分光光度技术

第六节 常见的分光光度计
一、72光电管为受光器、表头 指示结果的常用的可见光分光光度计。其波长范围为
360~800nm ，在410~710nm 之间的灵敏度较好。
第六节 常见分光光度计
二、722S型分光光度计
这是一种数码显示的可见光分光光度计，采 用衍射光栅作为单色器，卤素灯作光源，使用 波长范围为 340~1000nm 。除了可直接进行透 光率T% 和吸光度A的测定，还具有浓度因子 设定和浓度直读的功能 。
第六节 常见分光光度计
三、日本岛津1240紫外/可见分光光度计 （带Sipper 160 型自动流动池）
这是一种微机控制、数码显示的紫外 /可见 光分光光度计，采用衍射光栅作为单色器， 卤素灯和氘（ D2）灯作光源，使用波长范围 为190~1100nm 。除了可直接进行吸光度 A的 测定，还具有波长扫描和定量测定的功能。
第一节 基本原理
一、光的基本知识 光是由光量子组成的，具有二重性，即不连
续的微粒性和连续的波动性。波长和频率是光 的波动性的特征，可用下式表示：
λ＝C／υ λ为波长， υ为频率， c为光速，等于 299 770±4km ／s。
第一节 基本原理
图1-1 光吸收示意图
入射光的强度为Io，通过厚
度为L的溶液后，透射光的强
第三节 分光光度技术的应用
一、定量分析
1．标准曲线 (工作曲线)法
2. 对比法
Ax As
= = KC x L KC s L
Cx Cs
，即Cx=
Ax As
× Cs
3．计算法
C= A ?
第三节 分光光度技术的应用
二、定性分析
用分光光度计绘制出样品的吸收光谱曲线。各种物 质都有它自己一定的吸收光谱曲线，利用用吸收光谱 曲线图可以进行物质种类的鉴定。
第一章 分光光度技术p1
分光光度法（ Spectrophotometry ）： 它是根据物质对不同波长的光线具有选择性
吸收，每种物质都具有其特异的吸收光谱，而 建立起来的一种定量、定性分析的技术。也称 为吸收光谱法（ Absorption spectrometry ）。 它不需要我们把欲分析的样品从混合物中分离 开来，即可利用样品特殊的吸收峰或特殊的显 色反应，直接进行定性、定量的分析 。
一般情况，单独依靠紫外光吸收光谱不能决定一个 未知物质的结构，往往需要与红外、质谱等其它方法 相配合。
第四节 测试条件的选择
一、测试波长的选择
一般都是选择吸收光 谱图中最高峰的λmax 作为 测试波长。这不仅能获 得高的灵敏度；而且由 于在λmax 附近吸光度随波 长的变化较小，入射光 波长的稍许偏移和非单 色性引起的吸光度变化 较小，从而对比耳定律 的偏离较小
有棱镜及光栅两种类型。
（三）狭缝 :
一对隔板在光路上形成的缝隙，用来调节入射单色光 的纯度和强度
第二节 分光光度计的基本类型和组件
二、分光光度计的基本组件
（四）比色杯 :
玻璃比色杯用于可见光区，紫外光区要用石英比色杯。 标准光径为10mm ，还有带有自动进样装置的流动池。
（五）检测及显示系统 :
光电检测器有四种类型：光电池、光电管，光电二极 管及光电二极管距阵。
度为It，
I I
t 0
称为透光度
（transmittance ），用T表示。
lg I o 称为吸光度A
It
(Aabsorbance
A)
，又称为消
光度 (degree of extinction E )
或光密度 (optical density D ) 。
第一节 基本原理
二、 朗伯一比尔(1ambert —Beer) 定律
当显色前的样品在测定波长没有吸收峰，而 显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，可 用不加入样品的“试剂空白”作参比溶液，这 种方式最为常用。
第五节 分光光度法的误差
一、物理性原因产生的误差
1. 入射光的纯度 2. 杂散光的干扰
3. 适当的吸光度测定范围
二、化学性原因引起的误差
溶液的浓度、pH 、溶剂、温度等对化学平衡所产生 的影响。由于样品的离解、缔合、与溶剂间产生作用、 形成络合物等原因，导致溶液的各组分间的比例发生 变化。
图1-4 测试波长的选择及影响
测试波长的选择及影响
第四节 测试条件的选择
二、测量狭缝的选择
测定狭缝越窄，单色光“越纯”，分辨率越高，但入射光强度 也随之变弱，仪器噪声增大，于测量不利。
狭缝过宽，单色光的带宽加大，纯度降低，将导致测量灵敏度 的下降和工作曲线线性关系的变差。
狭缝的选择必须根据实际情况兼顾两方面的因素，选择一个 适中的值。
A: 单光束分光光度计
B: 双光束分光光度计
C: 二极管距阵分光光度计 D: 双波长分光光度计
第二节 分光光度计的基本类型和组件
二、分光光度计的基本组件 （一）光源 :
常用的有白炽灯（钨丝灯、卤钨灯等），气体放电灯 （氢灯、氘灯及氙灯等），金属弧灯（各种汞灯）等 多种。
（二）分光系统 (单色器) :
三、吸光度测量范围的控制
在T％＝20～65％(A＝0.7～0.2)的范围内误差相对较小， 当T＝36.8％(A＝0.434)时，测量的误差最小。 为避免较大误差的出现，在测量高浓度样品时必须将样品进
行适当的稀释。
第四节 测试条件的选择
四、参比溶液的选择
常用的空白溶液有以下两种。 1．溶剂空白：
当显色剂及所用其它试剂在测定波长都没有 吸收峰时，可用纯溶剂 (如蒸馏水 )作参比溶液。 2．试剂空白
两种吸光系数表示方式之间的关系是
M
ε＝ 10
·E1%
第二节 分光光度计的基本类型和组件
一、 分光光度计的基本类型
1: 单光束分光光度计 2: 双光束分光光度计 3: 二极管距阵分光光度计 4: 双波长分光光度计
第二节 分光光度计的基本类型和组件
一、 光光度计的基本类型
图1-2 各种类型分光光度计的结构示意图
A＝KLC 它表示溶液的吸光度与溶液浓度和液 层厚度的乘积成正比。
第一节 基本原理
三、吸光系数
吸光系数的物理意义是吸光物质在单位浓度及单位厚度
时的吸光度。
1. 摩尔吸光系数: 指1摩尔浓度的溶液在厚度为1cm时， 在某一特定波长下的吸光度，用 ε或E M 表示。
2. 百分吸光系数 其意义指某物质的1% （W/V）浓度的 溶液，在厚度为1cm时，在某一特定波长下的吸光度，用 E1% 来表示。