酶的定向固定化方法
酶固定化方法及载体特性
酶固定化一般方法及载体特性酶是重要的生物催化剂，具有专一性强、催化效率高、无污染、反应条件温和等特点，在制药、食品、环保、酿造、能源等领域都得到了广泛的应用。
但在实际应用中，酶也存在许多不足，如大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活，不够稳定；与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用，这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产；并且分离纯化困难，也会导致生产成本的提高等。
固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971 年酶工程会议上被推荐使用的。
随着固定化技术的发展，出现固定化菌体。
1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。
固定化酶技术为这些问题的解决提供了有效的手段，从而成为酶工程领域中最为活跃的研究方向之一。
1酶固定化的传统方法关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进，酶载体推荐创科催化酶载体树脂。
1.1 吸附法吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。
显著特点是：工艺简便及条件温和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶失活后可重新活化，载体也可再生。
但要求载体的比表面积要求较大，有活泼的表面。
1.2包埋法包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。
这个方法比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物不适用。
1)网格型将酶或包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。
也称为凝胶包埋法。
2)微囊型把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。
由于形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
1.3结合法酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定的方法，叫离子键结合法。
酶的固定化技术
摘要：酶的固定化技术是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。
酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。
经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。
因此酶的固定化技术研究已成为十分引人注目的领域。
本文简要介绍了固定化酶技术的概念、制备方法(包括传统固定化技术、传统固定化技术的改进方法、新型固定化技术) 及其在化学化工、食品行业、临床医药、生物传感器和环境科学等领域中的应用现状与存在的问题,并对固定化酶技术的应用前景进行了展望。
关键词：固定化酶；制备；应用；磁性载体；定向固定固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍开展。
酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。
与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。
固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。
固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。
物理方法包括物理吸附法、包埋法等。
物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。
但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。
化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。
酶六章酶的固定化
迄今已有许多酶用离子结合 法固定化，例如1969年最早应用 于工业生产的固定化氨基酰化酶 就是使用多糖类阴离子交换剂 DEAE-葡聚糖凝胶固定化的。
（二）化学结合法
——1 共价结合法 ——2 交联法
共价偶联法
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
• 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相
N OH
O
O O CO N
O
P-NH2
O CO NH P
CH2COOH SOCl2
CH2COCl
P-NH2 pH8~9
CH2CONH P
多胺载体
CH2NH2 Cl-CS-Cl
CH2 N C S P-NH2
HO CH2 N C NHP
CH2COOH
MeOH HCl
CH2COOMe NH2NH2
CH2CON3 P-NH2
O OH O CH2CH2 O S OH
O
O OH O CH2CH2 O S OH
O
NH2 N N-P
无机载体
——可采用直接法和涂层法（用 活化的聚合物如白蛋白或葡聚糖 涂层）
O P-NH2
Si (CH2)3NH CH(CH2)3CHO
O
(1)
OHC-(CH2)3CHO
O Si (CH2)3NH CH(CH2)3CH=N-P O
O Si OH H2N(CH2)3Si (OEt)3 O Si OH
制备固定化酶要根据不同情况 （不同酶、不同应用目的和应用环境） 来选择不同的方法，但是无论如何选 择，确定什么样的方法，都要遵循几 个基本原则
原则1
——必须注意维持酶的催化活性 及专一性，保持酶原有的专一性、 高效催化能力和在常温常压下能 起催化反应的特点。
酶的定向固定化方法
五 总结
人们在化妆品中使用酶类抑制剂的兴趣在增 人们在化妆品中使用酶类抑制剂的兴趣在增 加，总体应用酶的区域已经显示有显著的保 护皮肤的好处： 护皮肤的好处：它们可以帮助减缓老化的一 些明显迹象， 些明显迹象，以及环境对表皮的一些损害作 因此酶类能有效的作用于皮肤表面。 用。因此酶类能有效的作用于皮肤表面。
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
另，虽然药物科学显示，合成非常类似过 虽然药物科学显示， 渡态并键合酶类的强有力的抑制剂是可能 最常见的是， 的。最常见的是，抑制作用出现在一个分 子干预酶作用底物与酶类键合的时候。 子干预酶作用底物与酶类键合的时候。 但是其中很多是指那些美白皮肤的抗酪 氨酸酶活性的酶类抑制剂， 氨酸酶活性的酶类抑制剂，还有那些防止 弹性蛋白交联，导致皮肤丧失弹性 丧失弹性的抗弹 弹性蛋白交联，导致皮肤丧失弹性的抗弹 性蛋白酶活性的酶类抑制剂。 性蛋白酶活性的酶类抑制剂。但是这些酶 类抑制剂化妆品是通过非竞争性键合酶类， 类抑制剂化妆品是通过非竞争性键合酶类， 改变酶的结构以致酶几乎或者完全失活来 改变酶的结构以致酶几乎或者完全失活来 发挥作用。 发挥作用。
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所谓的固定化酶，是指在一定空间内呈闭 所谓的固定化酶，是指在一定空间内呈闭 一定空间内呈 锁状态存在的酶 存在的酶， 连续的进行反应 的进行反应， 锁状态存在的酶，能连续的进行反应，反 应后的酶可以回收重复使用 回收重复使用。 应后的酶可以回收重复使用。固定化酶在 分类上属于修饰酶，而非天然酶。 分类上属于修饰酶，而非天然酶。
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表1.1对固定化酶与游离酶的优缺点进行了比较 对固定化酶与游离酶的优缺点进行了比较
酶的定向进化的方法
酶的定向进化的方法酶是生物体内一类重要的催化剂，可加速生物体内化学反应的速率。
然而，自然界中存在的酶并不能完全满足人类的需求，因此科学家研究出了一种方法，即酶的定向进化，通过改变酶的结构和功能，使其具有更广泛的应用价值。
酶的定向进化是一种通过人工手段，模拟自然界的进化过程，从而改变酶的特性和功能的方法。
这种方法通过遗传学和分子生物学的手段，使酶在短时间内经历大量的变异和选择，从而获得新的性状和功能。
酶的定向进化主要包括以下几个步骤。
首先，选择一个目标酶，确定欲改变的特性和功能。
然后，通过基因工程的手段，产生一系列具有随机变异的酶库。
接下来，利用高通量筛选技术，对酶库进行筛选，选择出具有目标特性和功能的酶。
最后，对筛选出的酶进行进一步的优化和改良，以获得更理想的酶。
酶的定向进化的关键在于变异和选择。
变异是指通过基因工程手段，对酶的基因进行随机的改变，从而改变酶的结构和功能。
变异可以通过多种方法实现，如DNA重组、突变和错配PCR等。
选择是指通过对酶的筛选和评价，选择具有目标特性和功能的酶。
选择可以通过高通量筛选技术和活性测定等方法实现。
酶的定向进化可以用于改变酶的催化活性、底物特异性、热稳定性、耐酸碱性等特性。
例如，科学家可以通过酶的定向进化，使其在高温环境下仍能保持稳定的催化活性，从而应用于工业生产中。
此外，酶的定向进化还可以改变酶的底物特异性，使其能催化更多种类的化学反应，从而实现新药物的合成和有机合成的高效转化。
酶的定向进化在生物技术和工业生产中具有广泛的应用前景。
通过酶的定向进化，科学家可以设计和合成出具有特定功能和特性的酶，用于生物催化、药物合成、环境修复等领域。
此外，酶的定向进化还可以用于改良已有酶的性能，提高其催化效率和稳定性。
然而，酶的定向进化也存在一些挑战和限制。
首先，酶的定向进化是一项复杂而耗时的过程，需要经过多个步骤和多轮筛选。
其次，酶的定向进化的成功率并不高，往往需要大量的实验和尝试。
第五章-固定化酶
2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。 • 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤
维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶
高级结构变化少，酶活力损失很少。
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法
• 相对活力：固定化酶活力与同量蛋白量
的溶液酶活力的比值
固定化酶活力 相对活力 100% 溶液酶总活力 残留酶活力
四、固定化酶（细胞）的半衰期
• t1/2 ：固定化酶（细胞）的活力下降为最 初活力1/2所经历的连续工作时间；衡量 操作稳定性的指标。
Fig. 2. Kinetic of ROL adsorption on the silica aerogels. The activity was measured using olive oil emulsion as substrate at pH 8.5 and 37 °C.
第五章 固定化酶与固定化细胞
第一节 酶的固定化
一、固定化酶（immobilized enzyme）：是 指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能 连续进行反应，反应后的酶可以回收重复 使用。
优点：
①极易将固定化酶与底物、产物分开，简 化了提纯工艺，提高酶的使用效率； ②在大多数情况下，能够提高酶的稳定；
(五)固定化酶的米氏常数(Km)变化 • 中性载体：固定化酶的表观Km值上升。
• 载体与底物电荷相同：表观Km值显著 上升； • 载体与底物电荷相反：Km
？
四、影响固定化酶性能的因素
1．构象改变、立体屏蔽
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。
定向固定化——精选推荐
定向固定化在酶改造中的运用摘要：酶是动植物及微生物由细胞原生质分泌的一种特异性蛋白质，生物体借此维持生命，酶是生物及多种化学反应的催化剂，它具有催化效率高、专一性强及能在常温常压下进行催化反应等优点，故已广泛应用于食品、医药、农业、矿业、能源和环境等方面。
本文综述了定向固定化在酶改造中的一些应用的实例，为酶的定向固定化提供进一步的指导。
关键词：定向固定化，酶改造，运用酶是由一种氨基酸组成的蛋白质，其高级结构对环境十分敏感，各种因素都有可能使酶丧失活性。
即随着反应时间延长，反应速率会逐渐下降，反应后不能回收，污染产物并给产物提纯造成困难，在经济上不合理。
20世纪50年代兴起固定化酶，固定化酶技术为这些问题的解决提供了有效的手段，从而成为酶工程领域中最为活跃的研究方向之一。
所谓固定化酶，是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续的进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。
固定化酶在分类上属于修饰酶，而非天然酶。
固定化酶使酶从水溶性状态变成不溶性的固定状态。
酶被固定后不仅能保持原有的活性，而且酶能回收，便于连续生产使用，并使酶与产物容易分离，提高产物浓度。
在工业上可以降低成本和减少工艺环节。
固定化酶使酶从水溶性状态变成不溶性的固定状态。
酶被固定后不仅能保持原有的活性，而且酶能回收，便于连续生产使用，并使酶与产物容易分离，提高产物浓度。
在工业上可以降低成本和减少工艺环节。
酶的固定化技术是最具发展前景的生物科技前沿领域之一，固定化酶的出现改善了酶的应用缺陷，极大的促进了酶工程的研究和应用，并广泛应用于各个领域本文就此综述了定向固定化在酶改造上的运用实例。
1．定向固定化葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶(GOX, E.C.1.1.3.4)能催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和双氧水，在食品、医药、发酵等工业中都具有广泛用途。
利用固定化技术制成葡萄糖氧化酶生物传感器可用于快速测定各种材料中葡萄糖含量。
酶的固定化是酶工程中的重要研究领域，已经开发了很多方法。
第三章固定化酶
活
化 载
辅基
体
连接臂
载体的选择
没有特异性吸附 具有多孔性 有适合引入配基的官能团 化学稳定性 具有适当的机械强度等。
目前使用的载体主要是琼脂糖，此外还有纤维素、玻 璃珠及合成高分子材料等。
4、化学结合法－共价结合法
原理: 酶蛋白分子上的功能基
团（酶的非活性必需侧 链基团）和固相支持物
表面上的反应基团之间 形成共价键，因而将酶 固定在支持物上。
最常用的偶联基团： -NH2、COOH、-SH、-OH、酚 基、咪唑基
两种固定方式
1. 将载体有关基团 活化，然 后此活泼基团再与酶分子上 某一基团反应形成共价键。
第三章
酶的固定化
第一节 酶的固定化 第二节 辅酶的固定方法 第三节 固定化细胞 第四节 固定化酶的性质及其影响因素 第五节 固定化酶催化反应动力学
对于现代工业来说，酶不是一种理想的 催化剂
绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏 感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进 行分批生产。
交联法常与吸附法结合使用，或者与 包埋法配合，目的是使酶紧紧地结合 于载体上。
酶直接交联法
在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不 溶性衍生物。
固定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液pH和离 子强度、温度和反应时间之间的平衡。
例：木瓜蛋白酶在0.2％酶蛋白浓度、2.3％戊 二醛、pH5.2-7.2、0℃下交联24h，可形成固 定化酶。
定向固定化方法
① 酶和抗体的亲和连接 ② 酶通过糖基部分固定化 ③ 酶和金属离子连接 ④ 分子生物学方法 基因融合法
翻译后修饰法 特定位点基因突变法
第二节 辅酶的固定方法
原因
酶固定化
制成固定化酶或固定化菌体。
醛基
3、特点
优点：固定化酶或固定化菌体 结 合 牢 固 ， 可 以 长时 间 使 用。 缺点：交联反应条件较激烈，
酶分子的多个基团被交联，
致使 酶 活力 损 失 较大 ； 通
过 酶 分 子间 交 联 形成 的 固
米～几百微米，厚约25mm的半透膜）制成的小球内，制成
固定化酶或固定化细胞。
① 常用载体———半透 膜有：聚酰胺膜、火 棉胶膜 ② 制备方法：将酶液滴 分散在与水互不相溶 的有机溶剂中，再在 酶液滴表面形成半透 膜，将酶包埋在微胶 囊之中。
例：以尼龙膜包埋酶时，将酶液及亲水性单体 （如己二胺）溶于水制成水溶液。另外，将疏水性 单体（癸二酰氯等）溶于氯仿或甲苯等与水混溶的 有机溶剂。然后，将这两种互不相溶的液体混和在 一起。加入乳化剂乳化，使酶液分散成小液滴。此 时，亲水性的已二胺与疏水性的癸二酰氯就在二相 界面聚合成半透膜，将酶包埋在小球内。再加 Tween—20，使乳化破坏，用离心分离即可得用半透 膜包埋的微囊型固定化酶。
①载体：DEAE纤维素、TEAE纤维素、
DEAE葡聚糖凝胶、 ……
+ + + + -+ + + ++ + + -+ - -+ ++ + ++ + - - - +
（1）离子结合法：
②制备方法： 在一定PH、温度、离子强度等条件下，将酶液与载体 混和搅拌几个小时，或将酶液缓慢流过处理好的离子交换柱， 使酶结合于离子交换剂上ห้องสมุดไป่ตู้制得。
酶的固定化方法及优缺点
酶的固定化方法及优缺点以酶的固定化方法及优缺点为标题，本文将详细介绍酶的固定化方法以及各种方法的优缺点。
一、酶的固定化方法1. 物理吸附法：将酶直接吸附在固体载体表面，如活性炭、硅胶等。
这种方法简单易行，不需要化学反应，但酶容易失活和流失。
2. 共价键结合法：通过化学手段将酶共价键结合在载体表面，常用的方法包括交联、酯化、酰胺化等。
这种方法能够稳定地固定酶，但可能会影响酶的活性和稳定性。
3. 包埋法：将酶包裹在多孔载体中，如凝胶、微胶囊等。
这种方法能够保护酶免受外界环境的影响，但可能会降低酶的反应速率。
4. 共聚物法：利用聚合物将酶固定在载体上，如聚丙烯酰胺凝胶、聚乙烯醇等。
这种方法可以提高酶的稳定性和反应速率，但可能会影响酶的活性。
二、各种固定化方法的优缺点1. 物理吸附法的优点是操作简单、成本低廉，但缺点是酶容易失活和流失，固定效果不稳定。
2. 共价键结合法的优点是能够稳定地固定酶，固定效果较好，但缺点是可能会影响酶的活性和稳定性。
3. 包埋法的优点是能够保护酶免受外界环境的影响，固定效果较稳定，但缺点是可能会降低酶的反应速率。
4. 共聚物法的优点是可以提高酶的稳定性和反应速率，固定效果较好，但缺点是可能会影响酶的活性。
在实际应用中，选择适合的固定化方法需要考虑多个因素，如酶的特性、反应条件、载体的稳定性和成本等。
不同的固定化方法适用于不同的酶和反应条件。
例如，对于温度敏感的酶，可以选择物理吸附法或包埋法；对于活性较强的酶，可以选择共价键结合法或共聚物法。
总结起来，酶的固定化方法有物理吸附法、共价键结合法、包埋法和共聚物法等。
每种方法都有其优缺点，选择适合的固定化方法需要综合考虑多个因素。
通过固定化方法，可以提高酶的稳定性、反应速率和重复使用性，从而在酶工业和生物催化领域具有广泛的应用前景。
酶的固定化方案
酶的固定化的方案一、材料和方法1.实验材料及试剂酶，25%戊二醛溶液，带氨基的载体，考马斯亮蓝，牛血清白蛋白。
2. 主要实验仪器紫外可见光分光光度计Uv-1800，THZ一C恒温振荡器，MD200一3型电子天平PHS一3C酸度计3.酶的固定化方法1）载体的活化a 对所得的载体表面带有大量的氨基，对其进行活化处理可用于酶蛋白的共价结合。
采用戊二醛为活化试剂，使凝胶表面连接上游离的醛基。
具体方法为:将lg带氨基的载体颗粒臵于3ml、10%的戊二醛溶液中振荡24h，然后真空过滤。
所得固体用去离子水洗涤多次，干燥后即为戊二醛活化的树脂颗粒。
b大孔树脂预处理方法：称取10g树脂于锥形瓶中，用95%的乙醇浸泡24h，真空抽滤，用1L蒸馏水冲洗。
树脂依次用25mL的5%HCl和5%NaOH溶液浸泡4h后抽滤，用蒸馏水洗至中性。
抽滤后臵于4℃冰箱中干燥4h，室温保存备用。
举例：称取适量经预处理的大孔树脂于50mL锥形瓶中，加入适量磷酸缓冲液（pH7.5，0.05mol/L）和适量的酶，臵于恒温水浴振荡器中吸附一定时间后（37℃，150r/min）真空抽滤，并用100mL缓冲液冲洗载体，抽干后臵于4℃冰箱中干燥4h，并于4℃冰箱中密封保存。
2）固定化方法a 共价结合法准确称量20g戊二醛活化的树脂颗粒臵于50ml的离心管中，向其中加入体积为2ml的一定浓度的酶液(酶粉溶于pH7.0、0.03M的磷酸缓冲液)。
然后于冰浴中缓慢振荡24h。
之后离心收集固体，用相同的磷酸缓冲液洗涤固体5次以上。
b 酶聚集体包被法准确称量20g戊二醛活化的树脂颗粒臵于50ml的离心管中，向其中加入体积为2ml的一定浓度的酶液(酶粉溶于pH7.0、0.03M的磷酸缓冲液)。
然后于冰浴中缓慢振荡24h。
之后向混合液中加入0.5ml、2%的戊二醛溶液，继续振荡10h，离心收集固体。
最后用相同的磷酸缓冲液洗涤固体5次以上。
c.酶活性的测定d. 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度固定化时溶液中的蛋白质含量采用考马斯亮蓝染色法测定：考马斯亮蓝试剂的配制：将考马斯亮蓝 G-250 100mg 溶于 50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至 1000mL。
生物中图版学案：第三章第四节酶的固定化
第四节酶的固定化1．说出固定化酶和固定化细胞的作用和原理。
2．尝试制备固定化大肠杆菌细胞.一、酶的固定化1．固定化酶概念：通过物理或化学的方法,将水溶性的酶与不溶性的载体结合,使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应，这样制成的酶称为固定化酶。
2．酶的固定化方法共价键结合法:将酶通过化学反应以共价键结合到尼龙等载体上.包埋法：将酶均匀包埋在琼脂糖凝胶等多孔性的凝胶中的固定化方法。
3．固定化酶的特点活性稳定，可以反复使用多次。
在生产中，固定化酶能与反应液相互分开,不与产品混合，制品较易纯化，在大规模生产时所需工艺设备简单易行。
4．固定化酶的实例：木瓜蛋白酶的固定化（1）酶的固定化。
在啤酒生产过程中,刚酿制的啤酒往往含有少量的蛋白质而显得浑浊.加入木瓜蛋白酶,可以使蛋白质水解成氨基酸，供酵母菌增殖所需，从而缩短发酵时间，提高啤酒产量，使酒质澄清醇和。
将尼龙布浸入等体积的CaCl2溶液和甲醇溶液中，室温下放置10 s左右，并轻轻搅拌至尼龙布发黏。
取出后用水冲洗，并用吸水纸吸干。
将尼龙布放入盐酸中，室温下水解，用蒸馏水洗至pH中性.再将尼龙布放入戊二醛溶液中，室温下浸泡20 min。
取出后用磷酸缓冲液(pH＝7.8)反复洗涤，洗去多余的戊二醛，吸干后立即放入木瓜蛋白酶溶液中，4 ℃下固定3.5 h。
取出尼龙布后用NaCl溶液洗去多余的蛋白酶,即得到尼龙固定化酶.为防止改变酶的电荷,操作过程中不能使用金属镊子。
（2)检验酶的活性。
（3)酶的再利用。
二、细胞的固定化1．细胞固定化技术利用适当的载体将合成酶的细胞固定起来。
固定化细胞比固定化酶更简捷，使用寿命更长.2．大肠杆菌细胞的固定化可以用液体培养基培养大肠杆菌,取菌液加入生理盐水和琼脂，搅拌均匀，待琼脂凝胶凝固后，切成小块，用生理盐水和蒸馏水洗净，即得到固定化的大肠杆菌细胞。
1．直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的比较对固定化酶的作用影响较小的固定方法是物理吸附法.2．固定化微生物细胞利用微生物来生产酶具有生产成本低、周期短、产量大等优点。
第六章酶与细胞固定化
游离酶的缺点：
(1) 酶的催化效率不够高
(2) 酶的稳定性较差（热、酸碱、有机溶剂对其有 影响）。
(3)酶使用后通常不能回收，这种一次性使用酶的 方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产， 从而导致酶的使用效率低，产品成本高。
(4)产物的分离纯化较困难 ，酶在催化反应结束后 与产物混在一起，给产物的进一步分离纯化带来一 定的困难。
亚硝酸可由亚硝酸钠和盐酸反应生成： NaNO2+HCl HNO2+NaCl
载体活化后，活泼的重氮基团可与酶分子中的酚基或咪唑基发生偶联反 应值得固定化酶。
R—O—CH2—C6H4—N+===N+E R—O—CH2—C6H4—N ＝ N—E
② 叠氮法：
含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠氮 化合物。以羧甲基纤维素为例，先将羧甲基纤维素甲 酯化，再与肼反应生成羧甲基纤维素的酰肼衍生物， 然后再与亚硝酸反应得到叠氮化合物，这种产物能在 低温、pH 7.5—8.5的情况下和酶的氨基直接偶联。 叠氮衍生物也能和羟基、酚羟基或巯基反应。
携带到体内特定部位，然后将被包裹物质释放。因 此，其在药物应用方面受到重视。
与凝胶包埋法相比，微囊型包埋法的优点： 1）固定化酶颗粒小。 2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注 入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使 酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学 价值。 缺点：反应条件要求高,制备成本也较高。
IE (or IC)
b. 微囊型包埋(microencapsulation)： 又称半透膜包埋法：
将酶包埋于由各种高分子聚合物（直径几十微 米～几百微米，厚约25mm的半透膜）制成的小球内， 制成固定化酶。 ① 常用半透膜有：聚酰胺膜、火棉胶膜 ② 制备方式：界面沉降法、界面聚合法、表面活性 剂乳化液包埋法。 分述如下：
酶的固定化及在医药中的应用
苯酚 + 丙酮酸 + NH3 → L-酪氨
酸
-酪氨酸酶
吲哚 + 丙酮酸 + 醋酸铵 → 色氨 色氨酸酶 酸
DL-苯乙内酰脲 → D-苯甘氨酸 乙内酰脲酶
DL-5-对羟基苯乙内酰脲 → D-对 乙内酰脲酶
羟基苯甘氨酸
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整理版ppt
固定化酶医药上的应用
• 2. 用大孔径N-聚氨乙基丙烯酰胺为载 体，将前列腺素合成酶固定化，合成前 列腺素衍生物E1
3
整理版ppt
酶工程及固定化技术发展史
在20世纪20年代，就出现了酶工程，以自然酶制 剂在工业上大规模应用的特征，原料以动植物为主
1953年，Grubhoger Schleith 用重氮化聚氨基聚苯乙烯树脂 对羧肽酶、蛋白酶、核酸酶等进行固定，产生了固定化酶技术。
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酶工程及固定化技术发展史
酶
优点：结合牢固，可以长时间使用 缺点：因交联反应激烈，酶分子多 个基团被交联，酶活损失大，颗粒 较小，使用不便
双功 能剂
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包埋法
• 聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进 剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包埋在聚合 物中以达到固定化
• 分类：网格型（凝胶包埋法）；微囊型（微囊化 法）
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固定化酶
• 固定化酶(Immobilized Enzyme）：通过物 理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载 体上，或将酶束缚在一定的空间内，限制酶 分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作 用
水溶性酶
水不容性的载体
固定化技术
固定化酶
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固定化酶制备原则
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影响因素
化学因素
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生物因素
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20世纪 年代兴起的固定化酶 世纪50年代兴起的固定化酶 世纪 （Immobilized Enzyme）技术为这些问题 ） 的解决提供了有效的手段， 的解决提供了有效的手段，从而成为酶工 程领域中最为活跃的研究方向之一。 程领域中最为活跃的研究方向之一。
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固定化酶使酶从水溶性状态变成不溶性的 固定化酶使酶从水溶性状态变成不溶性的 水溶性状态变成不溶性 固定状态。酶被固定后不仅能保持原有的活 固定状态。酶被固定后不仅能保持原有的活 而且酶能回收 便于连续生产使用， 能回收， 性，而且酶能回收，便于连续生产使用，并 使酶与产物容易分离，提高产物浓度。 使酶与产物容易分离，提高产物浓度。在工 业上可以降低成本 减少工艺环节。 降低成本和 业上可以降低成本和减少工艺环节。 表1.1对固定化酶与游离酶的优缺点进行了 对固定化酶与游离酶的优缺点进行了 比较。 比较。
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三 目前存在的问题
目前，固定化技术已经取得了许多重要成果， 目前，固定化技术已经取得了许多重要成果，充分 发挥了固定化酶和固定化细胞在改革工艺和降低成 本方面的巨大潜力。但从目前的发展状况来看， 本方面的巨大潜力。但从目前的发展状况来看，尽 管酶种类繁多， 已经固定化的酶却相对有限， 管酶种类繁多，但已经固定化的酶却相对有限，采 用固定化酶技术大规模生产的企业尚属少数 企业尚属少数， 用固定化酶技术大规模生产的企业尚属少数，真正 在工业上使用的固定化酶还仅限于葡萄糖异构酶、 在工业上使用的固定化酶还仅限于葡萄糖异构酶、 仅限于葡萄糖异构酶 葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等为数不多的十几个 葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等为数不多的十几个 酶种， 酶种，故仍需大力研究开发使更多的固定化酶和细 胞能适用于工业规模生产。 胞能适用于工业规模生产。
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表1.1对固定化酶与游离酶的优缺点进行了比较 对固定化酶与游离酶的优缺点进行了比较
比较 内容 游离酶 固定 化酶 稳定 性 差 好 使用 次数 一次 多次 催化 效率 低 高
表1.1
生产 成本 高 低
产品 质量 低 高
工艺 环节 多 少
连续 生产 低 高
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来说， 在SOD来说，它的理论研究方面 不少问题 来说 它的理论研究方面,不少问题 还未研究或者有待深入,如对 如对SOD进行化学 还未研究或者有待深入 如对 进行化学 修饰后,修饰酶的代谢过程及具体的毒副作 修饰后 修饰酶的代谢过程及具体的毒副作 等方面都要深入研究。 用等方面都要深入研究。在SOD的应用研 的应用研 究方面,也有一些问题急待解决。 也有一些问题急待解决 究方面 也有一些问题急待解决。如在化妆 品应用方面:① 在体内的抗氧化过程,要 品应用方面 ①SOD在体内的抗氧化过程 要 在体内的抗氧化过程 延长SOD在体内的半衰期 减少其对机体的 在体内的半衰期,减少其对机体的 延长 在体内的半衰期 毒副作用等;② 要准确地测定 要准确地测定SOD的活性大 毒副作用等 ②,要准确地测定 的活性大 同时要明确化妆品基质对SOD活性和稳 小,同时要明确化妆品基质对 同时要明确化妆品基质对 活性和稳 定性的影响。 定性的影响。
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（3）超氧化物歧化酶（SOD） 及其 ）超氧化物歧化酶（ ） 国内外研究现状
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,简 超氧化物歧化酶 简 是一类源自海运业资源 称SOD),是一类源自海运业资源的超氧化物 是一类源自海运业资源的超氧化物 歧化酶,能够 能够催化超氧阴离子自由基发生歧化 歧化酶 能够催化超氧阴离子自由基发生歧化 反应,平衡机体内的氧自由基 平衡机体内的氧自由基,在 反应 平衡机体内的氧自由基 在1973年获得 年获得 专利并在化妆品行业广泛应用。 专利并在化妆品行业广泛应用。 几乎在所有生命有机体运作中发现在水环境 都有保护细胞免受自由基氧化攻击的作用。 中,都有保护细胞免受自由基氧化攻击的作用。 都有保护细胞免受自由基氧化攻击的作用
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关键词： 关键词：
酶 固定化 超氧化物歧化酶 化妆品行业 展望
2011年5月16日景和意义）
酶是动植物及微生物由细胞原生质分泌 的一种特异性蛋白质 生物体借此维持生命 的一种特异性蛋白质 ,生物体借此维持生命 酶是生物及多种化学反应的催化剂， 酶是生物及多种化学反应的催化剂，它 具有催化效率高 专一性强及能在 催化效率高、 及能在常温常压 具有催化效率高、专一性强及能在常温常压 下进行催化反应等优点， 催化反应等优点 下进行催化反应等优点，故已广泛应用于食 医药、农业、矿业、 品、医药、农业、矿业、能源和环境保护等 方面 .
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五 总结
人们在化妆品中使用酶类抑制剂的兴趣在增 人们在化妆品中使用酶类抑制剂的兴趣在增 加，总体应用酶的区域已经显示有显著的保 护皮肤的好处： 护皮肤的好处：它们可以帮助减缓老化的一 些明显迹象， 些明显迹象，以及环境对表皮的一些损害作 因此酶类能有效的作用于皮肤表面。 用。因此酶类能有效的作用于皮肤表面。
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二 国内外发展现状
（1）酶固定化方法的发展史 酶固定化方法的发展史
传 统 的 酶 固 定 化 方 法 法
(1) (5)
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法
法
(2) (6) 1
(3)
(4)
的酶固定化方法
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（2）新型酶固定化方法 ）
开发新型酶固定化方法的原则是： 开发新型酶固定化方法的原则是：实现在较 原则是 温和的条件下进行酶的固定化 尽量减少 下进行酶的固定化， 为温和的条件下进行酶的固定化，尽量减少 或避免酶活力的损失 酶活力的损失。 或避免酶活力的损失。 通过辐射、 等离子体、 通过辐射、光、等离子体、电子等新方法均 可制备高活性固定化酶。 可制备高活性固定化酶。 主要是举一些国外的利用这些方法得到酶活 力较高的固定化酶的粒子。 力较高的固定化酶的粒子。
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而目前我国固定化酶制剂应用到工业生 产的实例却很少,因此固定化酶的研究开 产的实例却很少 因此固定化酶的研究开 发任重道远。国内外大量的研究证实,固 发任重道远。国内外大量的研究证实 固 定化酶技术目前还存在固定效率低 固定效率低、 定化酶技术目前还存在固定效率低、载 体的有毒性、成本高、稳定性差、 体的有毒性、成本高、稳定性差、不能 大规模生产等问题 等问题,这些都限制了固定化 大规模生产等问题 这些都限制了固定化 酶技术的发展与应用。 酶技术的发展与应用。
酶的定向固定化方法的发展 及其 在化妆品行业上的展望
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酶的研究进展过程
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一、摘要 二、关键词 三、
前言（ 前言（背景 和意义） 和意义） 国内外 发展现状 正文部分
目前存在 的问题
解决办 法和展望
总结
酶固定 化方法 的发展史
超氧化 物歧化酶 （SOD） ）
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四 解决办法和展望
随着生物技术及材料、 随着生物技术及材料、化工等各相关学科的 不断发展,固定化酶的工作会有新的突破 固定化酶的工作会有新的突破。 不断发展 固定化酶的工作会有新的突破。将 更多固定化酶取得工业化规模的应用 工业化规模的应用,仍然是 更多固定化酶取得工业化规模的应用 仍然是 固定化技术领域追求的目标
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所谓的固定化酶，是指在一定空间内呈闭 所谓的固定化酶，是指在一定空间内呈闭 一定空间内呈 锁状态存在的酶 存在的酶， 连续的进行反应 的进行反应， 锁状态存在的酶，能连续的进行反应，反 应后的酶可以回收重复使用 回收重复使用。 应后的酶可以回收重复使用。固定化酶在 分类上属于修饰酶，而非天然酶。 分类上属于修饰酶，而非天然酶。
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目前已经有人利用固定化金属亲和层析 胶与亲和层析膜纯化rhMn-SOD和 胶与亲和层析膜纯化 和 rhCu,Zn-SOD。如果我们把 。如果我们把SOD的以上 的以上 存在的问题与酶的固定化技术连接起来， 存在的问题与酶的固定化技术连接起来， 我们会发现这些问题正是酶的固定化技 术研究成效的方向，如果能结合酶的固 术研究成效的方向，如果能结合酶的固 定化技术很好的解决这些问题,相信固定 定化技术很好的解决这些问题 相信固定 化酶与SOD的研究与应用必将有个美好 化酶与 的研究与应用必将有个美好 的前景,造福人类 的前景 造福人类
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目前,国内外有关 的研究方兴未艾,比较 目前 国内外有关SOD的研究方兴未艾 比较 国内外有关 的研究方兴未艾 活跃的领域主要有以下几个方面： 活跃的领域主要有以下几个方面： （1）结构性能改造 ） （2）SOD模拟研究 ） 模拟研究 （3）SOD与植物抗逆性 ） 与植物抗逆性
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但是，由于受到①半衰期短 ② 但是，由于受到①半衰期短;②相对分子 不易透过细胞膜;③ 质量大,不易透过细胞膜 口服时易受胃 质量大 不易透过细胞膜 ③口服时易受胃 蛋白酶分解;④体内特异性等因素的限制 蛋白酶分解 ④体内特异性等因素的限制 ,SOD很难作为药用酶广泛应用于临床中。 很难作为药用酶广泛应用于临床中。 很难作为药用酶广泛应用于临床中
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另，虽然药物科学显示，合成非常类似过 虽然药物科学显示， 渡态并键合酶类的强有力的抑制剂是可能 最常见的是， 的。最常见的是，抑制作用出现在一个分 子干预酶作用底物与酶类键合的时候。 子干预酶作用底物与酶类键合的时候。 但是其中很多是指那些美白皮肤的抗酪 氨酸酶活性的酶类抑制剂， 氨酸酶活性的酶类抑制剂，还有那些防止 弹性蛋白交联，导致皮肤丧失弹性 丧失弹性的抗弹 弹性蛋白交联，导致皮肤丧失弹性的抗弹 性蛋白酶活性的酶类抑制剂。 性蛋白酶活性的酶类抑制剂。但是这些酶 类抑制剂化妆品是通过非竞争性键合酶类， 类抑制剂化妆品是通过非竞争性键合酶类， 改变酶的结构以致酶几乎或者完全失活来 改变酶的结构以致酶几乎或者完全失活来 发挥作用。 发挥作用。