葡萄籽提取物中原花青素含量的最佳测定方法

葡萄籽提取物中原花青素含量的最佳测定方法

葡萄籽提取物-原花青素被誉为“最强效的自由基清除剂”，其抗氧化能力是VC的20倍，VE的50倍。也是唯一能透过血脑屏障的抗氧化剂，因此在促进皮肤新陈代谢，分解黑色素，以及提高机体免疫力，延缓衰老方面的应用极为广泛。

葡萄籽提取物由原花青素、儿茶素、表儿茶素、没食子酸等多酚类物质组成的，由于原花青素的成分极其复杂，目前的研究实验中还无法提供原花青素的标准品，因此Bate-Smith 和Porter法只能测定葡萄籽提取物中原花青素的相对含量。

一、Bate-Smith法、Porter法测定葡萄籽原花青素含量

西安源森生物实验室对Bate-Smith法和Porter法测定原花青素相对含量实验进行了研究：（一）Bate-Smith法测定葡萄籽原花青素含量

【实验目的】由于目前没有原花青素的标准品，因此此方法测定的只是葡萄籽提取物中原花青素的相对值，其含量用原花青素指数(procyanidolic index)来表示。

【Bate-Smith法原理】原花青素在酸性条件下加热转化为红色的花青素(图1)。

【实验步骤】称取适量的葡萄籽提取物(约15～40mg)用甲醇溶解，最后定溶于100ml。从中取1ml样品溶液加到10ml比色管中，然后再加入6ml盐酸-正丁醇溶液(5/95,V/V)，在97℃±1下反应40min后，取出迅速冷却，在550nm处测定其吸光度，以甲醇代替提取物溶液作为空白。

原花青素指数=A×7.0/W

W:样品质量(g)；

A:吸光度

【实验结果】由于用Bate-Smith法测得的葡萄籽提取物中原花青素指数一般在80～100之间，有时也可能大于100。因此，目前很多植物提取物生产厂家使用原花青素指数来表示葡萄籽提取物中原花青素的百分含量，是不正确的。

（二）Porter法测定葡萄籽原花青素含量

【实验概述】由于Bate-Smith法测定的结果重现性很差,并且原花青素在此条件下反应不是很彻底。因此Porter等人对Bate-Smith法进行了改进。Porter法改进之处主要是在试剂中添加了Fe3+，以提高反应的程度和颜色的稳定性。此方法测定的也是原花青素的相对含量，结果用PVU(porter value unit)表示。

【实验步骤】称取适量的葡萄籽提取物(约10～30mg)用甲醇溶解，最后定溶于100ml。从中取1ml样品溶液加到10ml比色管中，然后依次加入6ml盐酸-正丁醇(5/95,V/V)，0.2ml 2.0%硫酸铁铵溶液(用2mol.L-1的盐酸溶解),在97℃±1下反应40min后,取出迅速冷却,在550nm 处测定其吸光度,以甲醇代替提取物溶液作为空白。

PVU=A×7.2/W

W:样品质量(g)；

A:吸光度

【实验结果】美国葡萄籽方法评定委员会认为葡萄籽提取物的PVU在250～350之间是比较理想的。

PVU过高，说明该产品中高聚体原花青素含量较高；

PVU过低，可能说明该产品中原花青素的含量较低。

但由于porter法不能区分测出的是何种原花青素,所以若一种葡萄籽提取物测出的PVU=300，则该产品可能是低聚体原花青素含量较多，也可能是单体和高聚体原花青素含量较多。

（三）Bate-Smith法和Porter法测定葡萄籽原花青素含量实验结论

Bate-Smith法测得原花青素指数一般在80～100之间，有时甚至可能大于100；而Porter 法所得PVU值无法明确是葡萄籽提取物中高聚体原花青素含量还是原花青素的含量。因此上述两种方法不能都作为葡萄籽提取物中总多酚或原花青素的定量分析方法。

据此实验结论，西安源森生物实验室另辟蹊径，探索出一种新的测定葡萄籽原花青素含量的方法——Folin-Ciocalteau法与HPLC相结合法：

由于葡萄籽提取物由原花青素和几种单体组成，因此原花青素的含量可用葡萄籽提取物中总多酚的含量减去其中单体含量求得。葡萄籽提取物总多酚含量可采用Folin-Ciocalteau 法测定，单体的含量采用高效液相(HPLC)测定。因此，本次实验中，西安源森生物实验室采用Folin-Ciocalteau法和HPLC相结合的方法来测定葡萄籽提取物中原花青素的含量。

二、Folin-Ciocalteau法与HPLC相结合测定葡萄籽提取物中原花青素含量

【实验步骤】

(一)实验条件

1. 材料

葡萄籽提取物:西安源森生物科技有限公司实验室专项制备

2. 仪器和试剂

（1）瑞士BUCHI R-200真空旋转蒸发仪。Wa-ter公司1525 HPLC。色谱柱:Hypersil ODS 150mm×4mm,5μm。

（2）Folin-Ciocalteau试剂

（3）没食子酸，儿茶素，表儿茶素标准品；

表儿茶素没食子酸酯；

乙睛。

3. 色谱条件

检测波长:280nm；

柱温:30℃；

流速:1mL/min；

流动相：A,20.0%乙酸；

B，80% 乙腈；

采用梯度洗脱：0min-85min,100%-20%A;

进样量:10μL

（二）葡萄籽提取物中总多酚的测定:Folin-Cio-calteau法

1. 原理

葡萄籽提取物中总多酚的测定一般采用Folin-Ciocalteau法进行测定。

在碱性溶液中，酚类化合物可以将钨钼酸还原(W6+变为W5+)，生成蓝色的化合物，颜色的深浅与多酚含量呈正相关，蓝色化合物在760nm处有最大吸收。Folin-Ciocal-teau法测定总多酚一般用没食子酸作为对照品。葡萄籽提取物中总多酚的含量以等同于没食子酸(gallicacid equivalent)表示。

2. 标准曲线的制定

①准确称取真空干燥至恒重的没食子酸对照品44.3mg→水溶解并定容至100ml；

②以此溶液配成浓度为8.86，17.72，35.44，53.16，70.88，88.60μg/ml的溶液；

③分别取上述不同浓度溶液1ml加到10ml比色管中→依次加入1ml去离子水→0.5ml Folin-Ciocalteau试剂→1.5ml 26.7%Na2CO3溶液→用水定容至10ml→室温下反应2小时→在760nm下测定其吸光度。

由吸光度对浓度进行回归，求得标准曲线：

3. 葡萄籽提取物中总多酚含量的测定

准确称取适量的葡萄籽提取物，用水溶解，浓度在0.08mg/ml左右。

取1ml样品液加到10ml比色管中→依次加入1ml去离子水→0.5mlFolin-Ciocalteau试剂→1.5ml 26.7%Na2CO3溶液→用水定容至10ml，室温下反应2小时→在760nm下测定其吸光度。

测得的吸光度代入以上标准曲线，即可求得葡萄籽提取物中总多酚的含量。源森生物实验室特制葡萄籽提取物多酚含量为91.2%(按绝对干重计算)。

（三）葡萄籽提取物中单体含量的分析

葡萄籽提取物中的单体主要包括四种:儿茶素、表儿茶素、没食子酸、表儿茶素没食子酸酯，这四种单体的含量占到了葡萄籽提取物中单体含量的90.0%以上。

美国葡萄籽方法评定委员会(The grape seed method evaluation of committee)建议用上述四种单体的含量来标定葡萄籽提取物中单体的总含量。因此西安源森生物实验室的本次实验中，仅测定葡萄籽提取物中这四种单体的含量。

1. 精密称取80℃减压干燥至恒重的上述四种对照品适量，用甲醇分别配制标准溶液，浓度在8.0～90.0μg/mL之间；

分别精密取10μl注入色谱仪；

以峰面积积分值对进样量进行回归，求得标准曲线；