Y染色体微缺失检测指导

丫染色体微缺失是严重少精子或无精子症的重要原因，是导致男性不育的第二大
遗传因素，其发生率仅次于Klinefelter综合征（克氏综合征）。

从1999年开始，欧洲男科学协会和欧洲分子遗传实验质控网（EAA/EMQN为提高诊断质量，出版了丫染色体微缺失分子诊断指南，并提供了客观的实验质量评价方法。

最新版的实验
室指南是2013年9月EAA/EMQN根据12年的临床积累和专家共识，在1999版和2004版的基础上修订而成。

新指南重点阐明：在少精子症或无精子症男性中发现的丫染色体微缺失区域，主要是无精子因子（azoospermia factor，AZF）区域仅包含AZFa AZFb AZFbc AZFc和AZFabc区，独立的AZFd区并不存在；AZFc 区中gr/gr 缺失是影响精子生成的一个危险因素，但临床意义尚存争议，不作为常规检查指标；检测位点增加并不能提高检测灵敏度，反而可能使结果复杂化；基于两管多重PCR的检测方法仍适用于整个AZF缺失检测。

EAA/EMQN 12年国际质量评估计划（EQA计划）的实施表明，参与实验室通过规范实验操作，改善报告质量，可有效降低诊断错误率。

丫染色体微缺失在中国不育男性中的发生频率为11.5%，处于较高水平，我们建议将AZF检测作为男性严重少精子或无精子症的常规检测项目，呼吁国内AZF检测实验室加入EQA计划，完善中国丫染色体微缺失检测实验操作规范。

丫染色体微缺失分子检测在中国已开展多年，国内专家对AZF缺失模式、检测序
列标签位点（sequenee- tagged site, STS的数量、检测方法和内部质量控制等临床问题未达成共识。

各实验室的诊断操作方法有很大不同，导致不准确或错误诊断时有发生，迫切需要建立丫染色体微缺失诊断标准和质量控制标准。

EAA/EMQN 更新的2013版指南对以上问题都给出了明确的专家共识，对我国建立自己的检测指南有重要的指导意义。

一、丫染色体微缺失发生频率
丫染色体微缺失在健康人群中发生率约为1/4 000，但在不育男性中显着升高，
微缺失发生频率为2%〜10%（甚至更高）。

2013版指南指出丫染色体微缺失在中国不育男性中发生频率为11.5%,处于较高水平。

2006年朱晓斌等［1］针对中国不育男性染色体的研究表明AZF微缺失在非梗阻性无精子症患者中的发生率为9.94%，严重少精子症患者中发生率为5.82%，与国内外其他学者的研究基本一致。

随着微缺失分子机制的阐明和丫染色体男性特异区域的结构（MSY）测序完成，结合十多年临床数据分析，EAA专家总结沿用Repping等［2］对丫染色体微缺失区域
的定义模式，分为：AZFa区缺失、AZFb区缺失、AZFbc区缺失和AZFc区缺失，认为只有该微缺失模式有明确的临床表现。

国内外学者对AZFd区缺失是否存在
一直存有争议。

尽管发现在AZFb与AZFc两区域之间存在新的缺失位点（一些学者认为的AZFd区缺失），但是该区域缺失没有明确的临床意义，也并非独立存在的缺失模式。

所以第四区域AZFd区缺失仍存在较多争议。

M tsltmanolu等［3］在2005年的一项研究中指出AZFd缺失可能与精子形成有关，但仍缺乏有力的临床证据。

2013年，陈科等［4］在精子正常和轻度少精子症患者中都发现了假定的AZFd 区缺失。

然而，至今为止AZFd区域尚未发现与精子生成相关的候选基因，其缺失所对应的临床表型还需进一步确认。

二、gr/gr缺失不纳入常规检查项目
研究证实gr/gr缺失属于AZFc部分缺失，是影响精子生成的一个重要因素，但是否需要将其作为常规检查指标尚存争议。

尽管gr/gr缺失可导致AZFc区一半以上基因丢失，但其临床意义仍不明确，因为该缺失患者精子生成表型变化多样，从少精到精子数目正常都存在。

gr/gr缺失表型在不同人种和地域间存在差异，已有研究证实在欧洲白种人（除了法国人⑸和德国人［6］）和西太平洋居民中，gr/gr 缺失是男性生精障碍的高危因素［7］。

但在部分亚洲国家如日本和中国［8,9］,
gr/gr 缺失在健康人群中的概率和在不育患者的概率无显着差别。

李铮等［10］研究发现
Y染色体gr/gr缺失既存在于严重不育男性，也存在于生精功能正常的捐精者中，缺失可能遗传自父亲，并未影响精子的发生，不能认为是精子发生的遗传风险因子。

因此在中国gr/gr缺失不建议作为丫染色体微缺失常规检测的缺失模式。

三、AZF缺失基因型/表型相关性
丫染色体微缺失主要是AZF的缺失，该区域包含精子生成的相关基因家族，不同程度的缺失可导致少精子或无精子症。

AZF区进一步可分为AZFa AZFb AZFc
区域。

AZFa区域缺失通常导致唯支持细胞综合征（SCO综合征）和无精子症。

如果诊断为整个AZFa区域缺失，从睾丸中获得精子的概率为0。

AZFb和AZFbc（P5/P1 近端；P5/P1远端，P4/P1远端）缺失的典型睾丸组织学特征是SCO综合征或精子发生阻滞导致的无精子症。

研究表明这些缺失与整个AZFa区域缺失情况一样，
患者也不能通过睾丸穿刺（TESE获得精子。

严重少精子或无精子症患者中AZFc 缺失发生频率最高，AZFc缺失的临床表型和睾丸组织学类型多种多样。

一般说来，AZFc 缺失患者尚残存精子生成能力。

罕见情况下，其缺失在自然状态下可遗传给其男性后代［11］。

近50%AZFc缺失的无精子症患者可通过TESE获得精子，进行单精子卵胞浆内注射（ICSI受孕，但这些患者的男性后代都将是AZFc缺失的携带者。

四、丫染色体微缺失检测人群
丫染色体微缺失检测不仅可以明确严重少精子或无精子症的病因，而且可以对预
后做出一定的评估。

丫染色体微缺失通常见于无精子症或精子浓度少于 2 X
106/ml的患者。

一般的临床参数，如激素水平、睾丸大小、精索静脉曲张、睾丸畸形、感染等对是否存在丫染色体微缺失没有任何预测价值，丫染色体微缺失必须通过分子检测来确定。

拟行ICS的严重少精子症应该做丫染色体微缺失检测，而对非梗阻性无精子症患者在行TESE或者睾丸显微切开取精术前也应该进行常规检测，因为当整个AZFa整个AZFb AZFbc或者AZFabc缺失时都不建议给患者做手术。

需要特别提醒的是，如果采用辅助生育技术，AZFc缺失可以垂直遗
传给男性后代。

如果患者通过AZF检测发现部分AZFa AZFb或AZFc缺失，建议家族中其他男性也进行AZF检测，因为这种缺失是可以遗传的。

但整个AZFa AZFb AZFbc或者AZFabc缺失时不建议家族其他男性成员做AZF检测，因为这些缺失通常没有精子生成。

对丈夫携带AZFc区缺失类型的夫妻，研究其ICSI受孕情况［12］，大部分研究表明Y染色体微缺失存在与否不影响受精率和受孕率，但也有个别报道指出微缺失会导致受精率下降，影响胚胎质量，降低囊胚率和ICSI成功率［13］。

五、STS
丫染色体微缺失上的STS位点高达131个，如果用于丫染色体微缺失检测的STS 过少，将有可能漏检某些区域的缺失，但若采用的STS过多，则可能包含一些多态性序列，而这些位点在正常可育男性中也可出现缺失。

指南指出，原则上只要对每个AZF区域一个非多态性的STS位点进行分析就足以判断AZFa AZFb AZFc是否存在缺失。

任何一个已知缺失区域都包括多个STS
位点，每个区域设置2个STS位点有助于增加检测的准确性。

鉴于众多实验室经验总结和外部质量控制，并考虑到多重PCR T增的形式，在1999和2004版指南中推荐的经典STS引物仍然有效，这些引物包括：AZFa: sY84sY86;AZFbsY127 SY134; AZFc: sY254 sY255都在DAZ基因上）。

这些STS位点引物由多个实验室和外部质量控制实验证明：结果可信重复性好。

采用这些引物几乎能够检测到所有临床上的相关缺失和文献报道的3个AZF区域95%以上的缺失，设计的这套引物能完全满足常规检测。

它是一个简单的标准，便于实验室质量控制和缩小实验室之间的检测差异，因此强烈推荐所有实验室都采用这些引物。

指南指出一些检测方法和试剂可检测很多STS位点，但并不能提高检测的灵敏度，反而可能使结果复杂化、难以解释，因为这可能检测到很多假的缺失位点，尤其是当DNA质量不好，PCR条件不是最佳时。

而大部分试剂盒并没有额外的单重PCR来确认
可疑结果，因此指南并不推荐增加STS位点［14］。

六、PCR的形式和内部质量控制
丫染色体微缺失检测采用多重PCR体系，体系中设置的PCR引物应该包括2个内对照：sY14（SRY） ZFX/ZFY 6 个STS位点：sY84 sY86 sY127 sY134 sY254 sY255 PCR需设立内对照（SRY ZFX/ZFY S因），阳性对照（健康的男性DNA）,阴性对照（女性DNA）和水空白对照（用水代替模板，即含有除模板DNA外所有成分的PCR
反应）。

阳性对照监测实验操作是否有效，阴性对照监测DNA是否污染，
空白对照监测试剂是否污染。

内对照SRY基因是男性性别决定基因，位于Y染色体短臂，内对照SRY S因可以在ZFY基因丢失时证明丫染色体特征序列的存在（比如:在XX男性中）。

ZFX基因检测不仅可以作为女性DNA对照，也可作为没有SRY 基因的46, XX男性患者唯一的阳性对照。

指南推荐的相关操作都经过认真设计和优化，采用两管多重PCR反应，每管多重PCR反应体系中都包括每个区域的一个位点。

当标本出现整个AZFa AZFb或AZFc 区
缺失时，两管PCR反应中相应区域设置的2个STS位点产物都会缺失。

当AZFa 和AZFb区域出现部分缺失时，相关区域单个位点的缺失是有可能的，但需小心求证，对整个区域进行详细的研究，目前这种情况很少见，被认为是例外。

通常认为AZFc区
的sY254或sY255单个缺失是实验结果错误。

七、丫染色体微缺失检测方法
EAA/EMQN推荐采用多重PCR方法检测丫染色体微缺失。

基于多重PCR的丫染色体微缺失检测方法很多，如实时荧光PCR（Real time PCR）电泳法和芯片法等。

Rea- time PCR检测采用荧光标记探针，不涉及电泳，检测速度更快，数字化结果更加直观，因此指南推荐有条件的实验室都应采用该方法。

在没有Real- time PCR检测仪的实验室，可采用电泳法或毛细电泳法。

其他的检测方法如基因芯片检测，其花费昂贵，且包含太多不必要的位点，不为指南所推荐。

实验室建立一种新的检测方法，
都需经过大量样本验证，并明确指出所采用的方法，而不是简单的描述"根据指南方法"。

指南推荐方法特指两管多重PCR方法，检测位点如上文所述6个经典位点。

八、EAA/EMQN 12年实验总结
进行AZF检测的实验室应该加入"EQA计划"。

从2000至2012年间，参加质量评估的实验室从57家增加至148家。

诊断错误率显着下降，从开始前5年的8% 到现在的1%〜2%。

参与评估的诊断报告格式不断规范，质量大幅提高。

最近4 年间，大约50%的分析报告获得满分，与计划开始的前几年相比有了很大提升。

目前国内实验室对于丫染色体微缺失的检测方法和筛查位点并没有形成共识，所以检测结果也存在较大差异，因此建议在中国建立丫染色体微缺失检测标准体系，并加入EQA计划。