手性异构体杂质的控制—王旸2015.11
手性异构体杂质的控制—王旸2015.11
内容
一、简介 二、起始物料（天然来源/半合成） 三、过程控制 四、质量标准 五、案例 六、总结
不对称合成
• 采用立体选择性或专属性反应（包括酶反 应）引入所需构型的手性中心
反应的选择性和专属性 后续反应对手性中心的影响
• 采取措施
对不对称反应机理、条件和立体选择性的充分 了解 对工艺条件进行优化筛选 对毒性较大的催化剂进行残留控制
定量方法
• 可采用异构体对照品法、自身对照法和面 积归一化法
如采用杂质对照品法，需对对照品的制备和构 型进行详细研究，并制定质量标准 一般可采用自身对照法 如主成分与异构体在同一线性质量标准
原料药：在性状、鉴别、检查和含量项下 制剂：考虑制剂过程和贮运过程对产品的影响 ，根据评估结果在标准中进行控制
考虑制剂过程和贮运过程对产品的影响根据评估结果在标准中进行控制稳定性在影响因素加速和长期试验中进行考察一般情况下仅采用旋光度缺乏专属性含有多个手性中心时建议对非对映异构体也进行控制一简介二起始物料天然来源半合成三过程控制四质量标准五案例六总结为单季铵类中效去极化神经肌肉阻滞药物通过竞争胆碱能受体起阻断乙酰胆碱的作用临床主要作为全身麻醉辅助用药用于全麻时的气管插管及手术中的肌肉松弛本品含有多个手性中心仅通过终产品的质量标准控制非常困难应当多方面措施结合结构确证工作通过过程控制的方法进行全面控制起始物料为雄甾烷类化合物与天然构型的5雄甾烷构型一致因此可在核磁共振氢谱碳谱等研究基础上通过比旋度熔点等理化常数进行控制查阅文献以确定反应条件温度时间所用试剂等对关键手性中间体的光学性质进行控制可以参照文献方法为更有效地控制质量建议在内控标准中采用合适的色谱方法对光学异构体进行控起始物料也可以采用表雄酮对其控制方法与内容与雄甾烷类似物一致另外市场上可采购到中间体如生产工艺明确产品质量有保证可以作为起始原料手性中心均由起始物料引入需特别关注起始物料的异构体控制在保证起始原料来源可靠的前提下需追溯其合成工艺对关键手性中间体关键步骤的工艺参数进行严格控制维库溴铵为已上市产品结构确证方面的文献报道数据较多可进行对比研究对比研究时应采用一致的条件如文献报道的氢谱和碳谱均采用cdcl52c进行
手性拆分
手性是自然界的一种普遍现象，构成生物体的基本物质如氨基酸、糖类等都是手性分子。
手性异构体(对映体)在药物中占有很大的比例，据统计，已知药物中约有30%~40%是手性的［1］。
经由化学合成得到的药物往往是对映体，不是单一的光学异构体。
虽然其物理化学性质基本相同，但是由于药物分子所作用的受体或靶位是氨基酸、核苷、膜等组成的手性蛋白质和核酸大分子等，它们对与其结合的药物分子的空间立体构型有一定的要求，因此，对映体药物在体内往往呈现很大的药效学、药动学等方面的差异(图1)。
鉴于此，美国食品医药管理局(FAD)规定，今后研制具有不对称中心的药物，必须给出手性拆分结果［2］，欧共体也采取了相应措施，因此手性拆分已成为药理学研究和制药工业日益迫切的课题。
利用化学拆分法、超临界流体色谱法、膜法、酶法以及模拟流动床法分离药物对映体，已成为新药研究和分析化学的领域之一。
本文综述了近几年来利用上述方法拆分手性异构体研究的新进展。
1 化学法 化学拆分法是广泛使用的一种方法，经典的化学拆分是利用手性试剂与外消旋体反应，生成两个非对映异构体，再利用其物理性质的差异将其拆分。
但此类方法存在收率较低、拆分剂消耗大及在拆分的化合物类型上受到限制等缺点。
近几年来，随着主客体化学的深入研究而发展起来的包结拆分(inclusion resolution)由于其拆分效率高、操作简单及适用条件广泛等优点而受到重视。
包结拆分的基本原理是：手性主体化合物通过氢键及分子间的次级作用，选择地与客体分子中一个对映体形成稳定的包结络合物析出来，从而实现对映体的分离，如图2所示［3］。
由于包结拆分中主体分子与客体分子间不发生任何化学反应，只是通过分子间作用力来实现拆分，因而很容易地通过如柱、溶剂交换以及逐级蒸馏等手段与客体分离和可循环使用［4］。
甾类化合物是最优良的包结主体之一，因为其化学结构中富含多种功能基且刚性很强，其中胆汁酸类衍生物(图3)广泛地应用于手性醇、酮及手性亚砜类化合物的拆分。
原料药质量研究：异构体杂质的研究
原料药质量研究：异构体杂质的研究什么是同分异构体？⼴义就是分⼦量⼀样，结构不⼀样，例如醇和醚就可能是同分异构体，但是对于药物研发的异构体杂质来讲，就不是简单的分⼦量⼀样，还需要官能团⼀样。
什么是同系物？官能团⼀样的同时，相差n个CH2的碳。
对于药物研发的同系物杂质，⼀般官能团⼀样的同时，碳个数⼀般相差不⼤，1-3个。
杂质种类和控制药物研发中的异构体杂质主要包括以下⼏种情况：1. 碳碳双键的顺反异构体杂质（顺反异构）。
2. ⼀个⼿性中⼼的对映异构体杂质，多个⼿性中⼼的对映异构体杂质和⾮对映异构体杂质（光学异构）。
3. 相近活性不同位置的取代或者加成的位置异构体杂质（位置异构）。
4. 相同个数碳的碳链异构体杂质（碳链异构）。
5. 药物研发中，有时候因为物料来源问题，可能涉及到同系物杂质问题，这些杂质也统筹为异构体杂质研究，因为结构相似，只是碳个数不⼀样，理化性质可能和异构体杂质类似。
与API或者中间体结构相似，⼤多数情况下，去除能⼒有限，是⼯艺研究的重点。
如果能在前期控制，⼀定要在前期控制，质量研究压⼒前移。
这⾥的前期⼀般指引⼊异构体的源头。
例如，起始原料的位置异构体研究和控制，某物料碳链异构体杂质的研究和控制。
如果源头控制位置异构体或者碳链异构体到⼀定限度以下，例如0.10%以下，在API中不控制其衍⽣物，其风险是很低的。
光学异构体杂质虽然可以在源头研究和控制，但是合成⼯艺过程中可能引发⼿性中⼼消旋，尤其吸电⼦基团的α-位置有活泼氢的⼿性中⼼，所以这类光学异构体杂质有时候在源头有研究控制，在末端API也要有研究控制。
碳碳双键杂质在源头研究控制，后续⼯艺中，相⽐⼿性中⼼消旋⽽⾔，⼀般很难发⽣顺反变化。
如果源头控制在0.10%以下，后⾯API的风险相对不是很⼤。
当然，这也和分⼦结构和反应条件有关。
⼀般光照容易导致碳碳双键顺反异构。
做影响因素的光照实验，有碳碳双键的API要格外⼩⼼了，可能引起双键顺反异构，此时即使源头有很严的控制，API中也要对应研究。
手性配合物_M_bipy_3_2_M_Fe_Ru_Os_圆二色谱的理论解析
吻合. 对跃迁性质的分析表明, 三个配合物在长波区, 除[Fe(bipy)3]2+的第一个谱带是以 d-d
跃迁为主外, 其他谱带均是荷移跃迁为主. 短波区的两个强带则是以π-π*跃迁为主的激子
耦合带: 对于铁配合物, TDDFT 可以正确预言其正负带的强度比, 但对钌和锇配合物而言,
由于对激子跃迁中荷移成份的贡献估计不足, 计算的比值偏小. 这一结论为进一步改进有
关于铁族 2,2′-联吡啶配合物的实验研究已有很多, 但理论分析方面只有些零散的工作. 特别是在第一性 原理计算 1) 基础上对其手征光学性质的系统分析工作
1) 第一性原理(First Principle)计算, 指的是基于量子力学的基本原理和假设而不使用任何经验参数的计算方法. 通常所说的 HF 从 头计算法、DFT 方法和 TDDFT 方法等都是满足这一要求的, 因而都是基于第一性原理的计算方法.
图 2 [M(bipy)3]2+的 DFT 能级图
Kohn-Sham 轨道的示例见图 3. 尽管 Kohn-Sham 轨道 并不是传统的分子轨道, 但其能级分布和空间伸展 的特征仍然决定了有关跃迁的归属与性质.
由图 2 可以看出, 配合物的 DFT 能级被四个显 著的能隙分成五组, 其中占据轨道有三组, 空轨道有 两组, 且占据轨道和空轨道之间的能隙是随着中心
图 1 Λ-[M(bipy)3]2+的结构示意
圆二色谱的计算中, 对于给定跃迁的带形采用
了 Gauss 函数近似, 约束条件是其积分强度正比于该
跃迁的旋转强度 R. 如果跃迁波长λ0 和 ∆εmax e 处的
半带宽度 Γ 以 nm 计, R 以 DBM(德拜玻尔磁子)为单
位, 其表达式为[17]:
关于合成多肽中差向异构体杂质的研究
关于合成多肽中差向异构体杂质的研究康建磊1963年，美国著名生物化学家Bruce Merrifield 发明了多肽固相合成法，经过四十多年的发展，固相合成法已广泛应用于多肽和蛋白质的研究领域。
固相合成法的基本原理是以连接于固相载体的第一个氨基酸为起点，经活化、耦合、脱保护的循环过程，将保护氨基酸逐一“组装”形成目标肽，由于氨基酸多为手性分子（甘氨酸除外），在肽合成的过程中不可避免的存在消旋化的可能，这可能导致肽分子部分或全部立体化学信息的丢失。
如一个10肽的合成中，每个氨基酸发生1％的差向异构化，则生成的非对映异构体混合物中只有90.4％的肽含有正确的立体构型。
而对于一个50肽，理论上就只有60.5％为目标立体构型产物。
由于肽类药物的生物活性与其立体构型密切相关，因此差向异构体杂质的研究是多肽药物有关物质研究的重要内容之一。
一、多肽合成中氨基酸差向异构化的机制1、直接烯醇化机制肽缩合过程中，在碱的作用下失去羧基α位质子，经烯醇式中间体发生消旋，消旋速率依赖于活化羧基α位质子的酸性、溶剂、温度及碱的化学性质。
2、5(4H)-噁唑酮机制DL-肽 LL-肽在氨基酸活化时，产生立体化学不稳定的5(4H)-噁唑酮中间体（D/L-4）是缩合反应中发生消旋的主要原因。
形成噁唑酮的倾向与化合物1中活化基X的活化能力及N-酰基R1-CO-的电子特征密切相关。
尽管有消旋化倾向，噁唑酮依然代表羧基活化的氨基酸衍生物应用于肽链合成中。
反应中的消旋程度取决于噁唑酮的形成能力及其氨解速度。
二、差向异构体的控制及检查方法1、差向异构体的过程控制首先，应注意手性合成原料的控制。
合成多肽中各手性中心直接来源于合成原料—各种保护氨基酸，因此应注意加强合成原料—保护氨基酸立体构型的控制，在内控质量标准中增加光学纯度的控制。
由于比旋度方法专属性、灵敏度方面的限制，建议采用手性HPLC法控制起始原料的光学纯度，对于比旋度数值较小的保护氨基酸更应如此，如Fmoc-Glu(OtBu)-OH为+1.2o、Fmoc-Gln(Trt)-OH为-1.0o，比旋度法根本无法有效控制其光学纯度。
高效液相色谱法在手性药物对映异构体拆分中的应用
高效液相色谱法在手性药物对映异构体拆分中的应用随着不对称合成技术及手性拆分技术日趋成熟，手性药物研究已经成为新药研发的一大热点。
由于手性药物的对映体之间在药效学、药代动力学等方面存在较大差异，因此建立手性拆分的质量控制方法十分重要。
一、什么是手性异构和对映异构体当药物分子中碳原子上连接有4个不相同的基团时，该碳原子被称为不对称碳或手性碳（中心），会导致药物分子存在异构体，如果两个异构体之间的关系如同一个物体的立体结构在照镜子，这个立体结构和它在镜子中的像互为对映异构体（对映体）。
图1是手性对映异构体的图示。
图1手性对映异构体图示对映体具有相同的物理性质（如熔点，沸点，溶解度，折射率，酸性，密度等），热力学性质（如自由能，焓、熵等）和化学性质。
除非在手性环境（如手性试剂，手性溶剂）中才表现出差异。
对映体对偏振光的作用不同，它们的比旋光度数值相同，但方向相反。
对映体的生物活性不相同，化学反应中表现出等速率。
等量的左旋体与右旋体的混合物构成外消旋体。
从对映体中分离出单纯一个光学异构体的方法称手性拆分。
最普通的手性拆分方法是消旋旋体与光学活性相反的离子（称拆分剂）作用生成非对映体。
手性药物对映体拆分的方法主要有非色谱法和色谱法。
非色谱法（主要包括结晶法、微生物消化法等）耗时长，过程繁琐不能制备高纯度对映体，色谱法是基于把对映体的混合物转换成非对映异构体，然后利用它们在化学或物理性质上的差异进行分离。
主要包括气相色谱(GC)、超临界流体色谱(SFC)、毛细管电泳(CE)和毛细管电色谱(CEC)等。
表1罗列了色谱手性拆分的发展史。
其中高效液相色谱(HPLC)因其独特的优势成为手性分析领域最常用的一种技术。
表1色谱手性拆分发展史年份里程碑1939年Henderson和Rule在乳糖上色谱分离外消旋樟脑衍生物1984年Armstrong和DeMond：制备出硅胶键合环糊精固定相二、HPLC手性拆分方法手性药物拆分法通常分为直接法和间接法两大类。
氨基酸酰胺色谱分离和亚磺酰胺不对称催化
摘要氨基酸酰胺色谱分离和亚磺酰胺不对称催化摘要大多数天然产物具有手性。
随着对手性物质研究的深入，越来越多的手性化合物在药物、精细化学品以及材料等方面得到了广泛的使用。
手性化合物中的对映异构体具有很多相近的理化性质，但是，不同手性的对映体在生命体内的表现有很大的差别。
因此，获得对生命体有益作用的异构体对人们来说变得尤其重要。
获得这些单一光学纯异构体的一般方法是手性拆分、手性试剂合成、不对称催化和生物合成。
本文将分为两大部分，分别对手性化合物的高效液相色谱的手性拆分和新型手性配体的合成及其不对称催化进行论述。
第一部分：手性氨基酸酰胺衍生物的液相色谱分离。
在众多的手性分离方法中，高效液相色谱手性固定相法使用越来越普遍，手性化合物大多能通过这种手段进行拆分。
手性氨基酸酰胺类衍生物是一种应用广泛的手性药物中间体，但是使用手性固定相对氨基酸酰胺衍生物进行拆分的报道还很少，所以对它进行拆分研究很有意义。
首先，采用课题组以前报道合成方法对10种氨基酸酰胺衍生物进行合成，然后对这10种氨基酸酰胺衍生物通过高效液相色谱手性固定相法进行手性拆分研究。
在正相色谱条件下，改变不同的色谱条件，选出最优分离条件。
其次，在优化后的色谱条件下，根据不同条件下的参数进行比较分析，根据化合物结构的差别解释不同基团对分离效果的影响，对手性拆分机理进行简要的阐述。
第二部分：N-芳基亚磺酰胺-烯手性配体的不对称催化。
手性配体在不对称催化研究中扮演着十分重要的角色。
目前，使用比较普遍的是具有“优势结构”的膦、亚砜以及亚磺酰胺类等手性配体。
本次实验通过合成结构简单的亚磺酰胺配体进行催化反应研究。
首先，在以前实验的基础上合成了几种手性亚磺酰胺-烯配体。
这些手性配体用于铑催化的芳基硼酸对环状α,β-不饱和酮的共轭加成反应。
以环己烯酮和芳基硼酸作为底物分别对手性配体、碱和溶剂的种类进行条件优化。
其次，在最优的实验条件下，分别对α,β-不饱和酮、硝基苯乙烯、苯偶酰、三氟苯乙酮等与一系列的芳基硼酸化合物进行反应普适性的考察。
手性化合物拆分过程中的监控方法
手性化合物的分离 1．手性化合物的结晶拆分方法 1．1自发结晶拆分法( spontaneous resolution) 自发结晶拆分是指当外消旋体在结晶的过程中,自发 的形成聚集体。 可将非聚集体的化合物通过衍生化的方法转变成具 有聚集体性质的化合物。 如将α-2苯乙醇和3 ,5-2二硝基苯甲酸形成酯后可得 到聚集体性质的固体从而进行拆分：
1．5 通过形成非对映体的结晶法 利用外消旋体的化学性质使其与某一光学活性试剂(拆分剂)作用 以生成2种非对映异构体的盐或其他复合产物,然后利用2种非对 映异构体的盐的溶解度差异,将它们分离,最后再脱去拆分剂,便可 以分别得到一种对映异构体。这是一种经典的应用最广的方法。 适用于这类光学拆分方法的外消旋体有酸、碱、醇、酚、醛、酮、 酰胺及氨基酸。 如用碱类化合物: 生物碱、萜类化合物、氨基酸及其碱性的衍生 物等来拆分酸和内酯;手性羧酸如酒石酸及其酰基衍生物、扁桃 酸及其衍生物等来分别拆分外消旋的胺类化合物。 1．6 组合拆分 原理为采用一组同一结构类型的手性衍生物的拆分剂家族代替单 一的手性拆分剂进行外消化合物的拆分。这些拆分剂家族是以常 用的手性拆分剂为原料经结构修饰得到的衍生物,也可以是含有 不同取代基的某一类结构类型的化合物,如α-2苯乙胺类拆分剂家 族PE2I ,PE2 分;酒石酸类衍生物的拆分剂家族T 和TA ,对位取代的扁桃酸 (M) ,N2取代的苯甘氨酸(PGA) ,邻位取代的苯丙二醇磷酸酯(P)等, 通常用于碱性化合物的拆分,其中拆分剂家族P,PGA 和M还可以 用于氨基醇类化合物的拆分。
含手性轴旋光异构体的构型 把手性轴一端标为X，另一端 标为Y，沿XY轴观察，靠近 观察者一端的原子或基团近 基，远离察者一端的原子或 基团是远基，根据近基优先 于远基，并按次序规则标a， b，c，d，次序a>b>c>d，由 x轴观察时，如下： 再采用1，2，5规则。例如：
手性药物质量控制研究技术指导原则
手性药物质量控制研究技术指导原则一、概述三维结构得物体所具有得与其镜像得平面形状完全一致,但在三维空间中不能完全重叠得性质,正如人得左右手之间得关系，称之为手性。
具有手性得化合物即称为手性化合物。
手性就是自然界得一种基本属性,组成生物体得很多基本结构单元都具有手性，如组成蛋白质得手性氨基酸除少数例外，大都就是L-氨基酸;组成多糖与核酸得天然单糖也大都就是Ｄ构型。
作为调节人类得相关生命活动而起到治疗作用得药物,如果在参与体内生理过程时涉及到手性分子或手性环境,则不同得立体异构体所产生得生物活性就可能不同。
手性化合物除了通常所说得含手性中心得化合物外,还包括含有手性轴、手性平面、手性螺旋等因素得化合物。
在本指导原则中所指得手性药物主要就是指含手性中心得药物，其它类型得手性药物也可参考本指导原则得基本要求。
手性药物就是指分子结构中含有手性中心（也叫不对称中心)得药物,它包括单一得立体异构体、两个以上(含两个）立体异构体得不等量得混合物以及外消旋体。
不同构型得立体异构体得生物活性也可能不同,大致可分为以下几种情况【1】：1)药物得生物活性完全或主要由其中得一个对映体产生。
如S －萘普生在体外试验得镇痛作用比其Ｒ异构体强3５倍。
2)两个对映体具有完全相反得生物活性。
如新型苯哌啶类镇痛药-哌西那朵得右旋异构体为阿片受体得激动剂,而其左旋体则为阿片受体得拮抗剂。
3)一个对映体有严重得毒副作用。
如驱虫药四咪唑得呕吐副作用就是由其右旋体产生得。
4）两个对映体得生物活性不同，但合并用药有利。
如降压药－萘必洛尔得右旋体为β-受体阻滞剂,而左旋体能降低外周血管得阻力,并对心脏有保护作用;抗高血压药物茚达立酮【2】得R异构体具有利尿作用,但有增加血中尿酸得副作用,而Ｓ异构体却有促进尿酸排泄得作用,可有效降低R异构体得副作用,两者合用有利。
进一步得研究表明, S与Ｒ异构体得比例为１:４或１:8时治疗效果最好。
５)两个对映体具有完全相同得生物活性【3】。
关于手性药物药学研究的几点看法
关于手性药物药学研究的几点看法伴随着手性拆分技术以及不对称合成技术的日益成熟，手性药物的研究已成为新药研究的一大热点。
1992年1月美国FDA发布有关手性药物的指导原则。
据不完全统计，1999年美国FDA批准上市的37个新药中，18个为手性药物，其中16个为单一的对映体。
目前世界上正在开发1200种新药中，有820种为手性药物，其中612种以单一的对映体进行开发。
而在实际使用中，手性药物所占的比重也越来越大。
如1999年手性药物在全世界的销售额达到1150亿美元，比1998年的998亿美元增加了15.2%，约占当年药品总收入（3600亿美元）的三分之一。
具体到国内的新药研究领域，对单一的立体异构体药物的研究也越来越重视，申报品种逐渐增加。
由于手性药物的立体化学特征，以及体内酶、受体等生物大分子的立体特异性，对这类药物的研究及审评都有其特殊之处。
为更好地审评此类药物，我专业组先期进行了一些文献调研工作：除美国FDA外，欧盟（具体要求同ICH）、加拿大及ICH都对手性药物的研发提出了一些具体要求。
药审中心根据以往审评工作结合与国内有关专家的专题讨论，对此问题也提出了初步的审评要点。
现将各方的情况简要概括如下：一、ICH对手性药物的要求ICH的指导原则对合成工艺、结构确证及稳定性研究均无明确要求，对质量标准的要求为：原料药：立体专属性的鉴别试验；规定另一异构体的限度；含测方法最好选用手性分析方法，如为非手性方法，则需同时采用其他对另一异构体的控制手段。
制剂：应有立体专属性的鉴别试验。
如果另一异构体不是降解产物，则不要求检测其含量，但鼓励采用立体专属性方法从严控制。
二、FDA对手性药物的要求对合成工艺、结构确证及质量标准均无明确要求，总体政策是应以立体化学的观点，采用合适的生产及控制手段来保证药物的鉴别、含量、质量及纯度。
但对稳定性研究提出了要求：原料药及制剂的稳定性研究应使用能评价其立体构型完整性的方法。
手性高效液相色谱法测定虫酰肼原药中的异构体杂质
第12卷第2期现代农药V ol.12 No.2农药分析手性高效液相色谱法测定虫酰肼原药中的异构体杂质魏 泱，蔡玉梅，秦 虓（北京颖泰嘉和生物科技有限公司，北京 100192）摘要：采用高效液相色谱法，使用Chiralcel OD-H手性柱，对虫酰肼原药中主成分与异构体进行了分离，并对异构体杂质进行了定量分析。
结果表明，该方法分析异构体杂质的线性相关系数为0.9997，变异系数为0.25%，回收率在98.57%～101.47%之间。
关键词：虫酰肼；异构体杂质；手性高效液相色谱法；定量分析中图分类号：TQ 450.7 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1671-5284.2013.02.009Analysis of Isomer Impurity in Tebufenozide TC by Chiral HPLCWEI Yang, CAI Yu-mei, QIN Xiao(Nutrichem Company Limited, Beijing 100192, China)Abstract:A quantitative analytical method for isomer impurity in tebufenozide TC was established by chiral HPLC using Chiralcel OD-H column. The results showed that the linear correlation coefficient was 0.9997, the coefficient of variation was 0.25%, and the recoveries were between 98.57% and 101.47%.Key words: tebufenozide; isomer impurity; chiral HPLC; quantitative analysis虫酰肼[化学名称：N-特丁基-N'-(4-乙基苯甲酰基)-3,5-二甲基苯甲酰肼，结构式如图1所示] 是酰肼类昆虫生长调节剂，其作用机理在于诱导昆虫提前蜕皮，但同时又使其蜕皮过程无法完全进行，从而达到杀灭害虫的目的[1]。
【最新word论文】手性高效液相色谱法检测恩替卡韦中光学异构体杂质的含量【临床医学专业论文】
手性高效液相色谱法检测恩替卡韦中光学异构体杂质的含量作者：王文娜邓桂凤张玲娣姚彤炜【摘要】采用Chiralpak AD H手性柱(250 mm×4.6 mm， 5 μm)，建立了正相高效液相色谱(NP HPLC)法直接拆分恩替卡韦与其光学异构体的方法。
考察了流动相组成、酸碱性对柱效、分离度、保留时间等参数的影响。
经优化，以正己烷 异丙醇 乙醇 三氟乙酸 三乙胺(70∶12∶18∶0.05∶0.05，V/V)为流动相，流速0.5 mL/min;检测波长261 nm。
在此条件下，恩替卡韦与光学异构体分离度>4.2;光学异构体的检出限为0.12 mg/L，在0.25～4.0 mg/L浓度范围内有良好的线性关系;日内与日间精密度RSD<4.0%;按标准加入法计算，加样回收率在87.0%～100.8%之间; RSD<3.0%;按外标法计算，加样回收率在98.2%～110.4%之间; RSD<3.0%。
本方法可作为恩替卡韦原料药中光学异构体杂质限量的控制方法。
【关键词】恩替卡韦，光学异构体，高效液相色谱法，手性拆分1 引言慢性乙肝病毒感染一直是全球公共卫生的难题，开发抗乙肝病毒药物也一直是个热点。
目前，我国临床上应用的抗病毒治疗药物主要有两类：α 干扰素和核苷或核苷酸类似物，主要包括拉米夫定、阿德福韦和阿昔洛韦[1,2]。
2005年3月美国FDA批准了新一代抗HBV核苷类似物恩替卡韦(entecavir，ETV，商品名Baraclude)上市[3]。
恩替卡韦是一种鸟嘌呤核苷类似物(图1)，图1 恩替卡韦及其光学异构体的化学结构Fig.1 Structures of entecavir and its optical isomer在磷酸激酶的作用下在体内形成活性三磷酸化合物，拮抗HBV所需天然底物脱氧鸟苷三磷(dGTP)，抑制HBV DNA聚合酶和逆转录酶，阻断HBV复制。
一种泊沙康唑关键中间体对映手性异构体的检测方法[发明专利]
![一种泊沙康唑关键中间体对映手性异构体的检测方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/a8cc0a2ec381e53a580216fc700abb68a982ad80.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810861872.5(22)申请日 2018.08.01(71)申请人 郑州泰丰制药有限公司地址 451162 河南省郑州市新郑港区建设路3号(72)发明人 沙薇 马宗普 吕艳歌 (51)Int.Cl.G01N 30/02(2006.01)(54)发明名称一种泊沙康唑关键中间体对映手性异构体的检测方法(57)摘要本发明为一种用于检测泊沙康唑关键中间体的对映异构体的方法，具体为使用高效液相色谱法检测(5R -顺)-甲苯-4-磺酸-5-(2,4-二氟苯基)-5-(1H -1,2,4-三氮唑-1-基)甲基四氢呋喃-3-基甲基酯中手性异构体的含量以及和主峰有效分离的方法，采用的色谱条件为：色谱柱为CHIRALPAK AD-H色谱柱，柱温为20～45℃，检测波长为225nm，流动相为正己烷和乙醇的混合物，流速为0.5～1.5mL/min。
在实际检测过程中，本方法的检测限达0.12μg/mL，即可以检出关键中间体中高于0.012％的对映异构体，实用性强，检测过程简单、快捷。
权利要求书1页 说明书6页 附图1页CN 110794042 A 2020.02.14C N 110794042A1.一种用于检测泊沙康唑关键中间体对映异构体的方法，所述泊沙康唑关键中间体为(5R -顺)-甲苯-4-磺酸-5-(2,4-二氟苯基)-5-(1H -1,2,4-三氮唑-1-基)甲基四氢呋喃-3-基甲基酯，所述对映异构体为(5S ,3R ）-5-（2,4-二氟苯基）-5-（1,2,4-三唑-1-甲基）四氢呋喃-3-甲醇对甲苯磺酸酯，包括如下步骤：1）配置泊沙康唑关键中间体及其对映异构体混合对照溶液和供试品溶液；2）用高效液相色谱检测供试品溶液和对映异构体混合对照溶液，色谱条件：采用直链淀粉的衍生物类手性柱，以正己烷-低级醇溶液为流动相，对泊沙康唑关键中间体及其对映异构体进行洗脱；3）根据供试品溶液的色谱图和手性异构体混合对照溶液的色谱图，确定供试品溶液中对映异构体的限度。
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起始原料雄甾烷
• 起始物料为雄甾烷类化合物，与天然构型 的5-雄甾烷构型一致，因此，可在核磁共 振氢谱、碳谱等研究基础上，通过比旋度 、熔点等理化常数进行控制
O H H H H H
合成中间引入的杂质
• 查阅文献以确定反应条件（温度、时间、 所用试剂等） • 对关键手性中间体的光学性质进行控制（ 可以参照文献方法） • 为更有效地控制质量，建议在内控标准中 采用合适的色谱方法对光学异构体进行控 制
鉴别/杂质/含量
• 非对映异构体可采用一般方法分离，对映 异构体需采用手性柱
分为手性固定相和手性流动相 间接拆分法采用手性试剂进行衍生化得到
分析方法的验证
• 可参照相关技术指导原则
立体专属性，可采用消旋体或与对映异构体混 合方法进样 同时需考虑其他杂质对异构体的影响，如中间 体和粗品进行系统适用性试验 采用强制降解杂质进行专属性试验 如有必要，可选择不同的检测波长以避免其他 杂质的干扰 方法学验证的其他方面参考相关指导原则
手性异构体杂质的控制
王旸
2015年11月
内容
一、简介 二、起始物料（天然来源/半合成） 三、过程控制 四、质量标准 五、案例 六、总结
内容
一、简介 二、起始物料（天然来源/半合成） 三、过程控制 四、质量标准 五、案例 六、总结
简介
• 三维结构的物体所具有的与其镜像的平面 形状完全一致，但在三维空间中不能完全 重叠的性质，正如人的左右手之间的关系 ，称之为手性。
内容
一、简介 二、起始物料（天然来源/半合成） 三、过程控制 四、质量标准 五、案例 六、总结
不对称合成
• 采用立体选择性或专属性反应（包括酶反 应）引入所需构型的手性中心
反应的选择性和专属性 后续反应对手性中心的影响
• 采取措施
对不对称反应机理、条件和立体选择性的充分 了解 对工艺条件进行优化筛选 对毒性较大的催化剂进行残留控制
手性中心的控制策略
• 本品含有多个手性中心，仅通过终产品的 质量标准控制非常困难，应当多方面措施 • 对起始物料控制 • 对合成试剂的控制 • 对合成工艺的控制 • 结合结构确证工作，通过过程控制的方法 进行全面控制
合成工艺
手性引入顺序
• • • • • 本品共有10个手性中心 起始物料中引入6个手性中心 合成过程中引入4个手性中心 其中与哌啶反应引入3个手性中心 催化氢化引入1个手性中心
定量方法
• 可采用异构体对照品法、自身对照法和面 积归一化法
如采用杂质对照品法，需对对照品的制备和构 型进行详细研究，并制定质量标准 一般可采用自身对照法 如主成分与异构体在同一线性范围内，可采用 面积归一、检查和含量项下 制剂：考虑制剂过程和贮运过程对产品的影响 ，根据评估结果在标准中进行控制
构型的确证
• 维库溴铵为已上市产品，结构确证方面的 文献报道数据较多，可进行对比研究
对比研究时应采用一致的条件 如文献报道的氢谱和碳谱均采用CDCl3，52C进 行。由于测试温度对信号峰的裂分有很大影响 ，建议参照文献条件进行。 在构型确证时，需关注与手性中心相关的碳、 氢信号
总结
• 手性异构体对药物的质量影响较大，应当 进行详细的研究 • 根据研究的结果和实际工艺水平制定合理 的控制方法（过程控制/关键工艺、中间体 ；终点控制/质量标准） • 在申报资料中进行阐述
手性化合物的分类
• 手性是自然界的一种基本属性，如天然氨 基酸（多为L型），组成多糖和核酸的单糖 （多为D型） • 广义的手性化合物除含有手性中心外，还 包括手性轴、手性平面和手性螺旋等。 • 本节内容仅对含有手性中心的化合物进行 讨论 • 按照取代基团的顺时针/逆时针，可分为R/S
不同的构型可能有不同的药理活性
• S-萘普生的镇痛作用比R构型强35倍 • 哌西那朵右旋异构体为阿片受体激动剂，左旋体 为阿片受体抑制剂 • 驱虫药四咪唑的呕吐副作用主要由右旋体产生 • 萘比洛尔的右旋体为受体阻断剂，左旋体能降低 外周血管阻力，可合并用药 • 普罗帕酮的两个异构体均可抗心律失常作用
对手性异构体的研究
• • • • • • 原料药制备阶段 结构确证 制剂研究 质量研究 稳定性研究 各药学研究应当是紧密联系，相互印证
O OH N HO H H H H H N N HO H H H H H N
其他合成方法
• 起始物料也可以采用表雄酮，对其控制方 法与内容与雄甾烷类似物一致 • 另外，市场上可采购到中间体，如生产工 艺明确，产品质量有保证，可以作为起始 原料
手性中心均由起始物料引入，需特别关注起始 物料的异构体控制 在保证起始原料来源可靠的前提下，需追溯其 合成工艺，对关键手性中间体、关键步骤的工 艺参数进行严格控制
制剂工艺中的手性问题
• 需考虑手性药物的稳定性：
pH值范围、 固态、液态下的稳定性范围 对光、热、空气的稳定性情况 如在液态下不稳定，则不宜制成口服溶液或注 射剂
处方筛选与工艺研究的重点
• 辅料
考察不同辅料对手性构型的稳定性的影响 如pH值对手性中心的影响
• 工艺
验证工艺条件对手性中心的稳定性 如灭菌前后，手性中心的稳定性
消旋体的拆分
• 采用手性拆分剂与外消旋中间体或终产品 反应分离纯化，再去掉手性拆分剂得到
手性拆分试剂的光学纯度 分离纯化是否完全 拆分及后续反应的构型变化
• 采取措施
选用纯度尽可能高的手性试剂 尽量纯化与拆分剂得到的非对映异构体 必要时，可采用制备色谱
结构确证
• 直接法：单晶X衍射 • 间接法：比旋度、手性色谱、核磁共振、 旋光光谱、圆二色谱 • 化学相关法 • 含有三个以上手性中心的药物，需结合合 成过程进行控制
内容
一、简介 二、起始物料（天然来源/半合成） 三、过程控制 四、质量标准 五、案例 六、总结
起始物料
• 单一异构体的制备
动物/植物体内天然合成，或转化的 合成/半合成方式
起始物料
• 直接从起始物料中引入
起始物料或试剂的光学纯度 后续反应是否会影响到已有的手性中心
• 采取的措施
立体专属性方法严控起始物料的光学纯度 根据后续反应机理，充分分析后续反应是否会 影响手性中心。必要时优化工艺路线。
• 稳定性
在影响因素、加速和长期试验中进行考察 一般情况下，仅采用旋光度缺乏专属性 含有多个手性中心时，建议对非对映异构体也 进行控制
内容
一、简介 二、起始物料（天然来源/半合成） 三、过程控制 四、质量标准 五、案例 六、总结
案例 维库溴铵
• 为单季铵类中效去极化神经肌肉阻滞药物 通过竞争胆碱能受体起阻断乙酰胆碱的作 用，临床主要作为全身麻醉辅助用药，用 于全麻时的气管插管及手术中的肌肉松弛 • 制剂为冻干粉针剂，有2、4、10mg三个规 格 • 本品含有10个手性中心
• 在初步确定处方与工艺的条件下，验证也 可在制剂稳定性试验中进行
内容
一、简介 二、起始物料（天然来源/半合成） 三、过程控制 四、质量标准 五、案例 六、总结
质量研究中与手性中心相关的项目
• • • • 比旋度 鉴别 异构体杂质 含量
比旋度
• 参照药典方法
注意选择光源等测定条件使比旋度数值适中 除钠灯光源外，还可使用汞灯光源 影响因素较多，包括溶剂、浓度、温度、试剂 、仪器等 通常情况下需与更灵敏的方法连用