细胞培养合成培养基

细胞培养合成培养基

合成培养基就是根据天然培养基的成分,用化学物质模拟合成、人工设计、配制的培养基。它有一定的配方,就是一种理想的培养基。目前合成培养基多达10多余种,有的培养基仍在不断进行改良。早期组织培养就是利用天然培养基,目前合成培养基已经成

为一种标准化的商品,从最初的基本培养基发展到无血清培养基、无蛋白培养基,并且还在不断发展。合成培养基的出现极大的

促进了组织培养技术的普及发展。

一、基本组分

基本培养基包括四大类物质:无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物。

●无机盐:CaCl2 KCl MgSO4 NaCl NaHCO3 NaH2PO4。对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都就是必须的。

●氨基酸:缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)。它们都就是细胞用以合成蛋白质的必需

原料,不能由其她氨基酸或糖类转化合成。除此之外,还需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用,对细胞的培养特别

重要,能促进各种氨基酸进入细胞膜;它所含的氮就是核酸中嘌呤与嘧啶的来源,还就是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘与三磷酸腺

苷的原料。细胞需要谷氨酰胺合成核酸与蛋白质,谷氨酰胺缺乏可导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应补加一

定量的谷氨酰胺。值得注意的就是:谷氨酰胺在溶液中很不稳定,故4℃下放置1周可分解50％,使用中最好单独配制,置-20℃冰箱中保存,用前加入培养液中。

●维生素:就是维持细胞生长的一种生物活性物质,在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶,对细胞代谢有重大影响。脂溶性维生素(A、

D、E、K)常从血清中得到补充。水溶性维生素包括牛物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素与B12。维生素C 也就是不可缺少的,对具有合成胶原能力的细胞更为重要。

●碳水化合物:就是细胞生命的能量来源,有的就是合成蛋白质与核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖与丙酮酸钠等。体

外培养动物细胞时,几乎所有培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含

的能源物质。

●葡萄糖与谷胺酰胺的合理使用:乳酸就是葡萄糖不完全氧化的产物。研究表明,体外培养条件下95％的葡萄糖转变为乳酸,这降低了营养物质的代谢效率,降低培养基pH值,增加渗透压。在氧气供给不足的情况下,NADH转运系统苹果酸－天冬氨酸穿梭系

统活性低而不能将糖酵解产生的NADH氧化磷酸化为NAD+,细胞只得以降低能量需求的方式如激活乳酸脱氢酶将糖酵解产生

的丙酮酸与NADH反应生产乳酸与NAD+,从而保证了糖酵解的顺利进行。另一个可能的解释就是连接糖酵解与TCA循环的特异性酶如丙酮酸脱氢酶复合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶与丙酮酸羧化酶活性低下,直接导致糖酵解与TCA循环的失衡。因此体

外培养条件下,葡萄糖主要经糖酵解降解,产生过量的乳酸。减少乳酸生产最常用的方法就是限制培养基中葡萄糖的含量,但葡萄糖含量过低可造成细胞营养供应不足,细胞生长抑制。该方法需要对葡萄糖的消耗与需求、乳酸的生产速率以及目的蛋白的表达

量等参数进行综合考虑方可应用。

在目前常用的培养基中,葡萄糖与谷胺酰胺就是体外培养动物细胞的主要能源,其能量代谢通路与体内完全不同,表现为葡萄糖主

要经糖酵解途径为细胞提供能量,谷胺酰胺大部分通过不完全氧化途径,另一小部分通过完全氧化为细胞供能。因此,适当的调整细胞内的代谢途径,使之能促进细胞的快速生长与产物合成,同时减少代谢抑制物的生成就是行之有效的一种策略。

许多动物细胞如CHO、BHK与杂交瘤细胞对营养物质葡萄糖与谷氨酰胺的消耗利用很快。然而对于细胞生长而言,二者的快速利用并非细胞必需;相反相当一部分转化为代谢废物乳酸与氨,以及一些非必需氨基酸如丙氨酸,脯氨酸。其中,乳酸与氨就是两

种主要代谢废物,其积累可影响细胞生长以及产品质量。减少这两种代谢产物的积累,就是大规模细胞培养技术研究的重要方向。

氨就是由谷氨酰胺与天冬酰胺产生的。限制培养基中谷氨酰胺的含量亦就是减少氨生成的常用方法。

●除了以上与细胞生长有关的物质以外,培养基中一般还要加入酚红(当溶液酸性时pH小于6、8呈黄色;当溶液碱性时pH大于8、4呈红色),一种pH指示剂。

●在较为复杂的培养液中还包括核酸降解物(如嘌呤与嘧啶两类)以及氧化还原剂(如谷胱甘肽)等。有的培养液还直接采用了三磷

酸腺苷与辅酶A。

二、常用细胞培养基

(1)、MEM细胞培养基系列

(2)、DMEM细胞培养基系列

(3)RPMI-1640细胞培养基系列

(4)、199细胞培养基系列

(5)、水解乳蛋白细胞培养基

(6)欧氏平衡盐

(7)F-10,F-12细胞培养基系列

(8)其它类型细胞培养基

三、干粉培养基的配制

配制培养基要注意以下问题:

●认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分,常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些就是必须添加的,如NaHCO3、谷氨酰胺,有些根据实验需要决定。

●配制就是要保证充分溶解,NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。

●配制所用的水应就是三蒸水,离子浓度很低。

●所用器皿应严格消毒。

●配制好的培养基应马上过滤,无菌保存于4度。

●液体培养基主要就是为了科研工作的方便而设计的培养基,它就是一种灭菌后保证无菌的溶液,必要时可制成无内毒素等的溶液,可节省科研人员的工作量。

配制方法

●在一个尽可能接近总体积的容器中加入比预期培养基总体积少5％的双蒸水。

●在室温(20℃到30℃)的水中加入干粉培养基,轻轻搅拌,不要加热。

●水洗包装袋的内部,转移全部的痕量干粉到容器内。

●加NaHCO3到培养基中。

●用双蒸水稀释到想要的体积,搅拌溶解。注意不要过分搅拌。

●通过缓慢搅拌加入1N NaOH 或1N HCL调节pH值,由于pH值在过滤时会上升0、1到0、3,因而调节pH值使它比最终想要的pH值低0、2到0、3。培养基在过滤前要保持密封。

无血清技术及其培养基

经历了天然培养基、合成培养基后,无血清培养基与无血清培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可降低生产

成本,简化分离纯化步骤,避免病毒污染造成的危害。

无血清培养基(serum free medium,SFM):就是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但就是它

们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求,但对有些实验却不适合,如观察一种生长因子对某种细胞的作用,这时需要排除其她生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长

因子;又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质(抗体、生长因子)的能力;或者要大规模的培养某种细胞,以获得它们的分泌产物。因此研制出无血清培养基一直就是生物科学工作者努力的目标。上海恒利安生物科技有限公司已成功开发了商业化

的多种无血清培养基,可满足众多厂商的需求。

一、无血清培养基的基本配方:基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。

用于生物制药与疫苗生产的细胞在体外培养时,多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长;而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时,由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白,细胞往往以悬浮形式生长。

添加组分包括以下几大类物质:

(1)促贴壁物质:许多细胞必须贴壁才能生长,这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁与扩展因子,一般为细胞外基质,如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还就是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子,对许多细胞的繁殖与分化,起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化,这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。

(2)促生长因子及激素:针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也就是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质,有些激素就是