壳聚糖的改性及抑菌性研究

　第46卷2010年第3期 西　北　师　范　大　学　学　报(自然科学版)　Vol 146　2010　No 13 Journal of Northwest Normal University (Natural Science )　

收稿日期:2009Ο10Ο13;修改稿收到日期:2009Ο12Ο23

基金项目:甘肃省自然科学基金资助项目(0710J RZA108);甘肃省高分子材料重点实验室基金资助项目

作者简介:宋玉民(1951—

),女,甘肃张掖人,教授,博士研究生导师.主要研究方向为生物无机化学.E Οmail :songym @nwnu 1edu 1cn

壳聚糖的改性及抑菌性研究

宋玉民1,常彩萍1,达文燕2,栾尼娜1

(1.西北师范大学化学化工学院,甘肃兰州　730070;2.西北师范大学生命科学学院,甘肃兰州　730070)

摘　要:在氮气保护下,以硝酸铈铵为氧化还原引发剂,冰乙酸为溶剂,通过壳聚糖(CS )与盐酸聚六亚甲基胍盐衍生物(PH GH )的接枝共聚反应,制备出了具有较好水溶性的CS/PHGH 材料.采用红外光谱、元素分析对该材料进行了表征,并对其抑菌性实验进行了研究.结果表明,合成的水溶性CS/PH GH 对真菌、革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的抑制作用均优于壳聚糖,尤其对真菌的抑菌效果最灵敏,其最小抑菌浓度(MIC )为0139mg ・mL -1,抑菌圈直径为21mm.关键词:壳聚糖(CS );盐酸聚六亚甲基胍(P H GH );接枝共聚;抑菌性中图分类号:O 63611 文献标识码:A 文章编号:10012988Ⅹ(2010)0320071204

Modification of chitosan and it s antibacterial

SON G Yu 2min 1,C HAN G Cai 2ping 1,DA Wen 2yan 2,L UAN Ni 2na 1

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering ,Northwest Normal University ,Lanzhou 730070,G ansu ,China ;

2.College of Life Science ,Northwest Normal University ,Lanzhou ,730070,G ansu ,China )

Abstract :Grafting guanidine polymer (PH GH )onto chitosan (CS )is conducted by free 2radical polymerization using ceric ammonium nit rate as an initiator in t he acetic acid solution under nitrogen at mo sp here and t he CS/P H GH of new material is produced.The F T 2IR ,element analysis of new material is tested.And t he antibacterial of t he new material is investigated.The result s show t hat t he antibacterial activity of CS/P H GH is better t han t hat of CS for f ungus ,gram 2po sitive bacteria and gram 2negative bacteria ,especially for f ungus.The minimal inhibitory concent ration (M IC )is 0139mg ・mL -1for f ungus ,t he diameter of t he inhibition zones is 21mm.

K ey w ords :chito san (CS );polyhexamet hylene guanidine hydrochloride (P H GH );graft copolymer ;antibacterial

随着生活质量的提高以及现代科学技术的飞速发展,人们不可避免地接触到各种各样的细菌、真菌等微生物.这些微生物在特定条件下迅速繁殖,并通过各种接触方式传播疾病,影响人们的健康,故抗菌材料的研究引起学者们的广泛关注.壳聚糖(CS )是甲壳素的衍生物,是唯一的碱性天然多糖,具有许多独特的物理、化学性质和生物功能[1].然而通常情况下,CS 仅溶于酸或酸性溶液,直接限制了它在各方面的应用.由于CS 分子内存在游离的氨基、羟基,可进一步改性,其衍生物不但溶

解性大大增加,且抑菌效果也显著增强.有关CS 的抑菌性及生物相溶性,国内外均有报道[2,3],杜予民等报道了一种壳聚糖胍盐衍生物的制备方法[4],但对改性后壳聚糖的溶解性,对细菌真菌的最小抑菌浓度、抑菌圈直径、温度与时间对菌种生长的影响均未见报道.笔者针对壳聚糖难溶于水的特点,通过甲基丙烯酸缩水甘油酯与盐酸聚六亚甲基胍的反应引入乙烯基,以硝酸铈铵为氧化还原引发剂,与壳聚糖反应制备出水溶性较好的壳聚糖胍盐衍生物,并研究了新材料的抑菌性质.

1

7

西　北　师　范　大　学　学　报(自然科学版) 第46卷　Journal of Northwest Normal University(Natural Science) Vol146　

1　实验部分

111　主要原料及仪器

壳聚糖(CS),脱乙酰度≥90%;盐酸胍, 98%;1,62己二胺、冰乙酸、硝酸铈铵(CAN)均为分析纯试剂;甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)使用前减压蒸馏,取75℃的馏分.真菌(白色念珠菌)、革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌)、革兰氏阴性菌(大肠杆菌),营养肉汤培养基.

主要仪器:TJ270230型红外光谱仪,K Br压片;元素分析仪;7222型分光光度计;LDZX4OCI 型立式自动压力蒸汽灭菌锅(上海中安医疗器械厂)生化培养箱(国华电器);SNCJ1BU无菌操作台(苏净集团安泰公司).

112　合成过程

等物质量的1,62己二胺和盐酸胍在120℃熔融反应015h,待N H3释放后,升温180℃继续反应2h,然后快速冷却至室温,得到白色或者乳白色的、无异味的固体反应产物[5],用P H GC表示.

将518788g的P H GC溶于50mL体积比为2∶1∶1的乙醇、丙酮和水的混合溶液中,412930g 的GMA溶于4mL的丙酮,将上述两者混合,氮气保护下于40～45℃搅拌反应6h,然后旋转蒸发得到产物P H GC2GMA(P H GH)[6].

将016909g的P H GH溶于1312mL等物质量的蒸馏水和乙酸混合溶液中,加入210425g壳聚糖并搅拌,通N210min后加入010148g的硝酸铈铵,用011mg・L-1的稀硝酸调节p H为5～6,N2氛围中搅拌反应3h,丙酮沉降,得到粗接枝产物.用乙醇抽提8h,真空干燥,研磨得到316568 g纯接枝产物.对产物进行红外和元素分析表征.接枝率(y)根据[7]

y=(m1-m0)/m0×100%计算,

式中m1为抽提后壳聚糖胍盐衍生物质量(g);m0为壳聚糖质量(g).

113　抑菌性测试

最小抑菌浓度:采用试管倍比稀释法.无菌箱中,在12支无菌试管中加入等体积的营养肉汤液体培养基,1号试管中加入25mg・mL-1受试药液(用无菌水配制受试药壳聚糖胍盐衍生物),倍比稀释至10号试管,然后1到11号试管中各加入012 mL菌液(11号为加培养基和菌液的对照试管,12号为只加培养基的空白对照管),将试管在恒温振荡箱中恒温(细菌37℃,真菌28℃)振荡18h,之后肉眼观察抑菌性(出现浑浊现象为细菌生长的试管,反之亦然).记录出现浑浊现象的前一号试管中受试药液浓度即为最小抑菌浓度.

抑菌圈直径测定:采用滤纸片法.经3次共孵育54h的4种菌液各012mL分别接种于营养肉汤琼脂平板上,然后在平板上置蘸有浓度为25mg・mL-1壳聚糖胍盐衍生物溶液、壳聚糖(壳聚糖用加少许乙酸的无菌水溶解)溶液和无菌水的3张滤纸片,将平板于37℃(细菌)和28℃(真菌)孵箱中培养18h后测抑菌圈直径,每组实验均重复3次.

温度对细菌(真菌)生长的影响:在培养至对数期的菌悬液(1×105CFU・mL-1)中加入受试药液,终浓度为10mg・mL-1,并做空白对照实验.分别在20,30,40,50℃培养18h,然后稀释涂于平板,计算出每平板的菌落数,以菌落数为纵坐标,温度为横坐标作图.

作用时间对细菌(真菌)生长的影响:在培养至对数期的菌悬液(1×105CFU・mL-1)中加入受试药液,终浓度为10mg・mL-1,并做空白对照实验.30℃温箱孵育,分别培养50,100,150,200, 250min后,用7222型分光光度计于600nm测定OD值(浊度)[8].以OD值为纵坐标,时间为横坐标作图.

2　结果与讨论

211　壳聚糖胍盐衍生物红外光谱与元素分析图1为壳聚糖胍盐衍生物(a)与壳聚糖(b)的红外对比图.由图1可见,(a)在1729cm-1处为P H GH中酯羰基(C O)的伸缩振动吸收峰, 1637,3433cm-1处亚胺基与羟基的吸收峰比(b)的强,原因为P H GH中存在亚胺基与羟基使吸收峰变宽,此数据与文献[6]报道的数据一致.表1为壳聚糖胍盐衍生物的元素分析数据,其中氮元素的含量为4177%,比壳聚糖的含氮量低,因为壳聚糖胍盐衍生物的分子量比壳聚糖的大.按照接枝率公式得出接枝率为79%.以上结果均表明胍盐衍生物接枝到壳聚糖骨架上.

表1　壳聚糖胍盐衍生物的元素分析

Tab1The element analysis of guanidine

of chitosan derivatives

接枝产物主要组成元素C/%H/%N/%测定值4214961044177

27