蛋白酶活性检验方法

蛋白酶活性检验方法

1 定义

1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和P H值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/ mL）表示。

2 福林法（第一法）

2、1 原理

蛋白酶在一珲的温度与P H条件下，水解底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光度法测定，计算其酶活力。

2、2 试剂和溶液

2、2、1 福林试剂的制备

于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2Wo4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g、水700mL、85％磷酸50mL、浓盐酸100mL，水火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（Li2SO4）50g、水50mL和数滴浓溴水（99％），再微沸15min，以除去多余的溴（冷后人有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，见水定溶至1000ml。混匀，过滤。制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。

使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。

2、2、2 碳酸钠溶液c（Na2CO3）＝0.4mol/L

称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2、2、3 三氯乙酸c（CCl3·COOH）=0.4mol/L

称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2、2、4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L

按GB601配制。

2、2、5 盐酸溶液c（HCI）＝1 mol/L及0.1 mol/L

按GB601配制。

2、2、6 缓冲溶液

a、磷酸缓冲液（P H＝7.5）适用于中性蛋白酶

称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

b、乳酸缓冲液（P H＝3.0）适用于酸性蛋白酶

甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。

乙液称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。

c、硼酸缓冲溶液（P H＝10.5）适用于碱性蛋白酶

甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。

乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。

上述各种缓冲溶液，均须用P H计校正。

2、2、7 10g/L酪素3）溶液

称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的各种适宜PH的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中

边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的PH缓冲溶液稀释至刻度。

此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。

注：3）酪素采用上海化学试剂采购供应站经销的试剂。

2、2．8 100ug/mL L－酪氨酸4）标准溶液

a、称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60 mL溶解后

定容至100 mL，即为1mg/ mL酪氨酸标准溶液。

注：4）L－酪氨酸采用上海长江生化制药厂产品。

b、吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－

酪氨酸标准溶液。

2、3 仪器和设备

2、3、1 恒温水浴 40±0.2℃。

2、3、2 分光光度计应符合GB9721的规定。

2、4 分析步骤

4、1 标准曲线的绘制

a、L－酪氨酸标准溶液

按表3配制

b、分别取上述溶液各1.00 mL（须做平等试验），各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00 mL、福林试剂使用溶液1.00 mL，置于40±0.2℃水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）。

根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（ug），即为吸光常数K值。其K值应在95～100范围内。

4、2 测定

（1）待测酶液的制备

a、称取酶粉1～2g，精确至0.0002g（或吸取液体酶1.00 mL），用少量该酶的缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述缓冲如此溶解、捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用缓冲液稀释至适当浓度，供测试用（稀释至被测试液吸光值在0.25～0.40范围内）。

b、酶粉测定时，稀释倍数参考表A4（液体酶亦可参照表A4稀释）。

（2）测定

a、先将酷素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5min；

b、按下列程序操作：

试管A（空白）试管B（酶试样，需作三个平行试样）

加酶液1.00 mL 加酶液1.00 mL

40±0.2℃，2min

加三氯乙酸2.00 mL（摇匀）加酪素1.00mL（摇匀）

40±0.2℃，10min 40±0.2℃，10min

加酪素1.00（摇匀）加三氯乙酸2.00mL（摇匀）

取出静止10min，过滤取出静止10min，过滤