基因治疗用腺病毒载体研究进展
重组腺病毒载体在基因治疗中的应用研究
重组腺病毒载体在基因治疗中的应用研究腺病毒（Adenovirus）是一种非常常见的病毒，它可以引起呼吸道感染、结膜炎等疾病。
而腺病毒载体则是将腺病毒改造成为可以携带外来基因并且将其传递到宿主细胞中的一种工具。
重组腺病毒载体（recombinant adenovirus vector）则是将腺病毒载体进行基因工程改造，以使其更加适合在基因治疗中使用。
基因治疗是一种利用人工合成或修饰的DNA或RNA，以矫正人体内RNA或蛋白质的缺陷或突变，来实现治疗目标的方法。
而腺病毒重组载体作为一种新型的基因治疗工具，不仅可以向宿主细胞传递被携带的外来基因，还可以被认为具有良好的特异性、高效性以及安全性。
那么，究竟如何对腺病毒进行改造呢？首先，需要将腺病毒的自然基因组从载体中删除，从而保证它不会再次导致感染。
然后，需要在其基因组中加入携带有目标基因的DNA，以使其能够有效传递基因到宿主细胞中。
此外，为了提高载体的稳定性、特异性以及亲和力，还可以在其表面进行修饰。
比如，将适当的配体加入载体表面，使其更容易与宿主细胞进行特异性结合。
而为了提高载体的免疫原性，还可以对载体进行进一步的改造以减少其在免疫系统中的识别度。
在基因治疗中，重组腺病毒载体具有多种优点。
例如，其在宿主细胞中产生过程稳定、表达效率高，可以长期保持稳定，并且为基因的体内传递提供了更为安全的一种方式。
此外，重组腺病毒载体还具有较高的转染效率，可以对多种细胞进行有效传递，且在传递过程中对细胞无明显不良影响。
同时，由于重组腺病毒是一种广泛存在于自然环境中的病毒，因此人体免疫系统对其也具有高度的抗体免疫反应，可以使其在体内被很好地清除。
然而，重组腺病毒载体在基因治疗中还存在着一些问题需要解决。
例如，由于重组载体通常与腺病毒自身存在交叉反应，因此将其用作基因治疗工具时，可能会导致一定程度的免疫性抑制。
此外，重组载体的安全性也需要进一步加强，以确保其在大量应用中不会产生潜在的副作用。
基因治疗载体的研究进展
225科技资讯 S CI EN CE & T EC HNO LO GY I NF OR MA TI ON 学 术 论 坛基因疗法是经由各种载体将目的基因导入至特定的组织靶细胞中,并通过转录表达达到治病目的[1]。
理想的基因载体应具有如下特点:在特异组织细胞中可有规律地、持续地进行外源基因表达;与细胞膜亲和性高、一定的靶向性及稳定性、安全、制备工艺简单。
基因疗法的载体可分成病毒型及非病毒型载体,病毒型载体转染效率高,但导向性差、携带信息量低及潜在致瘤性等不足;非病毒型载体则毒性低,免疫原性低,但与组织细胞亲和力较低[2]。
目前。
本文就两种常用的基因治疗在体进行相关综述,报道如下。
1 病毒载体1.1逆转录病毒载体逆转录病毒载体基因传递系统主要由两部分组成:一部分为应用外源基因代替病毒本身组成基因的逆转录病毒载体;另外一部分为在包装细胞的基因序列中整合了部分逆转录病毒基因。
20世纪90年代,世界上应用基因治疗的首例临床病例应用的就为逆转录病毒载体。
截止目前,R V 是在基因治疗临床试验中应用最为广泛的一种载体。
其中,常用的是一种经moloney鼠白血病病毒(M M L V )修饰获得的R V 载体。
R V具有较多优点,如基因表达稳定持久、转染率高,但其转染只限于分裂期细胞,最大可携带8Kb外援基因,与宿主基因组随机整合可诱发基因突变,产生具有遗传特征的野生型病毒,故进一步完善。
1.2腺病毒载体腺病毒是一种D N A 分子,为裸露的DNA病毒,载体容量需要小于7.5kb。
腺病毒能够感染全部周期的癌变细胞,获得广泛采用。
研究发现,E1区替代型腺病毒载体感染、表达率高、毒性低、制备工艺简便、可得到高滴度的纯化载体。
鉴于重组腺病毒载体不会整合进入宿主基因组织,在体基因也以额外的形式存在于染色体以外,表达时间不持久,因此是IL-2肿瘤基因治疗中的较为合适的载体。
1.3慢病毒载体慢病毒是经由HIV21演变而来的一种RNA病毒,属于逆转录病毒亚类。
腺病毒载体的研究新进展
腺 病 毒 载 体 的 研 究 新 进 展
刘思景 ， 郭伟韬 ， 王 辉 （ 东医学院 附属 医院， 东 湛 江 ５ ４ ０ ） 广 广 ２ ０ １
［ 键词 ］ 腺病毒 ； 关 载体 ； 究进 展 研
［ 图分 类 号 ］ Ｒ １ ． 中 ５ １８ ［ 献标识码 】 Ａ 文 ［ 文章 编 号 ］ １０ ０８—８４ （０ ０ １ ８ ９ ２ １ ）３—１６ —０ ６９ ２ 泛 的组 织 亲 和 性 ， 使 得 腺 病 毒 成 为 表 达 和 传 递 治 疗 基 因 的 这 主要 候 选 者 ＿ 。腺 病 毒 的 复 制 基 因 和 致 病 基 因均 已 相 当 清 ５ ］ 楚， 在人 群 中早 已流 行 （Ｏ ～８ ％ 成人 体 内都 有 腺 病 毒 的 中 ７％ ０ 和抗体存在） 。人 类 感 染 野 生 型 腺 病 毒 后 仅 产 生 轻 微 的 自限 性症状 ， 病毒唑治疗有效。 且 ２２ 易获得高滴度病毒 ． 腺 病 毒 系 统 可 产 生 ｌ 加～ １“ ／ ０ ０ ＶＰ
染几 乎 所 有 的细 胞 类 型 ， 了一 些 抗 腺 病 毒 感 染 的 淋 巴 瘤 细 除 胞 。腺 病 毒 是 研 究 原 代 非 增 殖 细 胞 基 因表 达 的 最 佳 系 统 ， 它 可 以使 转 化 细 胞 和 原 代 细 胞 中得 到 的结 果 直 接进 行 对 比。 ２ ４ 与 人 类 基 因 同 源 腺 病 毒 载 体 系 统 一 般 应 用 人 类 病 毒 ． 作为载体 ， 以人 类 细 胞 作 为 宿 主 ， 此 为人 类 蛋 白进 行 准 确 的 因 翻译 后 加 工 和适 当 的折 叠 提 供 了一 个理 想 的环 境 。大 多 数人 类 蛋 白都 可 达 到 高水 平 表 达 并 且 具 有完 全 的功 能 。 ２ ５ 能 同 时 表 达 多 个 基 因 这 是第 一 个 可 以在 同一 细 胞 株 ． 或 组织 中用 来 设 计 表 达 多 个 基 因 的表 达 系 统 。 最 简单 的方 法 是 将 含 有 ２个 基 因 的 双 表 达 盒 插 入 腺 病 毒 转 移 载体 中 ， 者 或 用 不 同 的重 组 病 毒 共 转 染 目的 细 胞 株 来 分 别 表 达 一 个 蛋 白。
腺病毒载体的研究进展
腺病毒载体的研究进展
腺病毒载体的研究进展
目的由于腺病毒载体转导目的基因具有高效率、低致病性、高滴度以及在体内不整合入宿主细胞染色体等优点,已被认为是最有效的转基因载体之一,并广泛应用于人类基因治疗.但是腺病毒载体还存在一些不足,如果有一定的免疫原性和毒性等,尚有待进一步解决.随着腺病毒载体研究的进展,新的载体系统必将在基因治疗中发挥更重要的作用.本文对腺病毒载体的研究进展作一综述.
作者：范凌云谢庆军作者单位：范凌云(上海交通大学生命科学技术学院,上海200240;深圳市威尔德基因工程有限公司,深圳518054) 谢庆军(深圳市威尔德基因工程有限公司,深圳,518054)
刊名：中国生物制品学杂志ISTIC英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOLOGICALS 年，卷(期)：2008 21(2) 分类号：Q343.1 R394.8 关键词：腺病毒载体基因治疗。
腺病毒载体在基因治疗研究中的应用
腺病毒载体在基因治疗研究中的应用基因治疗是近年来发展非常迅速的一种新型疗法，其通过改变人体内某些基因的表达或功能，从而达到治疗疾病的目的。
而其中的一种常用方法就是利用腺病毒载体进行基因转导。
下面我们将深入探讨腺病毒载体在基因治疗研究中的应用。
一、腺病毒载体基础介绍首先，我们需要了解什么是腺病毒载体。
腺病毒是一种小型病毒，具有广泛的宿主范围和极高的转导效率，因此成为了基因治疗领域中最常用的载体之一。
腺病毒的基因组为一条线性双链DNA分子，它的大小约为30kb，可以携带大量外来基因负责转导。
同时，腺病毒中的大部分基因已被删减或失活，因此可以在病毒粒子内部容纳更多的外来基因。
二、腺病毒载体的优势相比于其他的基因治疗载体，腺病毒载体具有许多的优势。
首先，腺病毒对人体的免疫应答十分低。
因为腺病毒感染人类的过程通常都是无症状的，在人体内会迅速被淋巴系统清除，因此它不会引起人体免疫反应。
其次，腺病毒的转导效率非常高，因为它具有广泛的靶细胞类型和容易侵入细胞的特性。
最后，腺病毒的基因修饰能力也很高，可以很容易的携带大量的外来基因，在转导过程中基因也不会被分解或改变。
三、腺病毒载体在基因治疗中的应用现如今，腺病毒载体已广泛应用于临床试验和基础研究中。
以传统的疗法为例，在肝脏癌等疾病中常常需要利用手术切除病变组织，但手术切除对机体的侵害很大。
通过利用腺病毒载体送入基因，就可以避免这种创伤，缩短患者的恢复期。
此外，腺病毒载体还可以用于治疗和预防一些遗传疾病，例如囊性纤维化和色素性视网膜炎。
四、腺病毒载体的展望在未来，腺病毒载体极有可能成为基因治疗领域的重要发展方向之一。
随着科技的发展和基因治疗研究的深入，人们可以更加深入的了解腺病毒载体中的机制，并且对其进行更加精确的改造。
同时，人们也需要进行更加深入的实验和测试，以探究腺病毒载体在人体内的表现和转导效率。
这一系列的研究和测试，将为腺病毒载体在基因治疗中的应用提供更好的基础和保障。
腺病毒载体用于基因治疗的研究进展
腺病毒载体用于基因治疗的研究进展胡奇婵;陈?n;王丽;杨举伦【期刊名称】《解放军医药杂志》【年(卷),期】2011(023)005【摘要】@@ 基因治疗作为一种新兴的医疗手段,为人类疾病治疗开辟了一条新的途径.基因治疗最关键的问题之一是要选择合适的载体以使治疗基因安全、高效地导入靶细胞.腺病毒(adenovirus, Ad)因具有诸多优点而作为基因治疗中应用最广泛的运载工具,特别是用于肿瘤基因治疗,然而其缺点在一定程度上限制了作为载体的应用.近几年来,随着对腺病毒分子结构与感染机制的进一步深入研究,人们对原有的腺病毒载体进行了一些改进,取得了很好的效果.因此,如何能有机地结合多项改进策略,最大限度地提高腺病毒载体在今后临床应用中的高效性、安全性将是未来研究的重点.本文就基因治疗中腺病毒载体的特点以及改造取得的一些进展做一综述.【总页数】5页(P76-80)【作者】胡奇婵;陈?n;王丽;杨举伦【作者单位】650032,昆明,成都军区昆明总医院病理科;650031,昆明,昆明医学院;650032,昆明,成都军区昆明总医院病理科;650032,昆明,成都军区昆明总医院病理科;650032,昆明,成都军区昆明总医院病理科【正文语种】中文【中图分类】R730.5【相关文献】1.腺病毒载体用于基因治疗的研究进展 [J], 胡奇婵;陈玥;王丽;杨举伦2.腺病毒载体用于动脉粥样硬化基因治疗的研究进展 [J], 王琳;张珂欣;刘艳稳;冷吉燕;秦俊杰3.华东部分地区12岁以下儿童5型腺病毒感染状况调查——用于Ad5型重组载体疫苗或者基因治疗剂的适宜人群筛选 [J], 马春玲; 董立; 钟天鹰; 王世霞; 卢山4.腺病毒载体在肿瘤基因治疗和基因疫苗领域的应用研究进展 [J], 谢谦;高祥;王祎5.腺病毒载体成功地应用于癌症基因治疗 [J],因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
腺病毒载体的构建与基因治疗的研究
腺病毒载体的构建与基因治疗的研究在现代医学中，基因治疗作为一种新型的治疗手段，已经逐渐受到人们的关注。
而腺病毒载体的构建是基因治疗研究中不可避免的部分。
本文将围绕腺病毒载体的构建和基因治疗的研究展开论述。
一、腺病毒及其载体的特点腺病毒(Adenovirus)是一类非常常见的病毒，其特点是具有两种形态：圆形和20面体。
腺病毒可以感染人类、猴子、猪、牛和小鼠等动物，可能引起感染后的发热、呼吸困难等症状。
然而，腺病毒毒株相对较多，结构和生命周期也非常适合于基因搭载和转导。
因此，腺病毒载体成为一种被广泛使用的基因治疗载体。
腺病毒载体的特点是将外源基因插入到其某些基因区域内，通过腺病毒本身的生命周期，将基因表达的信使RNA传递到细胞内，实现基因治疗。
二、腺病毒载体的构建针对腺病毒载体的构建，一般可分为以下几个关键步骤：1.选择腺病毒毒株目前，已经有大量的腺病毒毒株被发现和鉴定。
选择恰当的腺病毒毒株，可以针对不同治疗疾病的目的，选择合适的载体来完成基因治疗。
2.构建质粒在选择了合适的腺病毒毒株后，需要构建质粒，以便将外源基因并入腺病毒的基因组。
质粒中除了外源基因外，还包括其他辅助基因，比如腺病毒毒衣壳外衣和细胞克隆等。
而且，对于外源基因的选择，需要考虑到其表达效率和拓扑结构等方面。
3.转染细胞和腺病毒表达质粒构建完成后，通过转染细胞并带入质粒中的外源基因，使细胞“表达”出腺病毒。
随着腺病毒的制备，将腺病毒载体大量表达出来。
三、基因治疗的研究基因治疗是一种针对遗传病和非遗传病的新型治疗方法，它通过人工调控异常基因的表达，达到基因治疗的效果。
具体来说，是针对某些致病基因的缺失或突变，通过腺病毒载体的插入溶液，传递外源基因到受体细胞中，使外源基因代替致病基因，达到基因治疗的效果。
研究表明，基因治疗可以在癌症、神经系统疾病、血液系统疾病、因人类免疫缺陷病毒感染引起的疾病、代谢性疾病等方面发挥重要作用。
四、展望尽管基因治疗在现在处于起步阶段，但在未来，随着载体、技术的不断改进和完善，它在医学领域的应用将会越来越广泛，并会为治疗一些顽疾带来新的突破。
腺病毒载体在基因治疗中的应用研究
腺病毒载体在基因治疗中的应用研究从基因治疗的出现到现在，各种基因传递载体已经被开发出来。
腺病毒载体是其中最常用的一种。
腺病毒是单链DNA病毒，其能力具有针对患者和细胞的高效度和安全性。
在基因治疗中，腺病毒载体被用作基因传递介质，将目标序列输送到患者的细胞中，实现基因治疗。
腺病毒载体的种类目前，根据不同的模板基因和载体描述，分别有以下几种腺病毒载体：1. 腺病毒质粒宿主原型 (Adeno-Associated Virus-Derived Plasmid Host Prototype)2. 腺病毒质粒腺病毒 (Adeno-Associated Virus-Derived Plasmid Adeno-Associated Virus)3. 腺病毒质粒第一类全退化腺病毒 (Adeno-Associated Virus-Derived Plasmid Type-I AAV-Derived Pseudo-Adeno-Associated Virus)4. 腺病毒质粒第二类全退化腺病毒 (Adeno-Associated Virus-Derived Plasmid Type-II AAV-Derived Pseudo-Adeno-Associated Virus)5. 腺病毒基因疗法治疗CNS 疾病的腺病毒质粒 (Adeno-Associated Virus-Derived Plasmid for CNS Disorders)以上五种腺病毒载体的核心是由100个噬菌体相应核心重复序列（DRs）的一对反向定向的重复片段组成。
这些载体在噬菌体库中产生，并用于表达与腺病毒辅助质粒相对应的重组腺病毒质粒的核酸聚合酶。
腺病毒载体的优点相比较其他基因载体，腺病毒有如下优点：1. 小体积～5.1Kb（噬菌体中的序列长通常为10kb以上），可以输送到大多数疾病相关的基因。
2. 由于非可复制性（因为腺病毒无法自行进行复制）并且与人类生化系统共生,这意味着细胞从无害的感冒病毒转变为病毒感染后的目标细胞。
腺病毒载体构建原理与方法的研究进展
作者单位:100052北京,中国预防医学科学院病毒学研究所病毒形态研究室#综述#腺病毒载体构建原理与方法的研究进展何金生王健伟洪涛由于腺病毒(Adenovirus,Ad)载体在哺乳动物及其多种细胞上进行基因转移和蛋白表达的高效性,使其在基因疫苗及基因治疗的研究中受到人们的青睐,成为当今使用最多的病毒载体之一。
为了取得更满意的效果,人们在腺病毒载体构建与改进方面,做了大量工作。
本文谨就近年来腺病毒载体构建原理与方法的研究进展扼要综述如下。
1腺病毒载体的构建原理腺病毒的基因组为线形双链DNA,长度约为36kb,被包装在一个二十面体的蛋白质外壳内,可分为编码区和非编码区。
编码区又可分为早期转录区和晚期转录区两种,前者有E1、E2、E3、E4四个区,编码病毒的调节蛋白,后者有L1、L2、L3、L4、L5五个区,编码病毒的结构蛋白。
非编码区含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。
除E3区外,其余的编码区及顺式作用元件均为病毒复制所必需。
第1代腺病毒载体是由去除腺病毒基因组的E1和P或E3两个区而获得,其复制必须在由5型腺病毒转化的可组成性表达E1蛋白的293细胞中完成。
其主要优点为:在体外有很高的繁殖滴度(1011~1012PFU P ml);易感的宿主细胞范围广,既能感染增殖细胞,又能感染非增殖细胞;病毒基因组存在于细胞染色体外,避免了因整合引起的细胞突变。
但由于病毒载体与表达E1蛋白的293细胞之间存在同源序列。
在293细胞中繁殖时,通过重组,可重新获得E1区,出现复制型腺病毒(Replication-competent Ads, RCAs),这使得第1代腺病毒载体的应用受到限制112。
此外,由于发现在多种转化及原代的细胞内存在具有Ela样活性(Ela-like activity)的物质,因而E1区缺失的腺病毒载体在这些细胞内,仍能进行Ela非依赖性的腺病毒DNA复制,并从头合成病毒的早期和晚期蛋白,激发宿主针对腺病毒的细胞和体液免疫,使载体在体内的持续时间以及再次应用均受到极大影响122。
腺病毒载体的研究进展
因表达和校正功能。蒋文明等嘴ＰＲＲＳ的串联Ｍ蛋白
与ＧＰ５蛋白重组腺病毒免疫小鼠，结果表明可以诱导产
蛋白（ｇｒｅｅｎ
ｐｒｏｔｅｉｎ。ＧＦＰ）报告基冈，便于直 接观察转染及感染效率，并可测定重组病毒的滴度。 此种方法为目前研究人员所普遍使用。 质粒体外连接法由Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ等１６－７１建立．是将稀有 的限制性内切酶位点引入穿梭质粒和腺病毒骨架载体 中，将外源基因克隆人穿梭质粒中．再通过酶切连接的方 法将穿梭质粒连接人腺病毒骨架载体，转化大肠杆菌复 制重组质粒，转染相应的包装细胞系后。即可产生复制缺 陷型的重组腺病毒。该法相对于细菌内同源重组法更简 单、快速，只需两步，避免了ＢＪ５１８３不稳定、获得的质粒 ＤＮＡ量较少等缺点．但是大片段的连接效率较低．需通 过大量的噬斑筛选，程序较复杂罔。另外，还报道有酵母内 同源重组、ｃｒｅ－ｌＯＸ介导的重组、黏性质粒构建方法等。
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Ｊ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
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ｃａｔｔｌｅ．【Ｊ】．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ，２００５，１４（５）：５６３—５６７．
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后免疫小鼠．两者的特异性抗体均可检出。Ｗａｎｇ等【Ｉ嘴
猪圆环病毒２型Ｃａｐ蛋白基因插入到重组Ａｄｖ中，可诱 导小鼠产生高滴度衄清ｌｇＧ。用同型Ａｄｖ再次免疫时，取 得较好的增强效果。汤景元等【ｌ刀将猪繁殖与呼吸综合征 病毒（ＰＲＲＳＶ）Ｍ蛋白基因插入到Ａｄｖ后，免疫小鼠，产生 了ＰＲＲＳＶ特异性抗体和细胞免疫反应。韦显凯”卧将表达 ＰＥＤＶＳ蛋白不同基因片段的重组腺病毒注射人小鼠后，
腺病毒载体技术在基因治疗中的应用
腺病毒载体技术在基因治疗中的应用基因治疗是一种新兴的治疗方法，它利用基因工程技术修复或替换患者体内缺失或异常的基因，从而达到治疗疾病的目的。
而腺病毒载体技术，则是基因治疗中常用的技术之一。
本文将从腺病毒载体技术的定义、特点、应用场景和未来展望等方面进行探讨。
定义腺病毒是一种常见的病毒，其天然感染范围广泛，对人体的影响也很大。
而利用腺病毒作为载体，将目标基因导入到患者的细胞中，以达到基因治疗的目的，则是指腺病毒载体技术。
腺病毒载体技术的特点腺病毒载体技术具有以下几个特点：1. 高效性：腺病毒具有很强的感染能力，可以轻松进入人体细胞，并将目标基因导入到患者的基因组中。
2. 安全性：腺病毒具有很强的专一性，只对某些特定类型的细胞进行感染，不会对正常细胞造成损伤。
3. 稳定性：腺病毒能够长期稳定地将目标基因带入患者体内，从而使治疗效果持续较长时间。
应用场景腺病毒载体技术在基因治疗中的应用非常广泛。
以下是一些常见的应用场景：1. 遗传性疾病：例如，韦伯氏症、丙型肝炎、淋巴瘤等。
2. 癌症治疗：通过将目标基因导入到癌细胞中，从而抑制癌细胞的生长和扩散。
3. 免疫性疾病：例如，类风湿性关节炎、痛风等。
未来展望目前，腺病毒载体技术在基因治疗中的应用已经非常广泛。
未来，随着基因治疗技术的不断进步，腺病毒载体技术也将得到更加广泛的应用。
同时，腺病毒载体技术也面临着一些挑战和机遇。
例如，如何提高其安全性和效率，如何选择合适的载体搭配策略，以及如何应对基因治疗成本等问题。
我们相信，在全球范围内基因治疗的跨学科研究和技术推广的共同推动下，腺病毒载体技术将实现更广泛和深入的应用，为人类健康事业做出更大的贡献。
腺病毒疗法和基因治疗的研究及应用
腺病毒疗法和基因治疗的研究及应用近年来，腺病毒疗法和基因治疗已经成为医学界的热门话题。
腺病毒疗法是一种新型的治疗方法，其核心是利用腺病毒作为载体，将治疗药物或基因转移到人体细胞中，以达到治疗的目的。
而基因治疗则是将人类的遗传物质（包括DNA和RNA）用于治疗一系列疾病的方法，被誉为医学领域的“革命性技术”，其应用范围广泛，包括肿瘤、遗传性疾病、传染病等多个领域。
本文将对腺病毒疗法和基因治疗的研究及应用进行综述。
一、腺病毒疗法的研究及应用腺病毒疗法作为一种新型的治疗方法，具有以下几个优势：一是载体能力强，可以将多种药物或基因转移至人体内；二是稳定性好，容易扩大规模生产；三是安全性高，不会对人体造成副作用。
因此，腺病毒疗法被誉为“未来的癌症治疗方向”。
近年来，腺病毒疗法在肿瘤治疗领域中得到了广泛的应用。
比如，通过将治疗药物载入腺病毒中，可以实现药物的靶向传递，进而提高治疗效果。
而对于某些难治性肿瘤，腺病毒疗法则可以通过激活患者的免疫系统，使其发挥抗肿瘤的作用。
另外，腺病毒疗法还可以用于遗传性疾病的治疗。
例如，腺病毒载体可以携带正常的基因序列进入患者的细胞中，替代患者体内缺失或变异的基因，从而治疗纤维囊性病、先天性免疫缺陷综合症等遗传性疾病。
目前，腺病毒疗法还存在一些问题，如如何稳定保持基因或药物的传递效率、如何减少潜在的免疫反应等。
不过随着技术的不断进步，这些问题都有望得到有效的解决。
二、基因治疗的研究及应用基因治疗是指利用人类的遗传物质，以改变基因表达及相关蛋白质的产生和功能，从而达到治疗疾病的目的。
基因治疗的优势在于直接针对致病基因进行干预，治愈可能性更大。
目前，基因治疗在肿瘤、遗传性疾病等领域得到了广泛的应用。
在肿瘤的治疗中，基因治疗可以帮助克服传统治疗的限制，例如通过限制肿瘤细胞的生长和扩散，或者是提高患者对其他肿瘤治疗方式的反应能力等。
而在遗传性疾病的治疗中，基因治疗可以通过直接修复患者的缺陷DNA序列，从而达到治疗效果。
第三代腺病毒载体的研究进展和应用前景
第三代腺病毒载体的研究进展和应用前景class2switch recombination[J].Nat Immunol,2003,4:10232 102816 Liddament M T,Brown WL,Schumacher AJ,et al.APOBEC3F properties and hypermutation preferences indicate activity against HIV21in vivo[J].Curr Biol,2004,14(15):13852139117 Wiegand HL,Doehle BP,Bogerd HP,et al.A second human an2 tiretroviral factor,APOBEC3F,is suppressed by the HIV21and HIV22Vif proteins[J].EMBO J,2004,23(12):24512245818 Zheng YH,Irwin D,Kurosu T,et al.Human APOBEC3F is an2 other host factor that blocks human immunodeficiency virus type1 replication[J].J Virol,2004,78(11):60732607619Dussart S,Douaisi M,Courcoul M,et al.APOBEC3G Ubiquitina2 tion by Nedd421Favors its Packaging into HIV21Particles.J Mol Biol,2005,345:5472558110Douaisi M,Dussart S,Courcoul M,et al.The tyrosine kinases Fyn and Hck favor the recruitment of tyrosine2phosphorylated APOBEC3G into vif2defective HIV21particles.Biochemical and Biophysical Research Communications,2005,329:9172924111Navarro F,Bollman B,Chen H,et /doc/8708205567ec102de2bd89b1.html plementary function of the two catalytic domains of APOBEC3G.Virology,2005,333: 3742386112 Marin M,Rose KM,K ozak SL,et al.HIV21Vif protein binds the editing enzyme APOBEC3G and induces its degradation[J].Nat Med,2003,11:139821403113Sheehy AM,G addis NC,Malim MH.The antiretroviral enzyme APOBEC3G is degraded by the proteasome in responseto HIV21 Vif[J].Nat Med,2003,9:140421407114Kao S,Khan MA,Miyagi E,et al.The human immunodeficiency virus type1Vif protein reduces intracellular expression and inhibits packaging of APOBEC3G(CEM15),a cellular inhibitor of virus infectivity[J].J Virol,2003,77:11398211407115Mehle A,G oncalves J,Santa2marta M,et al.Phosphorylation of a novel SOCS2box regulates assembly of the HIV21Vif2Cul5com2plex that promotes APOBEC3G degradation[J].G enes and devel2 opment,2004,18:286122866116Yu YK,Xiao ZX,Elana S,et al.Selctive assembly of HIV21Vif2 Cul52ElonginB2ElonginC E3ubiquitin ligase complex through a novel SOCS box and upstream cysteines[J].G enes and develop2 ment,2004,18:286722872117 Yu X,Yu Y,Liu B,et al.Induction of APOBEC3G ubiquitina2 tion and degradation by an HIV21Vif2Cul52SCF complex[J].Sci2 ence,2003,302:105621060118 Kao S,Miyagi E,Khan MA,et al.Production of infectious hu2 man immunodeficiency virus type1does not require depletion of APOBEC3G from virusproducing cells[J].Retrovirology,2004, 1:27239119G oncalves J,Santa2marta M.HIV21Vif and APOBEC3G:Multi2 ple roads to one goal[J].Retrovirology,2004,1(1):28120 Liu B,Yu X,Luo K,et al.Influence of primate lentiviral Vif and proteasome inhibitors on human immunodeficiency virus type1 virion packaging of APOBEC3G[J].J Virol,2004,78:20722 2081121Xu H,Svarovskaia ES,Barr R,et al.A single amino acidsubsti2 tution in human APOBEC3G antiretroviral enzyme confers resis2 tance to HIV21virion infectivity factor2induced depletion[J].Proc Natl Acad Sci U.S. A.,2004,101(15):565225657122 Schrofelbauer B,Chen D,Landau NR.A single amino acid of APOBEC3G controls its species2specific interaction with virion in2 fectivity factor(Vif)[J].Proc Natl Acad Sci U.S. A.,2004, 101(11):392723932123 Bogerd HP,Doehle BP,Wiegand HL,et al.A single amino acid difference in the host APOBEC3G protein controls the primate species specificity of HIV type1virion infectivity factor[J].Proc Natl Acad Sci U.S. A.,2004,101(11):3770237741 (2003207223收稿;2003212222修回)第三代腺病毒载体的研究进展和应用前景林芳综述蔡荣钱程审阅【摘要】由于腺病毒载体转导目的基因高效率、低致病性、高滴度以及在体内不整合入宿主细胞染色体等优点,腺病毒载体已被认为是最为有效的转基因载体之一,并广泛运用于人类基因治疗。
腺病毒载体治疗技术进展
腺病毒载体治疗技术进展腺病毒载体（Adeno-associated virus，AAV）治疗技术是一种近年来快速发展的基因治疗技术，它利用AAV这种天然存在而又不会引起人体免疫反应的病毒作为载体，将需要治疗的基因序列植入到人体细胞中，达到治疗疾病的目的。
经过多年的实践和研究，AAV治疗技术已成为基因治疗领域最重要的技术之一，对多种罕见遗传疾病、神经退行性疾病、癌症等疾病的治疗取得了重要的进展。
一、AAV的优势AAV作为一种病毒，有着天然存在且不会引起人体免疫反应的特点，因此成为了基因治疗的一种理想载体。
AAV的基因序列较小，仅为4.7kb，但可以携带外来基因序列，且其在非细胞因子诱导的条件下高效地感染到人体细胞，对多种细胞和组织类型具有广泛的适应性。
AAV的稳定性也很高，对于外界环境的影响不敏感，而且其整合到人体细胞的基因组中的概率非常低，也减少了潜在的基因毒性。
二、AAV治疗技术的现状目前，AAV治疗技术在多个领域有着广泛的应用和研究。
其中最重要的是在罕见遗传病的治疗方面，比如肌肉萎缩症、糖原贮积病、囊性纤维化、黑色素瘤等多种遗传疾病。
此外，AAV治疗技术也在神经系统疾病、心血管疾病、器官损伤修复、癌症等领域的治疗和研究中得到了广泛的应用。
一些治疗在临床前试验中已经显示出了显著的治疗效果，例如在亚致死疾病疗法方面，AAV治疗技术已经显示出显著的效果。
例如，肌肉萎缩症等病种的治疗效果均已显著地提高，并且这种治疗方法也成为了其他疾病治疗的借鉴。
而对于一些不可治愈的疾病，AAV的基因治疗方法则为疾病的管理和控制提供了有效的手段。
三、AAV治疗技术的难点虽然AAV治疗技术取得了一些研究上的成果以及一些临床应用的效果，但技术仍有很多的难点需要克服。
AAV载体的设计和构建是其中一个重要的难点，因为AAV载体所能携带的基因序列往往受到构建载体的限制。
此外，AAV载体的制备和净化也是技术难点之一，因为AAV所需的纯度非常高，同时纯化的方法也非常复杂。
腺病毒载体研究进展
衡阳师范学院毕业论文（设计）题目：腺病毒载体研究进展所在系：生命科学系专业：生物科学学号：09300123作者姓名：彭赞平指导教师：杨海2013年5 月18 日衡阳师范学院毕业论文（设计）任务书衡阳师范学院本科生毕业论文（设计）开题报告衡阳师范学院毕业论文（设计）附件题目：腺病毒载体研究进展所在系：生命科学系专业：生物科学学号：09300123作者姓名：彭赞平指导教师：杨海2013年 5 月12日腺病毒载体研究进展生命科学系生物科学专业09300123彭赞平指导老师：杨海老师摘要：腺病毒因具有易感染性、宿主范围广、毒性低、使用安全、容纳量大、非整合性等特点,使得腺病毒载体成为基因转移中最有前途的基因载体之一。
但由于腺病毒载体在体内靶向性差、免疫原性强、半衰期短，限制了其在基因治疗中的作用。
为解决上述问题，可对腺病毒载体的衣壳蛋白进行遗传改造或表面修饰。
本文对腺病毒及腺病毒载体的研究进展做一简要综述，为进一步优化和改良腺病毒载体提供参考。
关键词：腺病毒；腺病毒载体；研究进展目录1 腺病毒的基本结构 (1)2 腺病毒的感染机理 (1)2.1 识别与粘附 (1)2.2基因组的转录 (2)2.3基因组复制 (2)2.4病毒颗粒的组装 (3)3腺病毒载体的构建 (3)3.1腺病毒载体的构建原理 (3)3.2腺病毒载体的构建方法 (4)3.2.1体外连接法 (4)3.2.2同源重组法 (4)4腺病毒载体的发展历程 (5)5腺病毒载体的应用 (7)6腺病毒载体的不足 (8)7腺病毒载体的改良与修饰 (8)7.1腺病毒PEG化 (9)7.2腺病毒衣壳的共价修饰 (9)8展望 (10)致谢 (11)参考文献 (12)1 腺病毒的基本结构腺病毒无囊膜，直径约70-90nm，呈二十面体立体对称[1]。
腺病毒含有一个大小在36kb左右线形双链DNA分子（Ad-DNA），两端具有末端反向重复序列（inverted terminal repeat，ITR），长103-162bp。
腺病毒载体在基因治疗中的应用
腺病毒载体在基因治疗中的应用随着生物技术和基因工程的进步，基因治疗已成为医学界的一项研究热点。
基因治疗是通过将基因载体导入到患者体内，使其表达所需的治疗基因来治疗疾病。
目前，常用的基因载体主要有病毒载体和非病毒载体两种。
而腺病毒载体作为一种常用的病毒载体之一，在基因治疗中也发挥着重要的作用。
一、腺病毒的基本特性腺病毒（adenovirus）是一个非常普遍的病毒，它具有双链DNA，嗜热、嗜酸性、不被包膜包裹的特性。
腺病毒可以感染哺乳动物、鸟类和爬行动物等广泛的生物群体，通常引起感冒和呼吸道感染等疾病。
腺病毒在基因治疗中的应用主要依赖于其良好的遗传学特性，尤其是在基因表达和基因传递方面的优越性。
二、腺病毒载体的构建方法腺病毒载体的构建是基因治疗中非常关键的过程。
腺病毒载体的核心是表达负责特定治疗效应的外源基因，因此，正确构建腺病毒载体是确保基因治疗成功的首要保障。
目前，常用的腺病毒载体构建方法主要有3种：重组病毒DNA技术、Homologous recombination（同源重组）和Cre-loxP介导的低剂量DNA用量。
这些方法都与分子生物学方法和技术密切相关，需要用到许多分子生物学技术和实验室设备。
三、腺病毒载体的应用领域腺病毒载体在基因治疗中的应用非常广泛，主要包括以下几个方面：1、遗传缺陷症的治疗。
遗传缺陷症一般是由于某个基因发生突变导致的，因此采用基因治疗是治疗遗传缺陷症最有前途的方法之一。
目前针对一些单基因病进行基因治疗的研究已经开始，例如囊性纤维化、遗传性凝血因子Ⅷ、骨髓瘤等。
研究表明，采用腺病毒载体进行治疗的效果是非常显著的。
2、癌症的治疗。
癌症是一种破坏人们健康的致命疾病。
而采用腺病毒载体进行基因治疗，则能针对肿瘤细胞特异性基因、癌症相关基因和免疫调节基因等进行治疗，其表现形式可以是基因靶向方案、病毒粒子攻击方案等，有效地减轻患者的痛苦和提高生存质量。
3、神经系统疾病的治疗。
神经系统疾病一直是临床医学难以攻克的大难题之一。
腺病毒介导的基因治疗在胃癌中的研究进展
恶性 肿 瘤 。 胃癌 预后 很差 ， ５年生 存 率不 到 ２ ０ ％［ ２ １ 。 当 前 胃癌 的最佳 治 疗方 法仍 然 是手 术 完整 切 除肿 瘤组
织并 清 扫 周 围淋 巴结 ， 相 比手 术 而 言 ， 激素治疗 、 放 疗 以及 化学药 物 治疗 的效 果 仍 然有 限 。 因此急 需找 到新 的 治疗方 法 。 胃癌 是一 种 由多 种 过 程演 变 而来 的基 因疾 病 ，
用 机制 对研 究基 因治疗 的进 展将 是 非 常重 要 的进 步 意义。 基 于此 项理 论 ， 如 果相 关 的分子 机制 引用 到 癌 细 胞 那 么癌 症 可 能 会被 治 愈 ， 应 用 基 因治 疗 将 成 为 新 兴 的癌症 替代 疗 法 。癌基 因治疗 包 括 ３ 个基本 目 标 ：首 先 是 抑 制 癌 细 胞 的 生长 并 诱 导 癌 细 胞 的 凋 亡； 其 次抑 制肿 瘤 细胞 向其 他部 位转 移 ： 最 后基 因治 疗 应仅 用 于癌细 胞 治疗上 。 不 能有 悖伦 理 问题
用于 基 因治疗 。首先 ， 他 们无 处不 在 ： 腺 病毒 已从大
量不 同物 种 中分 离 出来 ， 已报 告 超 过 １ ０ ０个 不 同种
的血 清 型 ， 而 在 人体 中就 有 ４ ３种 。和其 他现 有 的载 体相 比， 腺 病毒 载 体 能 迅 速感 染 人 体 大 部 分 细胞 并
产生 高水 平 的基 因转 移 。 腺病 毒具 有 嗜上皮 细 胞性 ， 而人 类 大多数 肿 瘤就 是 上皮 细胞 来 源 的 。它 能 影 响
细 胞类 型使 其 发 生显 著 变 化 ， 不 管 是 分 裂 细 胞 还是
腺相关病毒载体的研究进展
腺相关病毒载体的研究进展摘要：目的：本论文旨在综述腺相关病毒载体在基因治疗和免疫治疗领域的研究进展，探讨其在治疗和潜在应用方面的最新发展。
方法：通过查阅相关文献，收集和整理了与腺相关病毒载体有关的研究成果，并结合国内外相关研究进行分析。
结果：在基因治疗方面，腺相关病毒载体已被广泛应用于遗传性疾病、癌症和神经系统疾病等的治疗。
不仅可以有效传递修复基因，还可以调节基因表达，并显示出良好的生物安全性和耐受性特性。
另外，在免疫治疗方面，腺相关病毒载体可用于疫苗开发和免疫调节，提供了一种新的治疗策略。
腺相关病毒载体的研究工作也包括载体优化、体内外评价和治疗效果验证等方面。
结论：腺相关病毒载体在基因治疗和免疫治疗方面展现出了巨大的前景和潜力。
通过持续的研究和优化，它们有望成为治疗遗传性疾病、肿瘤和其他复杂疾病的有效工具。
然而，仍然需要进一步的研究来解决其在临床应用中可能存在的问题，并确保其安全性和有效性。
关键词：腺相关病毒载体；基因治疗；免疫治疗引言腺相关病毒载体作为基因治疗和免疫治疗的工具，在疾病治疗和防控领域具有巨大的潜力。
本文通过综述相关文献，总结和讨论了腺相关病毒载体在基因治疗和免疫治疗方面的研究进展。
这些载体已被广泛应用于遗传性疾病、癌症和神经系统疾病等的治疗，并取得了显著效果。
此外，腺相关病毒载体具有良好的生物安全性和耐受性特性，为治疗提供了更大的安全性和可行性。
在免疫治疗方面，腺相关病毒载体可以用于疫苗开发和免疫调节，为免疫治疗提供新的策略。
然而，仍需进一步研究和探索，以优化腺相关病毒载体的性能和应用。
1资料与方法1.1一般资料本文所使用的资料主要包括相关的研究文献、学术论文和专业书籍。
这些资料覆盖了腺相关病毒载体在基因治疗和免疫治疗领域的研究进展、应用案例、载体优化技术等方面的内容。
通过对这些资料的收集、整理和分析，我们可以全面了解和评估腺相关病毒载体的研究进展。
1.2方法通过在学术数据库（如PubMed、Web of Science等）中进行关键词搜索，选择相关的研究文献和学术论文。
腺病毒载体在基因治疗中的应用
腺病毒载体在基因治疗中的应用随着科技的不断进步，基因治疗已经成为医学领域的一大亮点。
作为一种治疗疾病的新方法，基因治疗已经在许多领域得到了广泛的应用。
在基因治疗中，腺病毒载体作为一种重要的载体，扮演着十分重要的角色。
腺病毒载体简介腺病毒是一种小的DNA病毒，主要感染哺乳动物和人类。
由于其具有高传染性和低病原性，因此在基因治疗中得到了广泛的应用。
腺病毒载体主要用于传递外源基因到宿主细胞中，从而达到治疗的目的。
与其他传递外源基因的载体相比，腺病毒载体具有很多优点。
比如，腺病毒载体可以被广泛应用于各种类型的细胞中，可以传递较大的基因载荷，且具有持续的基因表达效果。
腺病毒载体在基因治疗中的应用基因治疗的核心思想是通过在人体内传递外源基因，从而改变人体细胞的基因表达状态，从而达到治疗疾病的效果。
腺病毒载体在这个过程中发挥着十分重要的作用。
由于腺病毒载体具有较高的稳定性和对于细胞壁的穿透性，因此在基因治疗中广泛的应用。
具体而言，腺病毒载体包括一系列的基因，这些基因能够把外源基因有效的传送到宿主细胞内，并在内部进行基因表达。
在现代医学中，基因治疗在多种疾病的治疗中得到了广泛的应用，如血液疾病、遗传疾病、肿瘤等。
其中，腺病毒载体在基因治疗中发挥着至关重要的作用。
在基因治疗中，可以通过注射腺病毒载体来传递外源基因，从而达到治疗的目的。
一般来说，基因治疗包括两种方式，基因治疗和基因修饰。
在基因治疗中，腺病毒载体通过携带的外源基因对疾病进行治疗。
而在基因修饰中，腺病毒载体则通过携带的外源基因改变人体细胞的基因表达状态，从而起到治疗疾病的效果。
总结随着科技的不断发展，基因治疗已经成为医学领域的一大亮点。
在基因治疗中，腺病毒载体作为一种重要的载体，扮演着十分重要的角色。
腺病毒载体具有较高的稳定性和对于细胞壁的穿透性，因此在基因治疗中被广泛应用。
通过注射腺病毒载体，可以传递外源基因来治疗疾病，从而改变人体细胞的基因表达状态。
专题八作业：基因治疗中病毒载体的研究进展
专题八作业：基因治疗中病毒载体的研究进展？基因治疗自1990年成功应用于重症联合免疫缺陷综合征(SCID-X1)患者的治疗，已走过了十几个年头，给人类一些疑难杂症如肿瘤的治愈带来了曙光。
但其发展却屡遭挫折，比如近来发现经基因治疗的SCID-X1患者之一出现了类白血病反应，可能是基因随机整合染色体所致，使得人们不得不以怀疑的目光审视它的成长。
而基因载体是阻碍其发展的主要因素，主要表现为安全性、靶向性、转染效率不高及表达时问短等问题。
病毒载体是目前临床基因治疗中应用最多的载体，各种病毒载体有自身的利弊，除了对它们的选择外，病毒载体只有通过自身的不断改造完善，才能更好的服务于基因治疗，进而真正造福于人类。
1 逆转录病毒(retrovirus vectors，RVJ载体逆转录病毒载体基因转移系统包括两部分：一部分是用外源基因替换病毒结构基因的逆转录病毒载体；另一部分是包装细胞的基因组DNA中整合了逆转录病毒结构基因。
1990年世界上首例临床基因治疗采用的就是逆转录病毒载体n]。
到目前为止，RV载体是基因治疗临床试验使用最多的载体，较常用的是基于moloney鼠白血病病毒(MMLV)改造而来的各种Rv载体。
RV载体具有基因表达持久而稳定、转染效率较高等优点，但只能感染分裂期细胞，载体容量<8kb，与宿主细胞基因组的随机整合可引起基因突变及产生可复制的野生型病毒等危险，故需要进一步的改造完善。
将水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)整合于逆转录病毒包膜中能加速各种宿主细胞对其进行膜融合和内吞，具有广泛的宿主范围和更高的转染效率，可高效的转染静止细胞，并能抵抗血清补体灭活的作用。
诸多的优点使该载体在造血系统疾病和肿瘤的基因治疗方面有潜在的应用前景。
为了提高逆转录病毒感染靶细胞的特异性，降低其潜在的危险性，可以在原来的病毒Env蛋白上接上一段具有特异靶向的多肽，目前应用较多的是单链可变区抗体(acFV)；还可通过插入组织特异启动子实现靶向表达。
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基因治疗用腺病毒载体研究进展录入：wei 来源：Internet 时间：2008-9-20 【字体：大中小】〖双击滚屏〗【摘要】近十年来, 腺病毒载体已经成为了基因治疗的有效载体, 各种重组腺病毒在抗肿瘤和治疗遗传病等方面发挥了重要作用。
本文介绍了腺病毒载体系统的特点, 腺病毒的感染动力学及包装细胞代谢的变化和定量计数方法, 腺病毒生产和纯化方法及其产品的质量控制, 对腺病毒生产的发展趋势和存在问题进行了阐述。
【关键词】基因治疗腺病毒载体生产方法【本页关键词】省级期刊征稿硕士毕业论文写作【正文】基因治疗指的是把功能基因导入病人体内使之表达, 并因表达产物——蛋白质发挥了功能而使疾病得以治疗。
人类疾病的发生都是人体细胞本身的基因改变或由外源病原体的基因及产物与人体相互作用的结果。
长期以来科学家们思考人类是否能依靠人本身的或是外源的遗传物质来治疗疾病, 这就是基因治疗的含义。
从上世纪九十年代开始, 腺病毒就作为了基因治疗的有效载体, 已经报道的1000 多种基因治疗的临床方案中, 约26% 是用腺病毒作为载体。
腺病毒载体可以在包装细胞内高滴度复制, 是上呼吸道自然存在的温和病毒, 可以感染多种分裂期和非分裂期的细胞。
第一代腺病毒载体构建的目的是为了治疗几种单基因疾病, 这种病毒载体通常删除了E1 和E3 区以便插入目的基因[1 ] , 而且要全身重复给药才能将目的基因转入靶细胞内。
第二代腺病毒是复制缺陷型病毒, 人们进一步删除了E2a, E2b 或E4, 降低了免疫原性及RCA 的出现。
人们又构建了第三代腺病毒载体, 也叫假病毒或辅助依赖性腺病毒[2- 4 ]。
1、腺病毒的感染动力学及包装细胞代谢的变化删除E1 和E3 区的腺病毒基因组长约36kb, 其容纳外源基因的的长度在7～ 8kb。
腺病毒感染包装细胞的过程可以分为三步: 一是扩散和吸附, 病毒扩散并吸附在细胞表面。
二是结合并扩散入细胞核, 这一阶段通常通过细胞的内吞作用来完成。
三是基因转录及DNA 复制。
在动物细胞的大规模培养中, 限制细胞生长的因素很多, 包括所需营养的缺乏、代谢副产物的抑制、传氧速率的限制、pH 的变化和剪切力的损伤等[5 ] , 其中营养物质对细胞的影响尤为重要。
在培养基中葡萄糖是主要的碳源和能源物质, 谷氨酞胺则是主要的氮源和能源物质, 它们在动物细胞的生长、繁殖和代谢产物形成过程中起着重要作用。
葡萄糖是主要的碳源和能源物质, 经细胞内的代谢过程, 绝大部分生成乳酸释放到培养液中[6 ] , 同时提供能量(A TP) 和还原力(NADH) , 少部分通过磷酸戊糖途径生成核酸的前体一核糖, 仅有极少部分进入TCA 循环[7, 8 ] , 并且直接参与了谷氨酞胺的代谢过程。
2、腺病毒的定量和计数方法在研发新生产工艺的早期阶段容易忽视的一个重要问题就是腺病毒的定量, 定量问题在腺病毒基因治疗的最终临床应用中更为重要。
现在生产企业和学术研究人员已经充分认识到了腺病毒定量的重要性。
为了不同实验室间数据能进行相互比较,美国成立了一个腺病毒参考物质工作组, 目的是建立腺病毒的参考标准品。
世界上所有的研究和开发机构都可以获得此标准,以便对腺病毒的定量方法进行标准化以及方便对临床前和临床资料的解释。
人们建立了阴离子交换的高压液相方法定量检测腺病毒颗粒, 该方法的可重复性和准确性较紫外分光光度计法显著提高[9 ]。
其它的方法还有荧光标记病毒DNA 以及测定病毒六邻体蛋白的方法等。
有趣的是人们注意到V ellekamp 等[10 ]近来报道了关于观察不同色谱柱纯化的腺病毒批次间病毒空壳的差异情况。
3、腺病毒的生产方法腺病毒生产方法根据包装细胞不同而分为贴壁细胞培养与悬浮细胞培养。
主要用于E1 区缺失腺病毒生产的包装细胞为起源于人胚肾的293 细胞, 此细胞包含有腺病毒缺失的E1 区。
许多悬浮和无血清驯化的细胞克隆在各个实验室可以获得, 293细胞的相关生物学特性现在已经被详细阐明, 而且正在用于符合GM P 标准的工业化生产中。
免费获得该细胞系以及生产的病毒滴度高是293 细胞的主要优点。
对于商业化生产而言, 悬浮细胞系比较适应大规模生产, 而且悬浮培养的细胞一般可以在无血清培养体系中培养, 不添加任何其它动物来源的添加剂, 这样就有利于分离纯化。
灌注培养是对流加模式改进后的一种培养方法, 通过不断更换新鲜培基,同时应用细胞截留装置使细胞保留于生物反应器内, 可以顺利实现培基的原位交换。
一些作者建议用灌注培养的方法获得高密度的细胞, 然后将细胞转移到其它生物反应器中生产腺病毒。
灌注培养模式已经得到了广泛的认可和接受, 并且成为腺病毒大量生产最常用的培养模式。
4、腺病毒的纯化方法重组腺病毒的纯化是大规模生产中的关键问题, 最经典的纯化方法是两步氯化铯密度梯度超速离心法, 此方法是生产小量临床级产品的有效方法。
但这一工艺放大困难, 需要建立适用于大规模生产的纯化技术。
人们不断地努力研发可用于大规模生产的腺病毒分离纯化工艺, 如离子交换、疏水性相互作用、金属鳌合和凝胶过滤等[11, 12 ]。
近年来阴离子交换树脂已经逐渐成为主要分离纯化手段, 得到了较好的结果。
经常使用的阴离子交换树脂主要有Q Sepharo se XL、Source 15Q 以及DEA E 等, 回收率均能达到65% 以上, 分离效果也较好。
Green 等[13 ]提出离子交换层析后使用聚四氟乙烯树脂层析法除去第一步离子交换未除尽的宿主和病毒蛋白, 还有学者提出采用离子交换和凝胶过滤相联合的方法进行纯化, A rcand 等[14 ] 提出先进行F ractogelEMD DEA E - 650 离子交换层析, 而后进行Sephacryl S -400HR 凝胶过滤的纯化方法。
最近有文献报道[15, 16 ] , 利用阳离子去垢剂沉淀宿主DNA 方法来分离纯化腺病毒, 他们的方法是首先在细胞裂解液中加入氯化十六烷基嘧啶或溴化度灭芬等阳离子去垢剂进行充分搅拌混合, 此时宿主DNA 就会被沉淀, 随后经过两次超滤去除DNA 沉淀, 最后再经过Source 15Q 分离纯化, 他们报道最后腺病毒的回收率均大于50%。
这种方法的最大优点是费用低廉, 容易进行放大, 非常适合商业化生产。
5、腺病毒产品的质量控制生产过程中复制完全型腺病毒的测定非常关键, 通常是用— 74 —科技信息高校理科研究敏感细胞的细胞致死效应来测定, 但是这种方法周期长, 现在更灵敏的方法是PCR. RCA 的出现促使人们去寻找更可靠的包装细胞株。
对重组腺病毒的质量控制贯穿于整个生产纯化过程, 包括包装细胞、病毒、粗分离产品、纯化产品和最终产品。
Roetsch等人[17, 18 ]从稳定性、有效性和纯度三个方面详细报道了基因治疗中重组腺病毒的质量控制手段。
稳定性包括病毒基因组的稳定性和治疗基因表达的稳定性, 前者的检测用酶切、电泳和Southern blo t 等方法。
有效性包括总病毒颗粒数与病毒滴度之间的比例和具有感染效力的病毒颗粒中治疗基因有效表达的比例, 在临床治疗中病人接受的剂量用病毒总颗粒数表示。
所以上述两种比例就显得尤为重要。
纯度包括野生型RCA 的检测、杂蛋白污染检测, RCA s 的检测用生物法和PCR 法, 杂蛋白污染的检测用反相HPLC 和MALD I- TO F 质谱联用法。
6、腺病毒生产的发展趋势与存在问题在过去几年中, 新的腺病毒载体不断研制成功, 对腺病毒载体的大规模生产工艺提出了迫切的要求, 人们尝试了各种方法,通过腺病毒载体生产工艺的改进, 使得重组腺病毒的大规模生产成为可能。
包装细胞的培养工艺逐渐转向无血清悬浮灌注培养方式, 以增加细胞密度, 提高病毒产量。
由于目前大量的研究主要集中在包装细胞的培养工艺和腺病毒的纯化和计数方法,病毒在宿主细胞中的DNA 复制和成熟的机制知之甚少, 最终提高病毒的产率和滴度以及完善流加和灌注工艺还有赖于对病毒复制与成熟机制的了解。
在整个重组腺病毒的生产纯化工艺中,纯化和计数是比较薄弱的环节, 虽然目前探索了不少的纯化计数方法, 但是其中所用到的设备和材料价格昂贵, 所以还有待进一步开发适合大规模纯化要求的设备和材料, 或者成本低廉的纯化工艺。
质量控制是生产中非常重要的一环, 它应该包括两方面的内容: 首先, 它不仅是对最终产品质量的把关, 还应该贯穿在整个生产过程中; 其次, 国内和国外目前对于应用在临床的重组腺病毒载体的质量标准还很不完善, 所以在质量标准的制定方面应加大研究力度, 从而提高产品的治疗效果, 减少副作用的发生。
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