 香树酯（ａｍｙｒｉｎ）， β ｏ并进一步在糖基转移酶（Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）的作用下生成人参皂苷Ｒ；２，３氧化鲨烯在达玛烷合酶（ＤＳ，ｏＤａｍｍａｒｅｎｅｄｉｏｌＩＩｓｙｎｔｈａｓｅ，ＥＣ４．２．１．Ｂ２）的催化下生
１］。迄今为止已经发现的人参皂苷约有主要活性成分［
作为原初供体，经过甲羟戊酸（Ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ）中间物合成异戊烯焦磷酸（ＩＰＰ）和二甲基烯丙基焦磷酸（ＤＭＡＰＰ）；（２）通过烯丙基转移酶（ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）和萜类环化酶的催化合成２，３氧化鲨烯；（３）２，３氧化鲨烯依次经过环化、羟基化、糖基化对三萜碳环骨架进行复杂修饰，最终形成达玛烷型和齐墩果酸型人参皂苷。１．１ＩＰＰ和ＤＭＡＰＰ的合成首先两分子乙酰辅酶Ａ在乙酰辅酶Ａ酰基转移酶（ＡＡＣＴ）催化下缩合生成乙酰乙酰辅酶Ａ（ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌＣｏＡ），随后在ＨＭＧＣｏＡ合成酶（ＨＭＧＳ）化下继续与一分子乙酰辅酶Ａ缩合形成３羟基３甲基戊二酰辅酶Ａ
［４］４形成活性异构体二甲基烯丙基焦磷酸（ＤＭＡＰＰ）。
１人参皂苷的生物合成途径
作为植物萜类化合物，人参皂苷生物合成途径一般可划分为三个阶段：（１）以糖酵解产物乙酰辅酶Ａ
收稿日期：２００９０６０８修回日期：２００９０８０７３０８７３４５９）资助项目国家自然科学基金（电子信箱：ｓｌｃｈｅｎ＠ｉｍｐｌａｄ．ａｃ．ｃｎ通讯作者，
摘要人参皂苷属于植物三萜皂苷类化合物，是传统名贵药材人参和西洋参的主要活性成分，具，有抗炎、抗氧化作用，还有广泛的抗肿瘤作用。人参皂苷与植物甾醇共享前期代谢途径，通过２３氧化鲨烯环化步骤进入三萜代谢分支途径，在三萜碳环骨架复杂修饰的基础上形成人参皂苷。综述了近年人参皂苷生物合成途径及关键酶基因研究的最新进展，揭示了人参皂苷生物合成的基本途径，对途径中关键酶的基因进行了综述，并结合次生代谢工程技术，探讨了该技术在人参皂苷生物合成中的应用前景。关键词人参皂苷生物合成关键酶代谢工程
的不同，人参皂苷有达玛烷型（ｄａｍｍａｒａｎｅｔｙｐｅ）和齐墩果酸型（ｏｌｅａｎａｎｅｔｙｐｅ）两类，前者在含量和结构多样性上均超过后者。图３显示了目前较为接受的人参皂苷
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中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（１０）：１０２～１０８
人参皂苷生物合成和次生代谢工程
吴琼周应群孙超陈士林（中国医学科学院／北京协和医学院药用植物研究所北京１０００１９３）
［９，１１～１３］成达玛烯二醇（ｄａｍｍａｒｅｎｅｄｉｏｌ）。达玛烯二醇在
。环氧角鲨烯环化酶构成多基因家族，由环氧角
［５，１０］
００多种不同骨架的三萜化合物，不鲨烯环化可产生１同三萜化合物具有不同立体构型的选择。作为主
式构型，而人要代谢产物的植物甾醇为“ 椅－船－椅”
生成Ｃ骨架的角鲨烯（ｓｑｕａｌｅｎｅ），这是由角鲨烯合成３０ＳＳ）催化的分子内环化反应，它的作用方式与烯丙酶（先基转移酶不同，它不是头－尾相接而是头－头相接，形成一个环丙基中间产物（前角鲨烯），然后再转化成
５，６］Ｃ产物［。鲨烯环氧酶（ＳＥ）催化角鲨烯形成２，３３０５］氧化鲨烯［。