辣根过氧化物酶的提取、纯化以及应用
辣根过氧化物酶示踪电泳法
辣根过氧化物酶示踪电泳法是一种常用的分离和检测生物大分子的方法，在分子生物学、生物化学和医学等领域被广泛应用。
本文将从简单介绍辣根过氧化物酶示踪电泳法的原理和应用，逐渐深入探讨其在研究和诊断中的重要性和潜力。
一、基本原理和技术实施辣根过氧化物酶（HRP）是一种常见的内源性酶，具有较高的催化活性和稳定性。
它能与生物大分子（如DNA、RNA、蛋白质等）发生特异性结合，并通过催化染色反应产生可观测的颜色或荧光信号。
辣根过氧化物酶示踪电泳法利用这种酶的特性，结合电泳技术，实现对生物大分子的分离和检测。
在实验中，首先将样品经过适当的处理和纯化，使其具备较好的电泳性质。
将样品加在聚丙烯酰胺凝胶电泳板上，施加电场后，生物大分子根据其大小、电荷等特性在凝胶中进行迁移。
随后，在凝胶上均匀涂敷含有辣根过氧化物酶底物的试剂液，使其与迁移的生物大分子相互作用。
通过合适的显色或荧光检测方法，观察样品中的目标分子的分离和定量分析。
二、应用领域和意义辣根过氧化物酶示踪电泳法在研究和诊断中具有广泛的应用。
以下列举几个典型的应用领域和意义：1.基因组学研究：辣根过氧化物酶示踪电泳法可用于分离和检测基因组DNA中的特定序列。
通过其高灵敏度和特异性，可以快速鉴定目标基因、分析基因的结构和功能，并深入研究基因组的变异和表达情况。
2.蛋白质组学研究：辣根过氧化物酶示踪电泳法可用于分离和检测蛋白质混合物中的目标蛋白质。
结合其他分离和鉴定技术，可以揭示蛋白质的功能、相互作用和调控机制，为疾病诊断和药物研发提供重要的信息。
3.临床诊断：辣根过氧化物酶示踪电泳法可用于检测体液中的特定分子标志物，如肿瘤标志物、病毒RNA等。
通过对这些标志物的分离和定量，可以实现早期诊断和疾病监测，为临床治疗提供准确和可靠的依据。
4.食品安全检测：辣根过氧化物酶示踪电泳法可用于检测食品中的有害物质或添加剂残留。
毒素、重金属、防腐剂等对人体健康具有潜在危害的物质可以通过该方法快速鉴定和定量，保障食品安全和公众健康。
辣根过氧化物酶结构式
辣根过氧化物酶结构式辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase）是一种被广泛应用于生物化学和分子生物学研究领域的酶类分子。
它由辣根（Armillaria genus）植物中提取得到，具有非常高的催化活性和稳定性。
辣根过氧化物酶在生物学研究、临床诊断和食品加工等领域中有着广泛的应用和重要的地位。
1. 辣根过氧化物酶的结构辣根过氧化物酶是一种非常复杂的蛋白质，其结构由多个亚基组成。
这些亚基包括一个基质结合亚基、一个过氧基结合亚基以及几个其他辅助亚基。
辣根过氧化物酶的分子量大约为44-46千道尔顿（kDa）。
这个酶的活性主要由其基质结合亚基所决定。
该亚基主要由氨基酸组成，如苏氨酸、赖氨酸和酪氨酸等。
2. 辣根过氧化物酶的催化机制辣根过氧化物酶的催化机制与其他过氧化物酶类似，都是通过还原辅助基团来氧化底物。
具体来说，它在存在过氧化物的条件下，将底物与过氧化物反应，生成对应的氧化产物。
这个过程涉及到催化剂的不断变化和再生，从而实现酶的持续催化。
3.辣根过氧化物酶的应用辣根过氧化物酶的广泛应用主要得益于其高催化活性和广泛的底物适应性。
它可以用于生物学研究，如DNA检测、蛋白质定量和酶反应动力学等方面。
辣根过氧化物酶也常用于临床诊断，例如用于检测肿瘤标志物、血液疾病和免疫疾病等。
辣根过氧化物酶还常见于食品加工中，如漂白、防腐和脱毒等领域。
4.我对辣根过氧化物酶的个人观点和理解辣根过氧化物酶作为一种重要的酶类分子，具有广泛的应用领域和潜在的研究价值。
我认为其高催化活性和多功能性使得它在生物化学和分子生物学研究中扮演着重要的角色。
无论是在基础科学研究中还是在应用实践中，辣根过氧化物酶都展示了其重要性和优越性。
总结回顾：通过本文的论述，我们了解了辣根过氧化物酶的结构、催化机制以及应用领域。
辣根过氧化物酶是一种重要的酶类分子，其结构复杂且具有高催化活性。
其催化机制涉及到底物与过氧化物的反应，并通过催化剂的变化和再生来实现持续催化。
HRP(辣根过氧化物酶)标记抗体的方法
(12) 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。
简易过碘酸钠法
本法是以NaIO４先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所
获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和Ig结合，99％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重
大损失，是目前最常用的方法。
40,000 160,000 IgG量
(3) 本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～4％的
酶与蛋白质结合。
4. 试剂及器材：
(1) 0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，
(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿
色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前
者可高4倍以上。另外，还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺
酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，
2. 标记步骤:
(1) 称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。
(2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。
(3) 将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立
(2) 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分
钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅
hrp偶联化合物
辣根过氧化物酶偶联化合物（HRP conjugates）是一种用于生物检测中信号放大和可视化的重要工具。
以下是关于HRP偶联化合物的一些详细信息：
1. 结构与功能：HRP是一种含有血红素的酶，可以从多年生草本植物辣根中提取。
它使用过氧化氢作为底物，能够催化各种有机和无机化合物进行氧化反应。
在生物检测中，HRP通常与抗体或其他分子结合，形成偶联物，以便通过酶的活性来检测特定的生物分子。
2. 应用范围：HRP偶联物可用于多种分析技术，包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫组织化学（IHC）、免疫细胞化学（ICC）、蛋白质印迹（Western blotting）以及DNA/RNA原位杂交等。
3. 信号放大：Poly-HRP偶联物每个分子包含大量HRP分子，可以在每次结合事件中提供更高的酶活性，从而实现在常规检测应用中的信号放大。
4. 可视化方法：HRP和Poly-HRP偶联物可以通过使用底物进行可视化。
当底物被HRP氧化时，会产生可量化的信号。
这些底物可以分为显色底物、荧光底物或化学发光底物，不同的底物适用于不同的检测需求和设备。
5. 标记技术：抗体可以通过不同的化学试剂交联到HRP上，形成HRP标记的抗体。
这种标记技术使得抗体能够在检测过程中被追踪和识别。
NaIO4氧化法是一种经典的抗体标记HRP 的方法。
综上所述，HRP偶联化合物在生物医学研究和临床诊断中扮演着重要角色，它们通过提供可量化的信号来帮助研究人员检测和定量分析各种生物分子。
一种过氧化物酶的提取方法
一种过氧化物酶的提取方法介绍如下:
过氧化物酶是一种重要的水解酶，在生物医药、食品工业等领域有着广泛的应用价值。
下面我们来介绍一种可行的过氧化物酶的提取方法：
提取方法：
1.准备新鲜植物、肝脏或其他组织或细胞培养物。
2.将组织或细胞用生理盐水洗净，然后切成小块。
3.加入适量的冰冷酒精，浸泡3-4小时，使细胞破裂可释放出过氧化物酶。
4.轻轻搅拌，然后过滤去除细胞残渣，得到纯化的过氧化物酶。
5.使用离子交换色谱和凝胶过滤等色谱方法，对提取得到的酶进行纯化。
6.通过测定酶活性，确定其纯度和酶活性。
7.最后，将得到的纯化酶溶液进行减压冷冻干燥或冻干，存放于低温处备用。
此提取方法的优点在于，具有简单易行、操作方便、纯度较高等特点，同时可以获得良好的酶活性和稳定性。
然而，在实际操作的过程中，还需要注意控制提取温度、时间和酒精浓度等因素，以使提取效果更加理想。
此外，还可以使用其他提取方法，比如超声波辅助提取、酸碱法提取、酶学法提取等，每种方法都有其各自的适用范围和优缺点，需要根据具体情况进行选择。
辣根过氧化物酶结构式
辣根过氧化物酶结构式【知识文章】辣根过氧化物酶结构式：探索辣根对身体的益处引言：在我们的日常饮食中，经常会遇到一种被称为辣根的调料。
辣根以其辛辣的味道和独特的香气为人所喜爱，不仅能为食物增添风味，还具有一定的保健功效。
辣根中的一种特定成分——辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）是辣根所特有的一种酶类物质。
本文将深入探讨HRP的结构式、其在食物中的存在形式、以及辣根对身体的益处。
一、辣根过氧化物酶结构式及特点1. 什么是辣根过氧化物酶？辣根过氧化物酶是一种由植物辣根中提取得到的酶类物质。
它是一种特殊的催化剂，能够促进氧化反应的进行。
2. HRP的结构式HRP的结构式为C18H12N2O4S2，它由多个氨基酸残基组成，形成一个复杂的螺旋结构，其中包含有铁原子。
3. HRP在辣根中的存在形式HRP在辣根中以囊泡的形式存在，这种囊泡能够保护HRP不受外界环境的影响，并在适当的条件下释放HRP。
二、HRP在食物中的益处1. 抗氧化作用HRP具有很强的抗氧化能力，可以中和体内的自由基，减轻氧化应激对身体的危害，降低患病风险。
2. 抗菌作用HRP对一些细菌具有很强的杀灭作用，可以有效预防食物中的细菌感染，保障食品安全。
3. 免疫调节作用HRP能够调节免疫系统的功能，增强人体对外界病原体的抵抗能力，提高免疫力。
三、个人观点与理解HRP作为辣根中的一种特殊成分，具有多种益处。
我个人认为辣根作为一种调味品，不仅能提升菜肴的美味，还能为我们的健康增添一份保障。
HRP的抗氧化、抗菌和免疫调节作用能够综合增强人体的防御能力，为我们预防疾病起到积极的作用。
总结回顾：通过对辣根过氧化物酶结构式、存在形式及其对身体的益处的探讨，我们了解到了HRP的重要性和作用。
HRP的存在可以提供强大的抗氧化和抗菌作用，同时也能够调节免疫系统的功能，保障我们的身体健康。
在我们的日常饮食中适量摄入辣根，可以提供充足的HRP，增强身体的免疫力，预防疾病的发生。
辣根过氧化物酶(hrp)法的发明
辣根过氧化物酶(hrp)法的发明
辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）法是一种常用的生物化学实验方法，用于检测分析物质或者观察某种化学反应的过程。
HRP法的发明可追溯到20世纪50年代初。
该方法最早是由英国科学家WG Tapper于1954年发明，他首次用辣根（一种根茎植物）中的过氧化物酶（peroxidase）作为催化剂来观察化学反应。
HRP法的原理是利用辣根过氧化物酶作为催化剂，加入过氧化氢（hydrogen peroxide）和某种显色底物（如TMB或DAB），辣根过氧化物酶会催化底物的氧化反应并产生显色产物，从而使观察者能够观察到某种化学反应的进行。
HRP法在科学研究和医学诊断中得到了广泛应用。
它可以用于检测分析物质的浓度、观察某种酶活性、研究分子相互作用等。
此外，HRP法还被广泛用于酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）和免疫组织化学领域。
辣根过氧化物酶法的发明开创了一种新的生物化学实验方法，为科学研究和医学诊断提供了一种快速、敏感、特异的检测手段，并在很大程度上促进了生物化学领域的发展。
辣根过氧化物酶标记
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
酶制剂及其底物
◆ 凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均 可作为标记用。但作为标记抗体用的
◆ 酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2) 比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能
◆ 用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶 为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶
1
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（2）辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体的原理
a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ）
HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结 合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为 40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差 异，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。HRP的辅 基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以 OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯 度。
法。 辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含
糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗 体分子上的氨基形成Schiff碱而结合。后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺) 还原生成稳定的酶标记抗体。
3
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在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。游离酶理论上不影响最 终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争固相抗原，从而 减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此需要对制备的酶结合物进行 纯化，去除游离的酶和抗体。纯化的方法很多，硫酸铵盐析法最为简便， 但效果并不理想。用离子交换层析、分子筛法可得到最佳的分离效果， 但费用较贵。
辣根过氧化物酶的结构与作用机制
厚的兴趣 ;还有部分学者推测该区域对催化反应中 体 ,以及启动一个以该产物为底物的反应 。
图 1 HRP C的一些结构特征 [6 ]
中存在着一个共有的区域叫过氧化物酶折叠中心 , HRP和其他第三类过氧化物酶在该中心上都有 3 个 α螺旋 。其中 2个 α螺旋 ( F′螺旋和 F″螺旋 )的 氨基酸序列和种类都表现出了很强的可变性 ,但由 于 Cys177与 Cys209之间存在着一个二硫键 ,使 F′螺旋 和 F″螺旋所组成的区域在整体结构上保持了相对 稳定 。由于 F′螺旋可能存在着底物的结合位点和
量的 siRNA 观察到非特异性抑制作用 。 十多年的临床实验证明 ,基因治疗总体上是安
全有效的 。去年来 ,慢性乙型肝炎基因治疗的研究 也取得了另人鼓舞的成绩 ,然而作为一种常规的治 疗方法应用于乙肝 ,仍存在很多问题 ,如疗效 、所需 费用 、副作用等 。随着理论和实践技术研究的深入 , 这些问题会被逐步突破和改进 。基因治疗应用于乙 肝 ,将会得到越来越多人的认可 。
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Hale Waihona Puke ●小综述《生命的化学 》2005年 25卷 1期 CHEM ISTRY OF L IFE 2005, 25 (1)
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通道 ,使许多研究 HRP的学者对该区域表现出了浓 引起更复杂的反应 ,包括形成二倍体 、三倍体 、多聚
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辣根过氧化物酶
辣根过氧化物酶用辣根过氧化物酶追溯周围神经联系法辣根过氧化物酶(Herseradish Peroxidase)最早由Richard(1960)等人[1]用来研究肾近端小管的早期吸收情况，将HRP注入鼠静脉内，离隔一定时间进行观察。
70年代Kristensen是将HRP用于神经系统联系的创妙人[2]，他的第一部分工作即是将HRP注入腓肠肌内而观察中枢（前角运动细胞）的HRP阳性标记颗粒。
1972年Lavai和Lavai et al[3]首次将HRP用于中枢神经系统。
他将HRP注入小鸡的中脑顶盖部分,30小时后取材, 观察视网膜节细胞内的HRP阳性标记细胞。
1973年以后, 此法用于中枢神经系统者逐渐增多。
将HRP注入周围神经末梢部分, 观察其向中枢的联系, 近年来开展了各方面的探索：里见肇及山本悌司等人进行的试验：是将HRP 注入胃壁包括胃体、胃底、幽门等处,观察延髓迷走背核及孤束核的内侧部的酶标颗粒, 以及将HRP注入猫心脏窦房结观察延髓迷走背核及孤束核的酶标颗粒[1,5]。
Dalsgaard, Elfvin(6)等人将HRP注入肠系膜下节及交感颈上节, 观察脊髓内五个交感核的酶标颗粒及其节段性。
至于用HRP法追踪周围神经联系的研究工作, 目前国内外开展很少。
只有Lowrence[7]将HRP注入一侧牙髓后观察同侧三叉神经半月神经节细胞内的HRP阳性颗粒；此外他还切断坐骨神经将断端浸入HRP液内, 在后根脊神经节细胞内找到HRP阳性颗粒。
Elfvin还将HRP注入荷兰猪的肠系膜下节, 观察脊神经细胞内HRP阳性细胞的节段性。
国内从事HRP法研究的学者也多是研究中枢神经系内各核团的联系, 而用HRP法从事周围神经系联系者则鲜见。
因此我们用HRP法追溯胃交感内脏传入第一级神经元-脊神经节细胞内酶标颗粒和足三里穴区一级感觉神经元-脊神经节细胞内酶标颗粒。
建立了HRP追踪围围神经联系的方法, 开展了对胃交感内脏神经元的节段性问题的探讨。
HRP基础知识
辣根过氧化物酶科技名词定义中文名称：辣根过氧化物酶英文名称：horseradish peroxidase;HRP定义：编号：EC 1.11.1.7。
一种糖蛋白，由于在辣根中该酶的含量很高，故名。
它以铁卟啉为辅基，在过氧化氢存在时能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。
通常用做光学和电子显微镜的组织化学示踪物。
所属学科：生物化学与分子生物学(一级学科) ；酶(二级学科)本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布目录[隐藏]简介制备简介制备[编辑本段]简介过氧化物酶，酶学分类号为EC 1.11.1.7。
该酶催化Donor+ H2O2--→Oxidized donor+2 H2O。
过氧化物酶，通常来源于辣根（因此称辣根过氧化物酶），是临床检验试剂中的常用酶。
该产品不但广泛用于多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类（ELISA）试剂盒。
过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的质量有重要影响。
辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。
HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。
HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。
酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。
H RP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。
高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。
RZ值越小，非酶蛋白就越多。
[编辑本段]制备实验原理过氧化物酶催化以下反应：2 H2O2 ─→ O2＋2H2O这一类酶以铁卟啉为辅基，所以属血红素蛋白质类(hemeProteins)。
过氧化物酶在生物界分布极广，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要的作用。
辣根过氧化物酶hrp结构式
辣根过氧化物酶hrp结构式
辣根过氧化物酶（HRP）是一种广泛应用于生物化学和分子生物学研究的酶。
它的基本概念是指从辣根中提取出来的一种酶，具有过氧化物酶的活性。
辣根过氧化物酶（HRP）的结构特点是由两个亚基组成的，分别是α和β亚基，它们通过非共价作用力结合在一起，形成一个稳定的酶结构。
辣根过氧化物酶（HRP）在生物体内起到重要作用，其主要功能是催化过氧化物的分解。
在生物体内，过氧化物是一种常见的活性氧，具有高度的化学活性，可以引起细胞损伤。
辣根过氧化物酶（HRP）通过催化过氧化物的分解，可以降低活性氧的浓度，从而保护细胞免受损伤。
在我国，辣根过氧化物酶（HRP）的研究取得了显著的进展。
科学家们通过对辣根过氧化物酶（HRP）的基因进行克隆和表达，成功实现了辣根过氧化物酶（HRP）的大规模制备。
这为我国生物化学和分子生物学研究领域提供了重要的实验工具。
此外，辣根过氧化物酶（HRP）在我国的医疗领域也具有广泛的应用。
作为一种高效、安全的生物催化剂，辣根过氧化物酶（HRP）被用于治疗各种疾病，如肿瘤、神经系统疾病等。
此外，辣根过氧化物酶（HRP）还被广泛应用于我国的环境保护领域，用于催化有机污染物的降解。
总之，辣根过氧化物酶（HRP）是一种具有重要生物学功能的酶，其在生物化学、分子生物学、医学和环境保护等领域具有广泛的应用前景。
辣根过氧化物酶
1、HRP标记腹水单抗
❖ 过碘酸钠氧化法，HRP直接标记腹水中的单抗
1、5mg HRP溶解于0.5ml 0.1M NaHCO3中； 2、加0.5ml10mM NaIO4，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2h； 3、加0.75ml 0.1M Na2CO3，混匀； 4、加0.75ml 小鼠腹水单抗，混匀； 5、加Sephadex G25干粉0.5g，混匀，盖紧，室温作用3h； 6、用少许PBS将交联物转移于一支下口具玻璃棉的5ml注射器外筒中 ； 7、用少许PBS将交联物全部洗出； 8、收集洗出液，加1/20V新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室 温作用30min； 9、再加3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1h；
❖ 包被（coating）：指将抗原或抗体固相化的过程。它是通过物 理吸附作用，一般靠疏水键连接。
❖ 封闭（blocking）：指用封闭剂封闭经包被的固相载体表面残留 的未饱和位吸附位点的过程。
❖ 免疫吸附剂（immunosorbent）：固相化的抗原或抗体。
第二十一页，编辑于星期三：十九点 五分。
第十二页，编辑于星期三：十九点 五分。
10、将交联物过Sephdex G200（2.6×100cm）层析纯化，分管
收集第一峰。
Fig 2-1. Gel filtration of the reaction mixture of HRP conjugated to mAb 13A4 on a
Sephadex G200 column（2.6cm×100cm）, equilibrated with PBS, at a rate of 0.15 ml/min
ELISA操作要点：
❖ 加样：即加标本、酶结合物和底物，注意交叉污染和产生气泡。 ❖ 温育：常采用的温度：43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）。
辣根过氧化物酶及其使用介绍
辣根过氧化物酶及其使用介绍酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。
酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。
酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。
酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。
目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。
高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。
在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。
(一) 酶制剂及其底物凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。
但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法测定。
目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。
HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。
HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。
酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。
HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm 的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。
高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。
RZ值越小，非酶蛋白就越多。
值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。
供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。
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• 钙离子的丢失将会导致 HRP C酶失活和热 稳定性的下降,还能使血红素的构型发生改 变。
HRP的作用机制
• 由 HRP催化的多数反应可由以下等式表示 ： AH +H2O2 →·A + 2H2O
新鲜干净辣根 匀浆
尼龙纱布过滤 上清
40%-80%硫酸铵盐析 沉淀用水溶解并在水中进行透析
用-20℃丙酮制沉淀 水溶解并透析 离心，取上清
辣根过氧化物酶的分离纯化
上样于CM-23纤维素 梯度洗脱
取第二个酶纯高峰部分在自来水中透析 上样于DEAE-52 梯度洗脱
取酶活高峰部分浓缩，既得 纯化辣根过氧化物酶
HRP C 的部分结构特征
HRP C 三维结构
HRP的结构
• 酶的结构总体上看来大部分是α螺旋 ,但其 中也包含一些小的 β折叠。
• 在血红素平面上下两侧存在着两个空白区 域 ,该区域可能是由钙结合位点与其他结构 元素共同作用而成的 ,也可能是基因复制后 留下的产物。
HRP的结构
• 在血红素平面的上下两侧存在着两个钙原 子的结合位点 ,它们通过一个氢键群与血红 素结合区域相连。
• 其中 AH是还原性底物 , ·A是自由基。还原 性底物包括芳香族化合物 ,酚类化合物 ,吲 哚 ,胺类和磺酸盐。
HRP C 以阿魏酸为底物的催化循环
• 催化循环的第一步是 H2O2 和静态酶中的 Fe(Ⅲ) 反应生成化合物 Ⅰ(HRPⅠ) , HRPⅠ是一个高氧 化态的催化中间体 ,包含一个含氧 Fe (Ⅳ)中心和 一个带正电荷的卟啉。
• 由一分子还原性底物的加入HRPⅠ ,生成另一个 含有含氧 Fe (Ⅳ)中心的催化中间体HRPⅡ。
• 由一分子还原性底物参加HRPⅡ ,使 HRPⅡ还原 成静态酶。
• 图中生成的两个带电子的产物可能会引起更复杂 的反应 ,包括形成二倍体、 三倍体、 多聚体 ,以及 启动一个以该产物为底物的反应。
辣根过氧化物酶的分离纯化
辣根过氧化物酶应用
• 酚类化合物是常见的有毒有机污染物 ,含酚 废水在我国水污染控制中被列为重点解决 的有害废水之一 ,它的大量排放对水体、土 壤造成严重的污染 ,进而危害人类的健康。
• HRP在 H2O2存在时能催化苯酚、 苯胺及其 取代物聚合。
• 张国平等人对用辣根过氧化物酶处理废水 中的五氯酚进行了研究
• HRP催化 H2O2氧化 OPD体系的最适 pH为 4 . 75 .
pH对辣根过氧化物酶活力的影响
pH对溶液中 HRP稳定性的影响
pH对 HRP稳定性的影响
HRP分别在 pH2 . 5～5溶液中保纯 7天后 , HRP催化反应速率为 0,说明 HRP在该条件 下保纯 7天后已完全失活.在 pH6 . 0～8 . 0 范围内 , HRP催化反应的初始速率随 pH值 的增加而逐渐增大.当 pH值达到 8 . 0以后 反应速率趋于稳定 ,说明 HRP在偏碱性缓冲 液中的稳定性较高 ,而在酸性条件下 HRP容 易失活 ,其原因可能是由于在碱性条件下酶 的结构相对稳定 ,酶活性处于休眠状态
pH值对去除率的影响
pH值对去除率的影响
在pH = 2～8 的范围内
测定了五氯酚在辣根 过氧化物酶和 H2O2 的 作用下的去除率。实
验结果见左图。由图 可见 ,在 pH 值为 4 和 5 时 ,去除率达95 %以 上 ,为最佳 pH 范围。
H2O2 对去除率的影响
H2O2 对去除率的影响
• 采0.0用5m不m同o的l/ LH五2O氯2 酚用进量行与 实验(辣根过氧化物酶是过 量的) ,测定五氯酚的去除 率用量,结为果0见～左0.图025。m当moHl/2OL 2 时 ,五氯酚去除率按比例 上升(也即残余五氯酚浓度 按与比PC例P下有降着)固,表定明的H反2O应2计 量0.0比25。m当moHl/2OL2以达上到时 ,去 除率已达最高 ,说明这时 H2O2 用量已饱和。
不同条件下的去除速率
不同条件下的去除速率
• 总的来说 ,反应是相当快的 ,所 有的反应都在15 min内进行了 一半以上。
• 当 多 PCH,P则2=O反20/应.5P速C的P度2相快个同。反时对应于,酶,酶H用用2O量量2/ 为0.1 U/ mL 时只用 15 min 就 获得了 80 %以上的去除率 ,而 酶用量为0.05 U/ mL 时则用了 40 min。
• HRP 作为一种标志酶以观测蛋白质和生物 膜表面的探针, 高质量的HRP 还应用于分子 生物学如蛋白质印迹等。
• 但是，目前HRP 尚不能用基因工程生产。
谢谢大家
HRP 的CM - 23 洗脱图
HRP 的DE- 52 洗脱图
HRP的结构
• HRP C含有两个不同的金属中心:正铁原卟 啉(即血红素 )和两个钙原子。这两个金属中 心对酶的整体结构和功能都是非常重要的。
• 通过血红素中铁原子的一个轴向结合点与 肽链上 His170侧链的 N原子结合 ,使血红素 垂直在静态酶中则是空着的 ,当 有 化物H2、O2氟存化在物时或,叠该氮结化合物点等就小能分与子C结O、合。氰
pH对 HRP活力的影响
• 在不同的酸度条件下 ,分别测定辣根过氧化 物酶 (HRP)催化 H2O2氧化 OPD的初始反 应速率 ( dA /dt) ,以 dA /dt对 pH值做图
• 发现 ,在 pH值 4 . 5～4 . 75范围内 , HRP活 力呈上升趋势 ,至 pH值为 4 . 75时 HRP活 力达到最大.以后随着 pH值的增高 ,其活力 呈下降的趋势.
• 现在HRP C的结构与作用机制已经被阐明
• 结构 • 反应机理 • 分离纯化 • 特性分析 • 应用
HRP的结构
辣根过氧化物酶同工酶 C是一条由 308个氨 基酸组成的肽链 。在这条肽链中有 4个由 两分子半胱氨酸组成的二硫键 ,它们分别是 11～91、 44～49、 97～301和 17～209; 同时还存在一个由 Asp99和 Arg123组成的盐 桥。
• 当酶用量相同(同为 0.1 U/ mL) 时 度 前比 者,H只2HO2用O2/28P/mCPiCPn就R= 获=1 0时得.5的了时去8要0除快%速, 以上的去除率 ,而后者则用了 15min。
•
适度增加 太过量的 制作用
H2O2 H2O2
可以加快反应, 也会对反应有抑
其他应用
• 辣根过氧化物酶是临床检验试剂中的常用 酶。该产品不但广泛用于多个生化检测项 目，也广泛运用于免疫类（ELISA）试剂盒。 过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关 键成分，对试剂盒的质量有重要影响。
辣根过氧化物酶的提 取、纯化以及应用
辣根过氧化物酶简介
• 辣根，是十字花科多年生直立草本植物， 在世界大部分温和地区都有种植。它的根 不但可以烹调，同时还含有一种含量丰富 的过氧化物酶，这些同工酶统称为“辣根 过氧化物酶(HRP) ”。
• 其中含量最为丰富的是辣根过氧化物酶同 工酶 C (HRP C)