聚丙烯酰胺凝胶电泳目的及后续工作汇总
实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析(实验报告)
实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗过氧化物酶同工酶生物111班杨明轩1102040128一、研究背景及目的过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，在种子萌动以前,它们的过氧化物酶同工酶很少,待幼芽长到0.5 -1 厘米以后,它们的过氧化物酶才得到充分的表达。
这说明植物过氧化物酶同工酶的多寡和有无,与植物不同发育时期,与植物的不同组织、器官的分化形成及特定的生理状态等均有密切关系。
而同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能。
它们存在于生物的同一种属或同一个体的不同发育阶段，或同一发育阶段的不同组织，在细胞发育和代谢调解中起重要作用。
在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，体现各组织的特异功能，这一特点可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。
品种资源工作者借助同工酶分析品种的地理分布与亲缘关系来指导品种资源的收集与鉴定工作。
育种工作者常用同工酶来作为鉴定植物的种间杂交, 特别是远缘杂交的生化指标。
在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段。
要对同工酶展开研究，首先要实现对它的分离，因此要选择合适的分离技术。
基于“差异转化”的思路，层析和电泳是两种最为常见的大分子分离方法。
但由于二者技术细节上的差异，层析更常用于大分子的分离纯化，而电泳则主要用于大分子的分离检测。
因此在本次实验中，我们采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗中的过氧化物酶同工酶。
同时本实验利用电泳现象对过氧化物同工酶进行分离纯化和分析鉴定，通过电泳技术的实际操作体会电泳技术的原理和特点，比较分析电泳技术和其它分离技术如层析技术的不同，进一步学习应用更为广泛和纯化水平更高的分离技术。
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验
聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）一、目的要求（1）学习电泳原理和技术（2）学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质技术二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。
具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。
血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成12～25个组分。
因此适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。
聚丙烯酰胺凝胶作为电泳材料的特性人工合成聚丙烯酰胺凝胶的化学体系的组成及功能：Acr：丙烯酰胺Bis：甲叉双丙烯酰胺AP：过硫酸铵——化学催化剂TEMED：四甲基乙二胺——加速剂SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。
在含有强还原剂的SDS溶液中可形成SDS-蛋白质复合物。
由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。
从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。
三、实验材料（一）试剂1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis 为29:1）称取丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1.0g，用去离子水溶解并稀释至100ml，贮棕色瓶中于4℃保存，可用一个月。
2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液取1mol/L HCL溶液48ml、三羟甲基甲烷（Tris）36.6g，加双蒸馏水至80ml使其溶解，调pH至8.8，然后用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。
3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液取1mol/L HCL溶液48ml，Tris5.98g，加双蒸馏水至80ml，调pH6.8，用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。
4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液称取Tris 6g、甘氨酸28.8g，加蒸馏水850ml，调pH至8.3，加蒸馏水到1000ml，4℃贮存。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)实验报告一、实验目的1.学习SDS-PAGE分离蛋白质的原理；2.掌握垂直板电泳的操作方法。
二、实验原理1、电泳：(1)定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。
(2)影响电泳效果的因素：①带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；②颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；③溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；④溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快；⑤电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；⑥离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；⑦电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动；⑧支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。
2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）(1)定义聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）(2)SDS的作用SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。
由于SDS带有大量负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差异。
因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小(3) SDS-PAGE分类：¾SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类：连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳(4)聚丙烯胺凝胶的生成：聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法发布时间：11-06-01 来源：点击量：10032 字段选择：大中小聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。
在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。
聚丙烯酰胺凝胶有以下优点：①聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N'甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。
凝胶有格子是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。
②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性质。
一般说来，含丙烯酰胺7-7.5%的凝胶，机械性能适用于分离分子量范围不1万至100万物质，1万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺15-30%的凝胶，而分子量特别大的可采用含丙烯酰胺4%的凝胶，大孔胶易碎，小孔胶则难从管中取出，因此当丙烯酰胺的浓度增加时可以减少双含丙烯酰胺，以改进凝胶的机械性能。
③在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。
凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直接测定。
④丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，减少污染。
合成聚丙的总克数称凝胶浓度，常用T%表达；凝胶溶液中交联剂占单体和交联体总量的百分数称为交联度，常用C%表示，可用下式计算：公式a：丙烯酰胺克数；b：甲撑双丙烯酰胺克数；m：缓冲液体积（毫升）凝胶浓度过高时，凝胶硬而脆，容易破碎；凝胶浓度太低时，凝胶稀软，不易操作。
交联度过高，胶不透明并缺乏弹性；交联度过低，凝胶呈糊状。
聚丙烯酰胺凝胶具有较高的粘度，它不防止对流减低扩散的能力，而且因为它具有三度空间网状结构，某分子通过这种网孔的能力将取决于凝胶孔隙和分离物质颗粒的大小和形状，这是凝胶的分子筛作用。
由于这种分子筛作用，这里的凝胶并不仅是单纯的支持物，因此，在电泳过程中除了注意电泳的基本原理以外，还必须注意与凝胶本身有关的各种性质（网孔的大小和形状等）。
(完整版)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告
分子生物学实验报告实验名称：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳班级：生工xxx姓名：xxx同组人：xxx学号：xxxx日期：xxxxSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1 引言SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是目前分离蛋白质亚基并测定其分子量的常用方法，为检测电泳后凝胶中的蛋白质，一般使用考马斯亮蓝（CBB）染色[1]。
本次实验的目的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。
2 材料和方法2.1实验原理2.1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理2.1.1.1 性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。
通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。
由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。
2.1.1.2 制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。
本实验是用化学聚合。
化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。
在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。
叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。
通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4％，pH = 6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5％，pH = 8.8。
sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告.
sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告.
实验目的：通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，分离蛋白质并测定分子量。
实验原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种分离蛋白质的标准方法，可对不同来源和大小的蛋白质进行分离和鉴定。
在本实验中，通过将蛋白质溶解于含有SDS和2-巯基乙醇等条件下的试样缓冲液中，以使蛋白质带有几乎相同的负电荷，通过电泳使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中以大小不同的分子量在电场作用下移动，最终被染色，进行分离鉴定。
实验步骤：
1.准备实验材料：SDS-PAGE电泳装置、试样缓冲液、聚丙烯酰胺凝胶、蛋白质样品、电泳缓冲液等。
2.制备SDS-PAGE电泳凝胶：按照说明书，将聚丙烯酰胺凝胶拆封并放置在实验室温度下一段时间，使其柔软。
3.制备电泳缓冲液：按照说明书，取适量的Tris、glycine和SDS等物质，配制电泳缓冲液，使其达到所需浓度。
4.制备试样缓冲液：按照说明书，取适量的Tris、SDS和2-巯基乙醇等物质，配制试样缓冲液。
5.制备样品：取适量的蛋白质样品，在试样缓冲液中煮沸一段时间，使蛋白质分子展开。
6.装样：将制备好的样品加入聚丙烯酰胺凝胶电泳装置样品槽中。
7.电泳：按照说明书，调整电泳缓冲液pH值和电泳电压等条件，开启电泳装置，进行电泳操作。
8.染色：将电泳板取出，进行荧光染色或银染色法。
9.图像处理：使用图像分析系统或其他软件，进行蛋白质条带的分析和图像处理。
实验结果：经过SDS-PAGE电泳后，样品中的蛋白质在凝胶中呈现出大小不同的分子量条带，通过荧光染色或银染色可以清晰地看到分离的蛋白质条带。
根据蛋白质的分子量大小，可以判断样品中含有哪些蛋白质。
实验十聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质
实验⼗聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋⽩质实验⼗聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋⽩质【实验⽬的】1. 了解和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理；2. 掌握⽤此法分离蛋⽩质组分的操作⽅法。
【实验原理】在⽣物化学、分⼦⽣物学和基因（遗传）⼯程实验中，常常要进⾏蛋⽩质和核酸的分离⼯作。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为⽀持介质进⾏蛋⽩质或核酸分离的⼀种电泳⽅法。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称ACR）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide 简称BIS）在催化剂的作⽤下聚合交联⽽成的三维⽹状结构的凝胶。
通过改变单体浓度与交联剂的⽐例，可以得到不同孔径的凝胶，⽤于分离分⼦量⼤⼩不同的物质。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：（1）化学聚合：催化剂采⽤过硫酸铵，加速剂为N,N,N,N－四甲基⼄⼆胺（简称TEMED）。
通常控制这⼆种溶液的⽤量，使聚合在1⼩时内完成。
（2）光聚合：通常⽤核黄素为催化剂，通过控制光照时间、强度控制聚合时间，也可加⼊TEMED 加速反应。
聚丙烯酰胺凝电泳常分为⼆⼤类：第⼀类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第⼆类为不连续的凝胶（浓缩胶和分离胶）电泳。
⼀般地，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：①电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）；②凝胶的分⼦筛效应（凝胶的⽹状结构及电泳物的⼤⼩形状不同所致）。
③浓缩效应（浓缩胶与分离胶中聚丙烯酰胺的浓度及pH的不同，即不连续性所致）。
因此，样品分离效果好，分辨率⾼。
SDS即⼗⼆烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，简称SDS）是阴离⼦表⾯活性剂，它能以⼀定⽐例和蛋⽩质结合，形成⼀种SDS-蛋⽩质复合物。
这时，蛋⽩质即带有⼤量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从⽽使天然蛋⽩质分⼦间的电荷差别降低仍⾄消除。
聚丙烯酰胺凝胶电泳法
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法—蛋白质的分子量测定【实验目的】1.掌握SDS—聚丙烯酰胺电泳法的原理。
2.学会用此种方法测定蛋白质的分子量。
【实验原理】SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。
SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。
SDS—蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。
SDS—PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。
SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
【实验材料】1.实验器材微型凝胶电泳装置；电源（电压200V，电流500mA）；100℃沸水浴；Eppendorf管；微量注射器（50μl或100μl）；干胶器、真空泵或水泵；带盖的玻璃或塑料小容器；摇床。
2.实验试剂⑴ 2mol/L Tris-HCl (pH8.8):取24.2g Tris, 加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH8.8（约加4ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。
⑵ 1mol/L Tris-HCl (pH8.8):取12.1g Tris, 加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH6.8（约加8ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。
SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告
总蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法一、实验目的1. 学会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理。
2. 掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量的操作技术二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
该凝胶由丙烯酰胺(acr)和交联剂N, N-甲叉双丙烯聚酰胺(bis)聚合而成。
聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。
arc和bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。
引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。
化学法的引发剂是过硫酸铵Ap，催化剂是四甲基乙二胺(TEMED)；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵，在紫外光照射下引发自由基团。
采用不同浓度的arc, bis, Ap, TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。
因此可以按分离物质的大小，形状来选择凝胶浓度。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)有圆盘(disc)和垂直板(vertical slab)型之分，但两者的原理完全相同。
由于垂直板型具有板薄，冷却，分辨率高，操作简单，便于比较和扫描等优点，因而为大多数实验室采用。
十二烷基硫酸钠(SDS)是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4g SDS/1g 蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上了相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质原有的电荷差别。
这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质相对分子质量的对数和迁移率所绘制的标准曲线，可求得未知物的相对分子质量。
三、实验试剂与材料1. 30% Arc-Bis贮存液：30g Arc, 0.8g Bis, 用去离子水定容到100mL，过滤除去不溶性物质，用棕色瓶储存放置在4℃冰箱中。
2. Tris-HCl 1.0M pH=6.8、Tris-HCl 1.5M pH=8.83. 10% 过硫酸铵溶液4. TEMED（商品试剂）5. 2x Sample Loading Buffer：1.52g Tris，20mL甘油，2.0g SDS，2.0mL 2-巯基乙醇，1mg 溴酚蓝，用1M HCl调节pH至6.8，加蒸馏水稀释到100mL.6. 电泳缓冲液(Tris-Glycine缓冲液)：Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，SDS 1.0g，用去离子水溶解加入盐酸调节pH=8.3，再定容至1L。
实验二十五 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
（二）、器材
1．垂直板型电泳槽
2．直流稳压电源(电压300～600V，电流50～100mA)
3．50或100μl的微量注射器
四、操作步骤
（一）安装垂直板型电泳装置
此种夹心式垂直板电泳装置(如图2，3)的两侧为有机玻璃制成的电极槽，两个电极槽中间夹有一个凝胶模子。凝胶模子由3部分组成；一个“U”形的硅胶框、两块长短不等的玻璃片、样品槽模板(俗称“梳子”)。电极槽由上贮槽(白金电极在上或面对短玻璃片)、下贮槽(白金电极在下或面对长玻璃片)和冷凝系统组成。凝胶模子的硅胶框内侧有两条凹槽，可将两块相应大小的玻璃片嵌入槽内。玻璃片之间形成一个2～3mm厚的间隙，将来制胶时，将胶灌入其中。灌胶前，先将玻璃片洗净、晾干、嵌入胶带凹槽中。长玻璃片下沿与胶带框底之间保持有一缝隙，以使此端的凝胶与一侧的电极槽相通；而短玻璃片的下沿则插入橡胶框的底槽内。将已插好玻璃片的凝胶模子置于仰放的上贮槽上，短玻璃片应面对上贮槽，再合上下贮槽，用4条长螺丝将两个半槽固定在一起。上螺丝时，要按一定顺序逐个拧紧，均匀用力。将装好的电泳装置垂直放置，在长玻璃片下端与硅胶框交界的缝隙内加入用电极缓冲溶液配制的1％琼脂糖溶液，待其凝固后，即堵住凝胶模板下面的窄缝(通电时又可作为盐桥)。（二）凝胶的制备
8．凝胶贮液：Acr30.0g，Bis0.8g，加蒸馏水到100ml
9．电极缓冲溶液：SDS l g，Tris6g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水至1000ml，pH=8.3。
10．固定液：取50％甲醇454ml，冰醋酸46ml，混匀。
11．染色液：1.25 g考马斯亮蓝R-250，加454 ml 50％甲醇溶液和46ml冰醋酸，混匀。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS－聚丙烯酰胺凝胶 电泳分离血清蛋白质
一、பைடு நூலகம்的要求
1.学习电泳原理和技术
2.掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的工作原
理和操作方法
二、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联
剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺 (TEMED)和催化剂过硫酸铵((NH4)2S2O8 ，AP) 的作用 下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支
持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
TEMED(加速剂)
Acr(单体)+Bis(交联剂)
AP(催化剂)
凝胶
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有 电荷效应、分子筛效应。
电荷效应（电泳物所带电荷的差异性） 分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的 大小形状不同所致） PAGE同时还具有浓缩效应与体系的不连续性。
四、 操作步骤
固定玻板
制备分离胶 制备浓缩胶 加样 电泳
染色和脱色
1.安装夹心式垂直板电泳槽
安装好后，在长玻璃板下端与硅胶模框
交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂糖。其目 的是封住空隙，凝固后的琼脂糖中应避免有 气泡。
2、配制凝胶
7.5%分离胶 （10ml） DDW 30%Acr-Bis 4.85 2.5 3%浓缩胶 （5ml） 3.16 0.5
6 .染色与脱色
电泳结束后，取下凝胶模，卸下胶框，用小 刀或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下左上 角作为加样标记。加入染色液染色1-2 h，再用 脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰。
将楔子插进，将底部插紧
插入梳子
加缓冲液
加 样
电泳
剥胶
五、实验结果
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
一,实验目的 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 聚丙烯酰胺凝胶电 掌握 泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE , )的工作原理和操作方法
二,实验原理 不同蛋白质具有不同的分子量, 不同蛋白质具有不同的分子量,并在 一定的pH溶液中带有不同的电荷 溶液中带有不同的电荷. 一定的 溶液中带有不同的电荷.但 经过SDS处理后的蛋白质,分子表面 处理后的蛋白质, 经过 处理后的蛋白质 完全被负电荷所覆盖,因此在电泳时, 完全被负电荷所覆盖,因此在电泳时, 电泳迁移率近取决于蛋白质的分子量 大小而与其所带电荷的性质无关. 大小而与其所带电荷的性质无关.
6. 上样:将样品梳拔出,用电极缓冲液 上样:将样品梳拔出, 冲洗样品孔. 冲洗样品孔.样品与样品缓冲液按一 定比例混合好. 定比例混合好.用微量注射器加入加 样孔,加样量为20l. 样孔,加样量为 . 7.电泳:100V恒压电泳至溴酚蓝指示剂达 电泳: 电泳 恒压电泳至溴酚蓝指示剂达 到浓缩胶和分离胶界面, 到浓缩胶和分离胶界面,然后调电压 至120V,再恒压电泳,约1.5 h,待染 ,再恒压电泳, , 料前沿的溴酚蓝迁移至凝胶的底部, 料前沿的溴酚蓝迁移至凝胶的底部, 停止电泳.取下胶板, 停止电泳.取下胶板,将胶片置于白 瓷盘内. 瓷盘内.
4. 制备浓缩胶:待胶凝固后(胶与水之间有 制备浓缩胶:待胶凝固后( 一清晰界面), 将水倒掉, 一清晰界面), 将水倒掉,用ddH2O冲 冲 洗胶面,滤纸将水吸干净.配制好浓缩胶. 洗胶面,滤纸将水吸干净.配制好浓缩胶. 倒入浓缩胶插好样品梳, 倒入浓缩胶插好样品梳,注意避免气泡滞 留在梳子与胶液的界面, 放置约15 留在梳子与胶液的界面,30 ℃放置约 min,直至使浓缩胶凝固. ,直至使浓缩胶凝固. 5. 电泳:将胶模装好,去胶条后,装入电泳 电泳:将胶模装好,去胶条后, 槽中,检查是否漏液后,倒入电泳缓冲液, 槽中,检查是否漏液后,倒入电泳缓冲液, 胶模内侧的液面没过矮板但不可超过高板 矮板在内). (矮板在内).
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告
实验名称：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告一、实验目的1. 了解SDS-PAGE实验的原理和方法；2. 掌握SDS-PAGE实验的操作流程；3. 分析不同蛋白质在SDS-PAGE中的分离情况；4. 对实验结果进行解读和总结。
二、实验原理SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种常用的蛋白质分离和分析技术。
其原理是利用SDS将蛋白质变性并赋予等电点，将蛋白质按照分子量大小在凝胶中进行分离。
通过电泳操作，蛋白质会根据其分子量在凝胶中移动，最终形成不同的条带，便于观察和分析。
三、实验步骤1. 准备样品：获取需要分析的蛋白质样品，并进行处理使其可以被SDS-PAGE分离；2. 制备凝胶：根据实验需要，配置聚丙烯酰胺凝胶，并在凝胶板中固定好；3. 样品加载：将处理好的蛋白质样品加载到凝胶槽中；4. 电泳分离：在设定好电压和时间的条件下，进行电泳操作，使蛋白质在凝胶中分离；5. 染色观察：将分离后的蛋白质用染色剂染色，然后观察分离的条带；6. 结果分析：根据实验结果，进行蛋白质的分析和解读。
四、实验材料与仪器1. 样品：蛋白质样品；2. 凝胶：聚丙烯酰胺凝胶；3. 电泳槽：用于进行SDS-PAGE电泳的设备；4. 电源：用于提供电泳操作所需电压的电源设备；5. 染色剂：用于染色观察蛋白质条带的染色剂。
五、实验结果与分析经过SDS-PAGE实验操作，观察到样品中不同蛋白质在凝胶中的分离情况。
根据不同分子量的蛋白质在凝胶中形成了明显的条带，条带的位置和密度反映了样品中蛋白质的分布情况。
通过染色观察和数据分析，可以得出样品中蛋白质的组成和含量。
六、实验结论SDS-PAGE实验是一种重要的蛋白质分析方法，通过实验操作可以对蛋白质样品进行分离和分析，从而了解样品的蛋白质组成和特性。
本次实验结果表明，SDS-PAGE可以有效地对蛋白质样品进行分离，为后续的分析和研究奠定了基础。
实验八聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳
实验八 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳【实验目的】1.掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。
2.学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术，用于分离蛋白质。
【实验原理】聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺作为支持物的一种电泳形式。
单体-丙烯酰胺和交联剂-甲叉双丙烯酰胺相互作用可形成聚丙烯酰胺，该聚合反应以TEMED 作为催化剂，以APS 作为引发剂。
丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的比例可决定凝胶网孔的大小，交联剂所占比重越大，凝胶的网孔就越小。
利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离主要依据以下两个因素： 蛋白质所带静电荷：在不同的pH 条件下蛋白质所带电荷不同。
在一定C=O NH 2C=O NH CH 2C=ONH CH 2+APTEMEDNH CH 2 C=ONH CH 2—CH C=O NH 2—CH 2—CH C=O NH 2— CH 2—CH —C=O NH 2—CH 2—CC=O 2— 丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺CH 2=CCH 2=C — CH 2 —CH —C=OCH 2—CH的电场条件下蛋白质将向与其所带电荷相反的电极方向移动，移动速率取决于蛋白质表面电荷的数量，电压越强或电荷越多则蛋白质移动的越远。
其次，蛋白质的形状和大小：蛋白质在电泳中所受的阻力主要取决于样品的大小与凝胶网孔大小之间的关系。
蛋白质分子越小或凝胶网孔越大，所分离样品所受阻力就愈小，则在电场中的迁移率就越大。
在非变性电泳中，天然蛋白质的分离就是蛋白质所带电荷、分子大小及分子形状等因素共同影响，作用的结果。
电压x 样品静电荷迁移率=摩擦力浓缩效应可显著提高聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率，该效应可通过引入浓缩胶和不连续缓冲溶液系统而获得。
浓缩胶处于分离胶的顶部，因此样品在进入分离胶之前首先要经过浓缩胶。
它是由较低浓度的丙烯酰胺构成，当样品经过浓缩胶时由于胶内网孔较分离胶网孔大，样品的移动速度较快，最终使样品“堆积”在浓缩胶和分离胶之间。
另外，浓缩胶还具有比分离胶更低的pH。
sds-page凝胶电泳实验目的
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sds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质实验报告
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质实验报告实验报告：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质1. 实验目的：本实验旨在使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对蛋白质进行分离和测定，并研究样品中蛋白质的分子量。
2. 实验原理： SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和测定方法。
在此方法中，蛋白质样品首先与SDS（十二烷基硫酸钠）反应，使蛋白质在电泳过程中带有负电荷。
然后，蛋白质样品被加载到聚丙烯酰胺凝胶中，经过电泳分离。
由于SDS的作用，蛋白质在凝胶中的迁移速度与其分子量成反比。
最后，通过染色或蛋白质标记物检测，可以确定蛋白质的相对分子量。
3. 实验步骤： a. 准备SDS聚丙烯酰胺凝胶：按照制备凝胶的方法制备所需的聚丙烯酰胺凝胶，包括配制凝胶溶液、注射样品孔和负载样品等步骤。
b. 样品制备：将待测蛋白质样品加入SDS缓冲液，并加热至高温，使蛋白质与SDS反应，使其带负电荷。
c. 电泳操作：将样品加载到凝胶中，连接电源进行电泳，设定合适的电压和时间进行分离。
d. 染色和可视化：电泳完成后，将凝胶染色以可视化蛋白质条带，常用的染色方法包括银染、共染等。
e. 分析和测定：根据标准蛋白质的移动距离和相对分子量，通过比较和分析样品中蛋白质的相对分子量。
4. 实验结果：在实验中，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和染色，观察到样品中的蛋白质条带。
根据标准蛋白质的移动距离和相对分子量，可以推断样品中蛋白质的相对分子量。
实验结果可以用图表形式展示，包括蛋白质条带的位置和相对分子量的估计。
1/ 25. 结果分析与讨论：分析实验结果，比较样品中蛋白质的相对分子量与已知标准蛋白质的相对分子量之间的差异。
根据条带的位置和相对分子量的估计，可以推断样品中的蛋白质组成和含量。
讨论实验中可能出现的误差和不确定性，并提出改进的建议。
6. 结论：根据实验结果，可以得出关于样品中蛋白质的相对分子量和组成的结论。
总结实验的目的、方法和结果，并指出实验的局限性和未来的研究方向。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告。
实验目的：本实验旨在通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对蛋白质进行分离和分析，从而了解蛋白质的分子量和含量。
实验原理：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离技术，它利用SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质进行线性解离，使蛋白质呈现负电荷，并且使蛋白质的分子量与迁移速率成线性关系。
通过凝胶电泳，可以将蛋白质按照其分子量大小进行分离，从而得到蛋白质的分子量和含量信息。
实验步骤：1. 制备凝胶，首先制备聚丙烯酰胺凝胶，将蛋白质样品加入样品缓冲液中，并加入SDS蛋白质变性剂进行变性处理。
2. 蛋白质样品加载，将处理后的蛋白质样品加载到凝胶孔中。
3. 电泳分离，将凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，施加电场进行电泳分离。
4. 凝胶染色，电泳结束后，将凝胶进行染色，观察蛋白质条带。
实验结果：经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，观察到蛋白质在凝胶上呈现出不同的条带，根据条带的位置和密度可以初步判断蛋白质的分子量和含量。
通过实验数据的分析，我们可以得到蛋白质的分子量和相对含量信息。
实验结论：通过本次实验，我们成功利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对蛋白质进行了分离和分析，得到了蛋白质的分子量和含量信息。
这些数据对于进一步研究蛋白质功能和结构具有重要意义。
实验总结：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种简单、快速、准确的蛋白质分离技术，广泛应用于生物化学和分子生物学领域。
通过本次实验，我们对该技术有了更深入的了解，并且掌握了实验操作的关键步骤和注意事项。
希望通过今后的实验实践，能够进一步提高实验技能，为科研工作打下坚实的基础。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及western
• 4.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向上的曲 线形），说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却 不好，导致分子有不同的迁移率所致 • 5.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向下的曲 线形），由于电泳槽的装臵不合适，尤其是凝胶 和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔 片得凝胶聚和不完全 • 6.凝胶时间不对。通常胶在30min-1H内凝。如果 凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。 APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄 色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多， 此时胶太硬易裂
（7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液： SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝 （2mg）+甘油（2g）+ 0.05mol/L pH8.0Tris-HCl （2ml），最后定容至10ml。 （10）固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。 （11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上 述固定液250ml，过滤后备用 （12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水 定容至1000ml （13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容 至1000ml
二
抗
1. 同 上 铺 好 保 鲜 膜 ， 加 1 ： 1000 的 二 抗 1000ul （ 1ul mouse 抗 人 IgG-HRP+ 999ul 抗体稀释液） 2. 同上蛋白面朝下放好尼龙膜，要避免产生 气泡 3. 盖上平皿，同上RT孵育2 hours 4. TBST 10min ×2 ； TBS 10min×1
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聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用
聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分离蛋白质和寡核苷酸。
其应用可以分为两大类，一类是属于可以直接在凝胶上观察计算；另一类需要洗脱回收胶中特定的蛋白和核酸。
①蛋白质纯度分析
②蛋白质分子量测定⑥蛋白质纯化分离直接观察③蛋白质定量洗脱回收蛋白
④蛋白质水解分析⑦免疫印迹的第一步⑤ DNA测序
1.蛋白质纯度分析
根据聚丙烯酰胺凝胶条带个数来判断是一种蛋白质还是多种蛋白质的混合物。
2.蛋白质分子量测定
采用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。
SDS-蛋白质复合物消除了蛋白质天然形状不同对电泳迁移率的影响，SDS-蛋白质复合物的迁移率只与蛋白质分子量有关，研究表明蛋白质分子的电泳迁移率与其分子量对数呈线性关系，因此能够根据电泳迁移率的比对获得未知蛋白质分子量大小。
以迁移率Rf为横坐标，蛋白分子量的常用对数为纵坐标。
用已知分子量的蛋白测出迁移率，做标准曲线。
从而能根据未知分子量蛋白的迁移率计算出其分子量。
其中Rf=蛋白迁移距离/示踪染料迁移距离。
3.蛋白质定量
蛋白质混合物中单个蛋白质的定量，通常是将染色后的凝胶蛋白质条带在分
光光度计上进行扫描，然后对峰面积积分。
4.蛋白质水解分析
蛋白质水解分析常用酶谱法。
明胶酶谱法的基本过程是先将样品进行非还原性SDS-PAGE（含0.1%明胶）电泳分离，然后在缓冲系统中使样品中的酶恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与酶的量和比活成正比。
5.DNA测序
目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。
这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。
Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。
Sanger法测序的原理就是，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之扩增，并混入限量的一种不
同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。
由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。
每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几个至千以上个，相差一个碱基一系列片断。
它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
6.蛋白质纯化分离
电泳后找切一条泳道进行染色，找到目标蛋白的位置，将未染色的凝胶进行蛋白质洗脱。
洗脱方法有电扩散法和电洗脱法等。
电洗脱法步骤：SDS-PAGE电泳后，用250mM KCl染色10分钟（或用考染），蛋白带呈乳白色；手术刀切下蛋白带，放入透析袋中；将透析袋放常规平板核酸电泳槽，加入与SDS-PAGE相同的电泳buffer；80V电泳2-2.5小时，再反向电泳1-2分钟；吸出透析袋中液，
浓缩（可用冻干、丙酮沉淀等）；SDS-PAGE电泳检查电洗脱效果。
7.免疫印迹的第一步
免疫印迹法是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
免疫印迹法可非常有效的鉴定某一蛋白质的性质。
将蛋白质固定在膜基质上比直接在凝胶上检测更有优势，因为蛋白质在膜上更容易让试剂接近，膜比凝胶更容易操作，试剂用量更少，更省时。
免疫印迹法分三个阶段进行.第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快.此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）.第二阶段为电转移：将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min转移即可完成.此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见.第三阶段为酶免疫定位：将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色.常用的HRP底物为3,3'-二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）.阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量.本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断.在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验.抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒,可方便地在实验室中供检测用.根据出现显色线条的位置可判断有无针对病毒的特异性抗体。