辣根过氧化物酶的提取、纯化以及应用

pH值来自百度文库去除率的影响
pH值对去除率的影响
在pH = 2～8 的范围内
测定了五氯酚在辣根 过氧化物酶和 H2O2 的 作用下的去除率。实
验结果见左图。由图 可见 ,在 pH 值为 4 和 5 时 ,去除率达95 %以 上 ,为最佳 pH 范围。
H2O2 对去除率的影响
H2O2 对去除率的影响
• 采0.0用5m不m同o的l/ LH五2O氯2 酚用进量行与 实验(辣根过氧化物酶是过 量的) ,测定五氯酚的去除 率用量,结为果0见～左0.图025。m当moHl/2OL 2 时 ,五氯酚去除率按比例 上升(也即残余五氯酚浓度 按与比PC例P下有降着)固,表定明的H反2O应2计 量0.0比25。m当moHl/2OL2以达上到时 ,去 除率已达最高 ,说明这时 H2O2 用量已饱和。
• 每个钙原子都是 7供氧配合体 ,它们能同时 与主肽链上含羰基的氨基酸 ,侧链上的 Asp、 Ser和 Thr,以及一个末端结构水分子结合。
• 钙离子的丢失将会导致 HRP C酶失活和热 稳定性的下降,还能使血红素的构型发生改 变。
HRP的作用机制
• 由 HRP催化的多数反应可由以下等式表示 ： AH +H2O2 →·A + 2H2O
辣根过氧化物酶的提 取、纯化以及应用
辣根过氧化物酶简介
• 辣根，是十字花科多年生直立草本植物， 在世界大部分温和地区都有种植。它的根 不但可以烹调，同时还含有一种含量丰富 的过氧化物酶，这些同工酶统称为“辣根 过氧化物酶(HRP) ”。
• 其中含量最为丰富的是辣根过氧化物酶同 工酶 C (HRP C)
• HRP 作为一种标志酶以观测蛋白质和生物 膜表面的探针, 高质量的HRP 还应用于分子 生物学如蛋白质印迹等。
• 但是，目前HRP 尚不能用基因工程生产。
谢谢大家
HRP 的CM - 23 洗脱图
HRP 的DE- 52 洗脱图
• HRP催化 H2O2氧化 OPD体系的最适 pH为 4 . 75 .
pH对辣根过氧化物酶活力的影响
pH对溶液中 HRP稳定性的影响
pH对 HRP稳定性的影响
HRP分别在 pH2 . 5～5溶液中保纯 7天后 , HRP催化反应速率为 0,说明 HRP在该条件 下保纯 7天后已完全失活.在 pH6 . 0～8 . 0 范围内 , HRP催化反应的初始速率随 pH值 的增加而逐渐增大.当 pH值达到 8 . 0以后 反应速率趋于稳定 ,说明 HRP在偏碱性缓冲 液中的稳定性较高 ,而在酸性条件下 HRP容 易失活 ,其原因可能是由于在碱性条件下酶 的结构相对稳定 ,酶活性处于休眠状态
• 由一分子还原性底物的加入HRPⅠ ,生成另一个 含有含氧 Fe (Ⅳ)中心的催化中间体HRPⅡ。
• 由一分子还原性底物参加HRPⅡ ,使 HRPⅡ还原 成静态酶。
• 图中生成的两个带电子的产物可能会引起更复杂 的反应 ,包括形成二倍体、 三倍体、 多聚体 ,以及 启动一个以该产物为底物的反应。
辣根过氧化物酶的分离纯化
• 其中 AH是还原性底物 , ·A是自由基。还原 性底物包括芳香族化合物 ,酚类化合物 ,吲 哚 ,胺类和磺酸盐。
HRP C 以阿魏酸为底物的催化循环
• 催化循环的第一步是 H2O2 和静态酶中的 Fe(Ⅲ) 反应生成化合物 Ⅰ(HRPⅠ) , HRPⅠ是一个高氧 化态的催化中间体 ,包含一个含氧 Fe (Ⅳ)中心和 一个带正电荷的卟啉。
HRP的结构
• HRP C含有两个不同的金属中心:正铁原卟 啉(即血红素 )和两个钙原子。这两个金属中 心对酶的整体结构和功能都是非常重要的。
• 通过血红素中铁原子的一个轴向结合点与 肽链上 His170侧链的 N原子结合 ,使血红素 垂直连接在 His170上 (下图 ) ;而卟啉铁的另 一个轴向结合点在静态酶中则是空着的 ,当 有 化物H2、O2氟存化在物时或,叠该氮结化合物点等就小能分与子C结O、合。氰
辣根过氧化物酶应用
• 酚类化合物是常见的有毒有机污染物 ,含酚 废水在我国水污染控制中被列为重点解决 的有害废水之一 ,它的大量排放对水体、土 壤造成严重的污染 ,进而危害人类的健康。
• HRP在 H2O2存在时能催化苯酚、 苯胺及其 取代物聚合。
• 张国平等人对用辣根过氧化物酶处理废水 中的五氯酚进行了研究
• 当酶用量相同(同为 0.1 U/ mL) 时 度 前比 者,H只2HO2用O2/28P/mCPiCPn就R= 获=1 0时得.5的了时去8要0除快%速, 以上的去除率 ,而后者则用了 15min。
•
适度增加 太过量的 制作用
H2O2 H2O2
可以加快反应, 也会对反应有抑
其他应用
• 辣根过氧化物酶是临床检验试剂中的常用 酶。该产品不但广泛用于多个生化检测项 目，也广泛运用于免疫类（ELISA）试剂盒。 过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关 键成分，对试剂盒的质量有重要影响。
新鲜干净辣根 匀浆
尼龙纱布过滤 上清
40%-80%硫酸铵盐析 沉淀用水溶解并在水中进行透析
用-20℃丙酮制沉淀 水溶解并透析 离心，取上清
辣根过氧化物酶的分离纯化
上样于CM-23纤维素 梯度洗脱
取第二个酶纯高峰部分在自来水中透析 上样于DEAE-52 梯度洗脱
取酶活高峰部分浓缩，既得 纯化辣根过氧化物酶
不同条件下的去除速率
不同条件下的去除速率
• 总的来说 ,反应是相当快的 ,所 有的反应都在15 min内进行了 一半以上。
• 当 多 PCH,P则2=O反20/应.5P速C的P度2相快个同。反时对应于,酶,酶H用用2O量量2/ 为0.1 U/ mL 时只用 15 min 就 获得了 80 %以上的去除率 ,而 酶用量为0.05 U/ mL 时则用了 40 min。
pH对 HRP活力的影响
• 在不同的酸度条件下 ,分别测定辣根过氧化 物酶 (HRP)催化 H2O2氧化 OPD的初始反 应速率 ( dA /dt) ,以 dA /dt对 pH值做图
• 发现 ,在 pH值 4 . 5～4 . 75范围内 , HRP活 力呈上升趋势 ,至 pH值为 4 . 75时 HRP活 力达到最大.以后随着 pH值的增高 ,其活力 呈下降的趋势.
HRP C 的部分结构特征
HRP C 三维结构
HRP的结构
• 酶的结构总体上看来大部分是α螺旋 ,但其 中也包含一些小的 β折叠。
• 在血红素平面上下两侧存在着两个空白区 域 ,该区域可能是由钙结合位点与其他结构 元素共同作用而成的 ,也可能是基因复制后 留下的产物。
HRP的结构
• 在血红素平面的上下两侧存在着两个钙原 子的结合位点 ,它们通过一个氢键群与血红 素结合区域相连。
• 现在HRP C的结构与作用机制已经被阐明
• 结构 • 反应机理 • 分离纯化 • 特性分析 • 应用
HRP的结构
辣根过氧化物酶同工酶 C是一条由 308个氨 基酸组成的肽链 。在这条肽链中有 4个由 两分子半胱氨酸组成的二硫键 ,它们分别是 11～91、 44～49、 97～301和 17～209; 同时还存在一个由 Asp99和 Arg123组成的盐 桥。