第二章 菌种的来源综述
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Ch 1 菌种
⑶ 生物诱变剂 指能引起染色体或基因突 变的一些生物因素，如噬菌体。
诱变剂的选择
1．碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使 用，因为回复突变率高，效果不大。 2．亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损 伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为 “超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变 剂之一。
• 大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非 常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，，且 切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感， 甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。
氮芥诱变处理：将待处理菌（孢子）的 悬浮液与氮芥盐酸盐溶液及NaHCO3溶 液混合，放置适当时间后，加入 NaHCO3与甘氨酸的混合溶液终止作用， 诱变处理结束。
检测病毒复制中特有的DNA复制酶和核酸 合成的抑制剂，是选择性高的筛选方法。
(5) 生长因子产生菌的分离
生长因子如氨基酸和核苷酸的生产不能作为 分离中的压力，可用随机方法分离产生菌，并通 过随后的筛选试验检测得到产生菌。 通过观测分离菌能否促进营养缺陷型菌株的 生长，来检出生长因子产生菌。
(6) 免疫激活剂产生菌的分离
诱变剂复合处理及其协同效应
菌种
单独处理 诱变剂 突变率
(%)
复合处理 诱变剂 紫外线+ X射线 紫外线+氮芥 紫外线+γ射线 紫外线+二乙烯三胺 紫外线+硫酸二乙酯 紫外线+可见光照射1次 紫外线+可见光照射6次 突变率
(%)
土曲霉 土曲霉 链霉菌
紫外线 X射线 氮芥(0.1%) 紫外线 紫外线 γ射线
快中子。 物理因素中目前使用得最方便而且十分 有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过 紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用， 也很安全。 其他的几种射线都是电离性质的，有一定 的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中 使用，否则有一定危险性。
第二章+菌种的来源1
第二章：发酵工业菌种 一、常用的工业微生物 二、发酵工业菌种筛选的原则与基本技术 三、发酵工业菌种改良
对产物进行菌种筛选时，有两条经验： 对产物进行菌种筛选时，有两条经验：
进化上向上兼容 次生代谢在进化上后移， 次生代谢在进化上后移，芽孢菌以上才有 筛选意义。 筛选意义。
最常用的工业微生物
细菌
醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌 醋杆菌属的醋化醋杆菌、 乳酸杆菌 枯草杆菌 丙酮丁醇梭菌 大肠杆菌 谷氨酸棒状杆菌
2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面
从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌； 从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌； 生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 ； 从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工 业目的的优良菌株 ； 从已知菌种和大自然中分离新菌株 寻找新的发酵产品的产生菌； 寻找新的发酵产品的产生菌； 寻找老产品的新的优良菌株。 寻找老产品的新的优良菌株。 从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处： 从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处： 经济性 指导性
设计筛选方案时必须考虑两个要点 选择性 灵敏度
3. 新种分离与筛选的步骤
样品采集
→样品的预处理→目的菌富集培养
→菌种初筛→菌种复筛→菌种发酵性能鉴定 →菌种保藏。 菌种保藏。
3. 新种分离与筛选的步骤
查阅资料） 调查研究（查阅资料）
菌种纯化
试验方案设计
所需微生物？） 样品采集（所需微生物？）
初 筛
A
µ
B
S0
基质浓度对A、 两种菌的比生长速率 两种菌的比生长速率（ ） 基质浓度对 、B两种菌的比生长速率（µ）的影响
富集什么菌株？ 当S<S0时，富集什么菌株？ 富集什么菌株？ 当S>S0时，富集什么菌株？
对产物进行菌种筛选时，有两条经验： 对产物进行菌种筛选时，有两条经验：
进化上向上兼容 次生代谢在进化上后移， 次生代谢在进化上后移，芽孢菌以上才有 筛选意义。 筛选意义。
最常用的工业微生物
细菌
醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌 醋杆菌属的醋化醋杆菌、 乳酸杆菌 枯草杆菌 丙酮丁醇梭菌 大肠杆菌 谷氨酸棒状杆菌
2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面
从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌； 从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌； 生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 ； 从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工 业目的的优良菌株 ； 从已知菌种和大自然中分离新菌株 寻找新的发酵产品的产生菌； 寻找新的发酵产品的产生菌； 寻找老产品的新的优良菌株。 寻找老产品的新的优良菌株。 从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处： 从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处： 经济性 指导性
设计筛选方案时必须考虑两个要点 选择性 灵敏度
3. 新种分离与筛选的步骤
样品采集
→样品的预处理→目的菌富集培养
→菌种初筛→菌种复筛→菌种发酵性能鉴定 →菌种保藏。 菌种保藏。
3. 新种分离与筛选的步骤
查阅资料） 调查研究（查阅资料）
菌种纯化
试验方案设计
所需微生物？） 样品采集（所需微生物？）
初 筛
A
µ
B
S0
基质浓度对A、 两种菌的比生长速率 两种菌的比生长速率（ ） 基质浓度对 、B两种菌的比生长速率（µ）的影响
富集什么菌株？ 当S<S0时，富集什么菌株？ 富集什么菌株？ 当S>S0时，富集什么菌株？
第二章生产菌种的来源
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工业发酵菌种必须具备的基本特征
能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并能生成较 多的发酵产物； 培养条件如温度、渗透压等易于控制； 抗杂菌和抗噬菌体能力较强； 遗传稳定性高、不易退化； 不产生有害的生理活性物质或毒素（食品或医药微生 物菌株）
33
4、性能测定（毒性试验）
自然界的一些微生物在一定条件下会产毒； 除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作 为食用无须作毒性试验外，其他均需 2年以上的毒性试 验； 医药卫生上的产品，还须通过安全试验和临床试验，获 得国家的药品生产许可证，方能使用； 生产性能测定； 生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、温度、 pH值、提取工艺等； 经自然界分离筛选获得的有价值的菌种进一步进行人工 选育。
具体方法： 在固体选择培养基中加入酶作用的底物培养微生物，能够 利用此底物的酶产生菌得以生长，并且往往会在其菌落周 围形成一透明圈。 透明圈的大小与酶活力的高低成正相关，可以作为菌种初 筛的判断标准。 如：蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、纤 维素酶等
22
目的微生物筛选方法的研究进展 目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。 微生物的多样性及资源的开发仍然是今后若干 年的研究重点。 －－陈文新院士 分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定 目标产物的筛选方面发挥了着越来越重要的作 用。如 :16SRNA同源性分析，基因序列分析及 DNA/DNA杂交技术等。
30
几种重要生物活性物质产生菌的分离方法 抗病毒药物产生菌：用小平板测定由病毒引起的细胞 变性效果，是一种有用的筛选方法；检测病毒复制中 特有的DNA复制酶和核酸合成酶的酶抑制剂，是另一 种选择性更高的筛选方法。
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生长因子产生菌：通过观察分离菌能否促进营养 缺陷型菌株的生长来检出。 免疫激活剂产生菌：可以用细胞表面酶的抑制法， 筛选免疫激活剂产生菌； 多糖产生菌：可以通过菌落外观的观察来识别 （黏稠)
菌种的来源
BCRC 台湾生物资源保藏研究中心，台湾新竹
长江大学生科院生物工程系
13
国外菌种保藏机构
ATCC(American Type Culture Collection）美 国典型菌种保藏中心 NBRC (NITE Biological Resource Center)日本 技术评价研究所生物资源中心 NRRL (Agricultural Research Service Culture Collection) 美国农业研究菌种保藏中心 CBS (Centraalbureauvoor Schimmelcultures) 荷兰微生物菌种保藏中心 UKNCC (The United Kingdom National Culture Collection ) 英国国家菌种保藏中心
2018年10月18日星期四
ISF 中国农业科学院土壤肥料研究所 CACC 抗菌素菌种保藏管理中心 SIA 四川抗菌素工业研究所 AS 中国科学院微生物研究所 CFCC 林业微生物菌种保藏管理中心 CICC 工业微生物菌种保藏管理中心 CMCC 医学微生物菌种保藏管理中心 NICPB 卫生部药品生物制品监察所 CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心 YM 云南省微生物研究所 CCTCC 中国典型培养物保藏中心 CMBGCAS 海洋微生物中心 CUHK 香港中文大学保藏中心
国内菌种保藏机构27
ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心 SH 上海市农业科学院食用菌研究所 IA 中国医学科学院抗菌素研究所 CGMCC 普通微生物菌种保藏管理中心 AS-IV 中国科学院武汉病毒研究所 CAF 中国林业科学院菌种保藏管理中心 IFFI 轻工业部食品发酵工业科学研究所 ID 中国医学科学院皮肤病研究所 IV 中国医学科学院病毒研究所 CIVBP 中国兽医药品监察所 GIMCC 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心 CCDM 华中农业大学菌种保藏中心 HKUCC 香港大学保藏中心
第二章 生产菌种的来源
4、其他防线菌生产的抗生素
其他生产的抗生素的防线菌有： 诺卡氏 其他生产的抗生素的防线菌有 ： 菌 形 放 线 菌 （ Nocardioform Actinomycetes ） 、 游 动 放 线 菌 （ Actinoplanetes ） 及 足 分 枝 菌 （Maduromyetes）。
5、青霉属（Penicillum） 青霉属（
6、粘细菌（Myxobacteria） 粘细菌（
粘细菌次级代谢产物中抗菌活性物质的检 出率非常高，并且许多都是新发现的抗生素。 出率非常高 ， 并且许多都是新发现的抗生素 。 如纤维素堆囊菌（ 如纤维素堆囊菌 （ Sorangium cellulosum ） 产 生的大环内酯类抗生素堆囊菌素、 生的大环内酯类抗生素堆囊菌素、
四、有机酸
柠檬酸 :黑曲霉 ,酵母 (解脂假丝酵母 、解脂 复膜孢酵母季也蒙假丝酵母 ） 乳酸 ：德氏乳杆菌 、赖氏乳杆菌 、植物乳杆 菌 、米根霉 苹果酸 ：黄曲霉 、米曲霉 、寄生曲霉 、华根 无根根霉、 霉 、无根根霉、膜醭毕赤酵母 衣康酸 ：土曲霉 、衣康酸曲霉、假丝酵母S-10 衣康酸曲霉、假丝酵母S
青霉菌属于腐生菌， 青霉菌属于腐生菌，广泛生存于土壤和 腐败的水果和蔬菜中。 腐败的水果和蔬菜中。 由于第一个工业化生产的抗生素青霉素是 中发现的， 由青霉属中的Penicillum notatum中发现的， 至今青霉素极其半合成抗生素仍是产量最大、 至今青霉素极其半合成抗生素仍是产量最大、 用途最广的抗生素， 用途最广的抗生素，因此青霉素在抗生素工 业中具有特别重要的地位。 业中具有特别重要的地位。
纤维素酶
纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的 总称。它不是单种酶， 总称。它不是单种酶，而是起协同作用的多组分 酶系。 酶系。 纤维素酶是由绿色木霉、康氏木霉、黑曲霉、 纤维素酶是由绿色木霉、康氏木霉、黑曲霉、 青霉和根霉等菌株经深层发酵制成的酶制剂产品。 青霉和根霉等菌株经深层发酵制成的酶制剂产品。 此外，漆斑霉、反刍动物瘤胃菌、嗜纤维菌、 此外，漆斑霉、反刍动物瘤胃菌、嗜纤维菌、产 黄纤维单孢菌、侧孢菌、黏细菌、 黄纤维单孢菌、侧孢菌、黏细菌、梭状芽孢杆菌 等也能产生纤维素酶。 等也能产生纤维素酶。
09-9-24工业微生物--课件1
也非常广泛。
• 该细胞株培养条件简单，贴壁强度适中，比较容易转染，很适合用它来 研究一般哺乳动物基因的功能。
• 来源：Cricetulus griseus (中国仓鼠) 卵巢 形态：
• 表皮细胞 生长特性：贴壁
• 培养液：Ham‘s F12K （含2 mM L-谷氨酰胺，1.5 g/L NaHCO3）， 10% 胎牛血清。
外源基因的导入相对容易；
已建立了整套表达理论及技术.
芽孢杆菌
芽孢形态
• 已工业化产品生产菌的介绍
3.2 真核细胞表达系统
➢3.2.1 酵母(既是微生物又是真核细胞) 生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
酵母菌形态
酵母菌菌落形态
α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌
江阴市百圣龙生物工程有限公司 (原江阴市星达生化工程有限 公司)位于江苏省江阴市霞客镇。 本公司是全国酶制剂行业重 点生产企业和江苏省高新技术企业。
公司于1992年6月在中国首家引进美国先进的酶制剂菌种、 专有工艺和生产设备，专业生产耐高温α—淀粉酶、高转化率 糖化酶、中温α—淀粉酶等食品级和工业级酶制剂产品，年生 产能力8000吨。现在，本公司的产品不仅畅销国内二十多个 省、市、自治区； 1/3产品已进入欧洲、美国、东南亚等国家 和地区的市场。
现将工业上常用的微生物介绍如下
• 微生物的种类繁多， • 但工业上主要应用者主要有
• 细菌、放线菌、酵母菌及霉 菌四大类
第一节 菌种的分离简介
一、菌种的来源
• 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂 或菌种保藏部门索取或购买；
• 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
发酵工程思考题(含答案)
发酵工程课后思考题第一章绪论1、发酵及发酵工程定义?答：它是应用微生物学等相关的自然科学以及工程学原理，利用微生物等生物细胞进行酶促转化，将原料转化成产品或提供社会性服务的一门科学。
由于它以培养微生物为主,所以又称为微生物工程。
2、发酵工程基本组成部分？答:从广义上讲分为三部分:上游工程、发酵工程、下游工程3、发酵工业产业化应抓好哪三个环节?答：发酵工程产业化就是将有关应用微生物的科学研究成果转化为发酵产品，并投向市场的过程。
三个环节:投产试验、规模化生产和市场营销.①投产试验:涉及到”上、中、下三游”工作，即研究成果的验证、小试、中试和扩大试验.②规模化生产:值得注意的是产品质量问题，其检测必须符合相应产品标准。
③市场营销:市场开拓对技术本身影响不大,但参与市场竞争却是产业化成败的决定因素。
4、当前发酵工业面临三大问题是什么？答：菌种问题纯种，遗传稳定性，安全,周期短、转化率高产率高抗污染能力强:噬菌体、蛭弧菌;合适的反应器生产规模化原料利用量大，并且具有一定选择性,节能，结构多样化、操作制动化，节劳力。
基质的选择价廉原料利用量大,并且具有一定选择性易被利用、副产物少，满足工艺要求。
5、我国发酵工业应该走什么样的产业化道路？发酵过程的组成部分?答第一步为技术积累阶段、第二步为产业崛起阶段、第三步为持续发展阶段典型的发酵过程可划分成六个基本组成部分：（1）繁殖种子和发酵生产所用的培养基组份设定；(2）培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌；（3）培养出有活性、适量的纯种，接种入生产容器中；（4）微生物在最适合于产物生长的条件下，在发酵罐中生长；（5)产物分离和精制;（6）过程中排出的废弃物的处理。
第二章菌种的来源（1）1、自然界分离微生物的一般操作步骤?答：标本采集,预处理，富集培养,菌种分离（初筛，复筛），发酵性能鉴定,菌种保藏2、从环境中分离目的微生物时，为何一定要进行富集？答：让目的微生物在种群中占优势,使筛选变得可能。
菌种的来源—母种转管技术(食用菌生产技术课件)
置于恒温培养箱中避光培养。
5
作物生产技术 母种转管过程中需要注意的事项
注意：
原老种块勿再接入，接种种块不易太大。 试管口离开酒精灯火焰的无菌区范围。 试管口、瓶口尽量向下轻斜。 提前备好无菌棉塞，以更换受潮的棉塞。 转管过程中人员在接种室内不要走动。 及时清除杂物，保持台面干净清洁。
食用菌生产技术
作物生产技术
食用菌生产技术
项目二 菌种的来源
任务三 母种转管技术
1
作物生产技术 母种转管的概念
母种转管是指将分离培养成的 母种菌丝体，无菌操作移接于另外 空白试管培养基上，这个操作过程 叫做转管或转代。
食用菌生产技术
转管操作流程图
2
作物生产技术 母种转管所需要用到的设备与用具
食用菌生产技术
1.超净工作台 2.酒精灯 3.接种钩 4.接种铲 5.75%酒精棉球 6.95%酒精 7.工具支架 8.PDA斜面培养基 9.平皿
6
3
作物生产技术 无菌操作规程
要点：
接种环境消毒灭菌 提前开启超净工作台及 紫外线灯
换好工作服，清洗双手
酒精棉球消毒双手
试管口靠近灯焰；转管 动作快，时间勿太长。养
食用菌生产技术
试管每7支或10支一捆，贴好 标签，注明品种名称及日期等， 使用牛皮纸将棉塞端包好。
生物工艺学知识点
生物工艺学知识点第一章绪论1、生物工艺学（biotechnology）：又称为生物技术，它是应用自然科学及工程学原理，依靠生物作用剂(biological agents)的作用将物料进行加工以提供产品或社会服务的技术。
特点：多学科和多技术的结合、生物作用剂（生物催化剂）的参与、应用大量高、精、尖设备。
2、生物催化剂是游离的或固定化的细胞或酶的总称。
生物催化剂特点：优点：①常温、常压下反应②反应速率大③催化作用专一④价格低廉缺点：稳定性差控制条件严格易变异（细胞）生物反应过程实质是利用生物催化剂以从事生物技术产品的生产过程(process engineering)。
3、生物技术研究的主要内容：基因工程(DNA重组技术，gene engineering) 、细胞工程(cell engineering)、酶工程(enzyme engineering)、发酵工程(fermentation engineering)、蛋白质工程(protein engineering)、第二章菌种的来源1、工业生产常用的微生物细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、担子菌、藻类。
2、分离微生物新种的过程大体可分为采样、增殖、纯化和性能测定。
含微生物材料的预处理方法：物理方法（加热）；化学方法（pH）；诱饵法。
诱饵技术：将固体基质加到待检的土壤或水中，待其菌落长成后再铺平板。
分离的效率影响因素：1）培养基的养分； 2）pH； 3）加入的选择性抑制剂。
3、高产培养基成分的选择准则：制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为生长限制因素（C、N、P、O）；使用一聚合或复合形式的生长限制养分；避免使用容易同化的碳（葡萄糖）或氮（NH4+），它们可能引起分解代谢物阻遏；确定含有所需的辅因子(Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+)加入缓冲溶液以减小pH变化。
4、代谢控制发酵（Metabolic Control fermentation）：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。
第二章 微生物菌种选育
第二章 微生物菌种选育
• 优良的菌种是发酵工业的基础和关键，是 显著改善和提高产品种类、产量以及质量 的先决条件。 • 菌种选育，就是要利用微生物的遗传变异 的特性，采用各种手段，改变菌种的遗传 性状，使其符合工业生产的需要。
本章主要内容
• 第一节 微生物发酵工业的菌种类型及来源 • 第二节 微生物发酵高产菌种选育 • 第三节 菌种的退化和菌种保藏
土样的采集方法
使预被分解的物质成为唯一的碳源或氮源 pH7.0～7.5适于细菌和放线菌，pH4.5 ～6适于霉 菌和酵母 40℃利于放线菌孢子萌发，却不利于细菌生长 限制通入氧气使厌氧菌数量增加
采用平板划线法和稀 通过压力（高温、高压、抗生素）使非目的的 释法，以时间为变量， 类群比例减少 进行纯种分离
从一些发酵制品中分离目的菌株，如酒醪中 分离淀粉酶或糖化酶的产生菌，从酱油中分 离蛋白酶产生菌，从噬菌体污染的发酵液中 分离抗噬菌体的发酵菌株等。
三、菌种微生物的选择性分离
• 菌株的分离和筛选分为以下几步：
采 样 富 集 分 离 筛 选
各种生境下的土壤是 微生物菌种最全面的 来源 人为控制条件使所期 待的目的菌种占据优 势
是单产高的营养缺陷型突变菌株或调节突变菌株或野生菌株，最 好还是抗噬菌体能力强的菌株
菌种纯粹，不易变异退化，以保证稳定性
菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括 抗生素、激素、毒素等），以保证安全
类型：包括细菌、酵母菌、霉菌和放线菌等类群，还有担子菌及藻类等
一、工业发酵常见的微生物种类
担子菌就是人们常说的菇类（mushroom）微生物。
担子菌资源的利用正引起人们的重视，如多糖、 橡胶物质和抗癌药物的研发。
6、藻类（alga）
• 优良的菌种是发酵工业的基础和关键，是 显著改善和提高产品种类、产量以及质量 的先决条件。 • 菌种选育，就是要利用微生物的遗传变异 的特性，采用各种手段，改变菌种的遗传 性状，使其符合工业生产的需要。
本章主要内容
• 第一节 微生物发酵工业的菌种类型及来源 • 第二节 微生物发酵高产菌种选育 • 第三节 菌种的退化和菌种保藏
土样的采集方法
使预被分解的物质成为唯一的碳源或氮源 pH7.0～7.5适于细菌和放线菌，pH4.5 ～6适于霉 菌和酵母 40℃利于放线菌孢子萌发，却不利于细菌生长 限制通入氧气使厌氧菌数量增加
采用平板划线法和稀 通过压力（高温、高压、抗生素）使非目的的 释法，以时间为变量， 类群比例减少 进行纯种分离
从一些发酵制品中分离目的菌株，如酒醪中 分离淀粉酶或糖化酶的产生菌，从酱油中分 离蛋白酶产生菌，从噬菌体污染的发酵液中 分离抗噬菌体的发酵菌株等。
三、菌种微生物的选择性分离
• 菌株的分离和筛选分为以下几步：
采 样 富 集 分 离 筛 选
各种生境下的土壤是 微生物菌种最全面的 来源 人为控制条件使所期 待的目的菌种占据优 势
是单产高的营养缺陷型突变菌株或调节突变菌株或野生菌株，最 好还是抗噬菌体能力强的菌株
菌种纯粹，不易变异退化，以保证稳定性
菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括 抗生素、激素、毒素等），以保证安全
类型：包括细菌、酵母菌、霉菌和放线菌等类群，还有担子菌及藻类等
一、工业发酵常见的微生物种类
担子菌就是人们常说的菇类（mushroom）微生物。
担子菌资源的利用正引起人们的重视，如多糖、 橡胶物质和抗癌药物的研发。
6、藻类（alga）
第2章 菌种的来源
第二章 菌种的来源
• 菌种的分离 • 培养分离
发酵工业对菌种的要求
原料廉价，所需代谢产物产量高； 培养条件易控制； 生长迅速，发酵周期短； 抗噬菌体和杂菌的能力强； 遗传性状稳定，不易变异退化； 发酵过程中的泡沫少； 对添加的前体物有耐受能力；并不能利用前体物作为 一般碳源； • 产物对菌株无反馈抑制； • 不是病原菌。 • • • • • • •
5.采好的样应及时处理， 5.采好的样应及时处理，暂不能处理的也 采好的样应及时处理 应贮存于4℃ 4℃下 但贮存时间不宜过长。 应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。 这是因为一旦采样结束， 这是因为一旦采样结束，试样中的微生 物群体就脱离了原来的生态环境， 物群体就脱离了原来的生态环境，其内 部生态环境就会发生变化， 部生态环境就会发生变化，微生物群体 之间就会出现消长
从自然界筛选
• 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的 、采样季节：以温度适中， 秋初为好。 秋初为好。 • 3、采土方式：在选好适当地点后，用小 、采土方式：在选好适当地点后， 铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土 铲子除去表土 ， 取离地面 处的土 约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中， ，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中， 扎好， 标记， 记录采样时间、 地点、 扎好 ， 标记 ， 记录采样时间 、 地点 、 环 境条件等， 以备查考。 境条件等 ， 以备查考 。 为了使土样中微 生物的数量和类型尽少变化， 生物的数量和类型尽少变化 ， 宜将样品 逐步分批寄回，以便及时分离。 逐步分批寄回，以便及时分离。
3．水样采集方法
• 用于细菌检测的水样应收集于 用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌的 干净、 干净 广口塑料瓶中。 广口塑料瓶中。 • 由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静 由于表层水中含有泥沙， 水层中采集水样。 水层中采集水样。 • 方法是 ： 握住采样瓶底浸入水中 方法是： 握住采样瓶底浸入水中30-50cm处 ， 然后 处 瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。 瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在 的话，应直接将瓶口反向于急流。 的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取 出时应迅速并带有较大的弧度。 出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样 所有水样都应在24h之内迅速进行检测， 或者 之内迅速进行检测， 瓶 。 所有水样都应在 之内迅速进行检测 4℃下贮存。 ℃下贮存。
• 菌种的分离 • 培养分离
发酵工业对菌种的要求
原料廉价，所需代谢产物产量高； 培养条件易控制； 生长迅速，发酵周期短； 抗噬菌体和杂菌的能力强； 遗传性状稳定，不易变异退化； 发酵过程中的泡沫少； 对添加的前体物有耐受能力；并不能利用前体物作为 一般碳源； • 产物对菌株无反馈抑制； • 不是病原菌。 • • • • • • •
5.采好的样应及时处理， 5.采好的样应及时处理，暂不能处理的也 采好的样应及时处理 应贮存于4℃ 4℃下 但贮存时间不宜过长。 应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。 这是因为一旦采样结束， 这是因为一旦采样结束，试样中的微生 物群体就脱离了原来的生态环境， 物群体就脱离了原来的生态环境，其内 部生态环境就会发生变化， 部生态环境就会发生变化，微生物群体 之间就会出现消长
从自然界筛选
• 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的 、采样季节：以温度适中， 秋初为好。 秋初为好。 • 3、采土方式：在选好适当地点后，用小 、采土方式：在选好适当地点后， 铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土 铲子除去表土 ， 取离地面 处的土 约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中， ，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中， 扎好， 标记， 记录采样时间、 地点、 扎好 ， 标记 ， 记录采样时间 、 地点 、 环 境条件等， 以备查考。 境条件等 ， 以备查考 。 为了使土样中微 生物的数量和类型尽少变化， 生物的数量和类型尽少变化 ， 宜将样品 逐步分批寄回，以便及时分离。 逐步分批寄回，以便及时分离。
3．水样采集方法
• 用于细菌检测的水样应收集于 用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌的 干净、 干净 广口塑料瓶中。 广口塑料瓶中。 • 由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静 由于表层水中含有泥沙， 水层中采集水样。 水层中采集水样。 • 方法是 ： 握住采样瓶底浸入水中 方法是： 握住采样瓶底浸入水中30-50cm处 ， 然后 处 瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。 瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在 的话，应直接将瓶口反向于急流。 的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取 出时应迅速并带有较大的弧度。 出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样 所有水样都应在24h之内迅速进行检测， 或者 之内迅速进行检测， 瓶 。 所有水样都应在 之内迅速进行检测 4℃下贮存。 ℃下贮存。
徐莹生物工艺学-第章菌种选育
2020/5/28 菌种保藏及作为中国进海洋一大步学 食育品学种院的出发菌株
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问题：
如何使样品中所含目标微生物的可能性大？ 如何在后续的操作中使这种可能性实现？
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生物工艺学 徐莹
（一）采样 1）从大自然中的原材料采样原则： 根据筛选的目的，微生物的分布概况 及菌种的主要特征与外界环境关系等，进 行综合地、具体地分析来决定。
的土，酵母菌较多。
d. 采土的最适季节。一般应避免雨季采土，而以秋季采 土比较理想。
e. 土壤的酸碱度。 细菌和放线菌在中性或偏碱性土壤中较多； 酵母菌和霉菌，一般在偏酸性的土壤、普通植物花 朵、瓜果种子及腐植物等上面较多。
②结合产品的特点
采样时要注意的问题
• 如：耐高渗透压→蜂蜜、蜜饯及常有糖质流经或贮
释液经过80℃，10min水浴处理。
•营养体：60-70℃ 10min 杀死； •芽孢：耐100℃以上高温。
芽孢
4）添加抑制剂
• 某些抗生素和化学试剂对微生物有专一性抑制 作用。注意对象、浓度。
– 分离细菌时，加入50U/ml制霉菌素，抑制霉菌和酵 母菌
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生物工艺学 徐莹
选择生产菌种应注意的因素
1.原料方面：广，转化率高； 2.产物方面：目的产物含量高，副产物少； 3.菌体方面：生长快、繁殖力强，耐受力强，抗
污染、抗噬菌体能力强，遗传特性稳定
4. 设备方面：产泡沫少，适宜大罐生产。
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显微操作仪，专业程度高
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第二章 工业菌种选育--菌种保藏(4)
(5) 冷冻干燥法 适用于各种微生物，其原理是在低温下迅速地将
细胞冻结以保持细胞结构的完整，然后在真空下使水 分升华干燥。
具体做法是将菌种制成悬浮液，与保护剂(一般 为脱脂牛奶或血清等)混合，放在安瓿瓶内，用低温 酒精或干冰使之速冻，在低温下用真空泵抽干，最后 将安瓿瓶真空熔封，低温保存备用。
2. 工业生产中使用的微生物菌种为什么会发生衰退? 菌种衰退表现在哪些方面? 防止菌种衰退的措施有哪 些?
砂土是砂和土的混合物，砂和土的比例一般为3： 2或1：1，将黄砂和泥土分别洗净，过筛，按比例混 合后，装入小试管内，装料高度约为l cm左பைடு நூலகம்，灭菌、 烘干。
将要保存的斜面菌种刮下，直接与砂土混合；或 用无菌水洗下孢子，制成悬浮液，再与砂土混合。混 合后的砂土管放在盛有五氧化二磷或无水氯化钙的干 燥器中，用真空泵抽气干燥后，放在干燥低温环境下 保存。
绝大多数微生物的菌种，保藏其休眠体（如孢子或芽孢）的效 果要优于营养体。
第二章 菌种的来源与保藏
二. 菌种保藏的方法
(1) 斜面低温保藏法 4 ℃冰箱中保存。一般的菌种均可用此方
法保存1～3个月. (2) 液体石蜡封存保藏法
在斜面菌种上加入蒸汽灭菌后的液体石 蜡，用量高出斜面1 cm，使菌种与空气隔绝， 试管直立，置于4℃冰箱保存。保存期约1年。 此法适用于不能以石蜡为碳源的菌种。
这样菌种的生长和代谢活动处于极低水平，不易 发生变异或死亡，因而能长期保存，一般为5～10年。
(6) 液氮超低温保藏法
微生物在-130 ℃ 以下，新陈代谢活动停 止，这种环境下可永久性保存微生物菌种。液 氮的温度可达，用液氮（-196 ℃）保存微生 物菌种已获得满意的结果。
思考与练习题
发酵工程菌种的来源及选育
随机分离原理与技术
从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速 灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛 选出所需的目的菌。
技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应 筛选方法的确定。
随机分离技术举例
药理活性化合物产生菌的筛选
药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一 个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到 治疗的目的。
（2）化学法
通过培养基中添加某些化学成分来增加微生物的数量。 如：用添加CaCO3稳定培养基的PH来分离嗜碱性的放线菌。
（3）诱饵法
将某些固体物质如石蜡、花粉、蛇皮、毛发等加到分离的土 壤或水中做成诱饵富集目的菌，待菌落长出后再进行分离。
3. 富集培养
富集培养
利用不同微生物生长繁殖对环境和营养的不同要求，如温度、 PH、渗透压、溶氧浓度、碳源和氮源类型及浓度等，使目的微 生物在最适宜条件下迅速繁殖，数量增加，成为人工环境下的 优势种。
(二)生态学参数及培养基的组成原则
1、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境生物物 理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶剂都会影响 实验中所要分离的细菌的数量和种类。
2、Байду номын сангаас分离培养基的组成而言，部分培养基中必须含有 10-50%的天然提取物。加入培养基中的天然提取物， 部分培养基中则应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤 维素或果胶。
真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例
稀释分离法
取发酵液少许以10倍稀释成10-1-10-7 取0.1ml 加入固体培养基铺平皿（×2）
在麦芽汁固体培养基上，25℃培养48-72h
形态筛选 根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用
纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次
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每 株 3-5 瓶 3— 5%
取 舍 情 况 留 下 产 量 较 高 的 10- 每 次 保 留 10— 20% ，
- 20% 的 菌 株
直 至 最 后 3— 5 株
初筛：以量为主 复筛：以质为主
培养工艺条件试验与生产试验
摇瓶发酵条件 培养基组成、初始pH、通风量（装液量）、接种量、
培养温度… 小型台式发酵罐发酵工艺条件
第二章：微生物菌种的选育
2.1 菌种的来源 2.2 发酵高产菌种的选育（自学） 2.3 菌种退化和菌种保藏（自学） 2.4 微生物菌种的扩大培养
从自然界分离的菌种
自然选育 扩大培养
基因工程 生产用菌种
人工选育 原料
接种
发酵罐
灭菌
发酵条件控制
培养基配置
分离 提纯
微生物菌体
代谢产物
产品
2.1 菌种的来源
3、培养时间
4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速 度的手段，培养（固体、液体；分批 连续）后使目的微生物在种群中占优 势。
菌落的选出
从产物角度出发
纸片培养显色法 透明圈法 变色圈法 生长圈法 抑制圈
在培养时以产物的形成有目的的设计培养基
利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素
从形态的角度
菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖 产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观 上就可以初步识别。
➢富集的三种方案： 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。
当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，
不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法
定向培养的方法
物理方法：加热、膜过滤等。
但主要是通过培养的方法
定向培养的富集方法
1、底物
2、pH条件
放线菌（链霉素 四环素；红霉素 等）
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌
植物或动物来源
2.1.1 已经工业化生产的微生物菌种的介绍
氨基酸生产有关的微生物
50, 60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是 发酵工业发展历史上的一个转折点：
代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生 物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地 称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。
α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌
2.1.2 工业菌种的来源
（1）向菌种保藏机构（p69~70）索取有关的菌种， 从中筛选出所需菌株。 （2）从自然界采集样品，从中进行分离筛选。 （3）从一些发酵制品中分离目的菌株。。
2.1.3 微生物菌种的选择性分离
菌种分离的一般过程 土样的采取 → 预处理 → 培养 → 菌落的选择
→ 产品的鉴定 目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物 问题： 如何使样品中所含微生物的可能性大
如何在后续的操作中使这种可能性实现
采样时要注意的问题
气候、水分、空气 来源要广 结合产品的特点 标签：地点、时间、气候等
目的微生物富集的一些基本方法
➢富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 得可能。
人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸
天冬氨酸
人工诱变的 菌种不能产生
高丝氨酸 脱氢酶
天冬氨酸激酶
中间产物Ⅰ
高丝氨酸
不能合成
甲硫氨酸
苏氨酸
中间产物Ⅱ
赖氨酸
可以大 量积累
2.1.1 已经工业化生产的微生物菌种的介绍
氨基酸生产有关的微生物 氨基酸生产菌的要求： 代谢途径比较清楚，
代谢途径比较简单
谷氨酸发酵的菌种： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌
（4）无杂菌污染；
（5）保持稳定的生产能力。
2.4 微生物菌种的扩大培养
• 种子扩大培养的目的与要求
种子制备过程举例 一、谷氨酸生产的种子制备
制备过程
斜面菌种 →一级种子培养 →二级种子培养
→发酵
2.4 微生物菌种的扩大培养
• 种子扩大培养的目的与要求
1、斜面 (AS1.299) 培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2 培养条件：32℃，生长18-24小时
溶解氧控制，pH值控制，原料添加模式，消泡剂…
2.2 发酵高产菌种的选育（自学） 2.3 菌种退化和菌种保藏（自学）
2.4 微生物菌种的扩大培养
种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥 管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后， 在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定 数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。
菌种扩大培养的目的：
接种量的需要：为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢 旺盛的种子；菌种的驯化；缩短发酵时间、保证生产水平。
2.4 微生物菌种的扩大培养
种子的要求：
（1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速 生长，迟缓期短；
（2）生理形状稳定； （3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；
其它氨基酸生产菌： 常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌 选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌
2.1.1 已经工业化生产的微生物菌种的介绍
食品酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于 食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的 仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。
工业微生物：
包括细菌、放线菌、酵 母菌、霉菌和工程菌。
在发酵工业上已经应用的或具有潜在应用 价值的微生物。
生产菌种的性能（最重要）；
发酵条件；
决定
提纯工艺条件。
发酵工业生产水平
2.1.1 已经工业化生产的微生物菌种的介绍
抗生素生产有关的微生物
抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代 谢，目前发现的生物来源如下：
培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细
生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次
2.4 微生物菌种的扩大培养
• 种子扩大培养的目的与要求
2. 一级种子（摇瓶） 培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%
琼 脂 块 培 养 法 筛 选 抗 生 素 产 生 菌 程 序
筛选ห้องสมุดไป่ตู้
（1）菌种的营养特征；（2）菌种的生长温度； （3）菌种对所采用的设备和生产过程的适性； （4）菌种的稳定性；（5）产物的得率及培养液中 的浓度；（6）容易从培养液中回收产物
初筛
复筛
种 子 斜面菌种
液体种子
摇瓶 接种量
每株 1瓶 每瓶一环