关于大肠杆菌培养基的优化实验
实验一 培养基优化 - 副本
分析A因素各水平对试验指标的影响。由表3可以看出，A1的
影响反映在第1、2、3号试验中，A2的影响反映在第4、5、6
号试验中，A3的影响反映在第7、8、9号试验中。 A因素的1水平所对应的试验指标之和为
KA1=y1+y2+y3=0+17+24=41，kA1= KA1/3=13.7；
A因素的2水平所对应的试验指标之和为
平，列出因子水平表; 根据因子和水平数选用合适的正交表，设计 正交表头，并安排实验; 根据正交表给出的实验方案，进行实验; 对实验结果进行分析，选出较优的实验条件 以及对结果有显著影响因子。
一、实验目的
掌握微生物斜面培养基、种子培养基及发
酵培养基确定方法，学会对已确定菌种确 定实验室发酵工艺。
二、实验原理
生物量的测定方法有比浊法和直接称重法等。
由于细菌、酵母等单细胞生物在液体深层通 气发酵过程中是以均一混浊液的状态存在的， 所以可以采用直接比色法进行测定。
三、仪器与试剂
全恒温振荡培养箱，分光光度计、电热恒温
水浴槽、天平、电炉。
试剂为葡萄糖、胰蛋白胨、 酵母浸粉、
NaCl。
案（表10-5）。
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退 出
表10-5 试验方案及试验结果 试验号 1 2 3 4 5 6
因
A 11（10） 1 1 22（50） 2 2 B 11（1） 22（4） 33（7） 1 2 3
素
C 11（20） 22（35） 33（50） 2 3 1 D
1(1.5) 1
2(2.5) 2 3(3.5) 3
四、实验方法
（1）培养基的配制 表1
因素水平 1 2 3 4 葡萄糖％ 5 3 1.5 1
大肠杆菌实验报告
大肠杆菌实验报告
实验目的：研究大肠杆菌的生长规律和影响因素。
实验原理：
大肠杆菌是一种常见的革兰氏阴性菌，广泛存在于自然环境中，如土壤、水体和动物的消化道中。
大肠杆菌是一种强大的生物工程工具，被广泛用于基因克隆、蛋白表达和生物制药等领域。
大肠杆菌的生长主要受到以下因素的影响：
1. 温度：大肠杆菌的适宜生长温度一般为37℃。
过高或过低
的温度都会抑制细菌的生长。
2. pH值：大肠杆菌对酸碱度有一定的耐受能力，适宜生长的pH范围为6.5-7.5。
3. 氧气含量：大肠杆菌是一种厌氧菌，但也可以在氧气存在的条件下进行生长。
4. 营养物质：大肠杆菌需要碳源、氮源、磷源等营养物质来进行生长。
实验步骤：
1. 准备培养基：将大肠杆菌营养琼脂混合溶解，并进行高温高压灭菌处理。
2. 用无菌移液管取一小滴大肠杆菌液，滴入含有营养琼脂的平板培养基上，轻轻摇晃平板，使细菌均匀分布于培养基上。
3. 将培养基置于恒温培养箱中，调节温度为37℃，培养一定
时间，观察菌落的形成和生长情况。
4. 在不同温度、pH值、氧气含量和营养物质条件下，重复步
骤2和3。
实验结果：
根据实验观察，大肠杆菌在37℃左右的温度下生长最好，pH 值在6.5-7.5之间时生长最快，适宜的氧气含量是气体和液体的界面。
实验结论：
大肠杆菌的生长受到温度、pH值、氧气含量和营养物质的影响。
掌握这些影响因素，能够更好地培养和利用大肠杆菌进行实验和工程应用。
大肠杆菌培养实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除大肠杆菌培养实验报告篇一：大肠杆菌实验报告大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选0740063阿噟兰1.前言抗生素能破坏细菌细胞壁的结构，使细菌的繁殖和生长受到抑制。
但某些细菌对抗生素表现出抗性，原因是其基因发生了改变，产生能抵抗抗生素的性状。
在自然情况下，细菌的基因突变率很低，而且突变是不定向的，因此在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。
当给与适当的物理条件时，其突变率会大大增加。
如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时，能够促进遗传物质突变。
DnA对紫外线（uV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。
紫外线引起DnA结构变化的形式有DnA链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。
因此，紫外线通常作为诱变剂，用于微生物菌种选育。
一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变率高，诱变最有效的波长253~265nm。
选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键，过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。
在紫外线诱变下，菌株发生不定向的突变，想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。
本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。
若菌株没有发生定向突变，则该菌株不能在抗性培养基上正常生长，只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。
紫外线对于菌株有诱变作用外，对菌株还有较强的致死作用，因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。
因此，通过本实验的操作，在合适的照射剂量的设置下，比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率，并初步分析两者的相关性。
在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上，能了解诱变育种的机理和方法，为做进一步的诱变实验做准备。
2.材料和方法2.1实验材料、仪器和试剂菌种：大肠杆菌仪器：超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器试剂：牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理盐水2.2实验方法2.2.1制备培养基普通培养基——牛肉膏蛋白胨培养基（400ml）：牛肉膏5g蛋白胨10gnacl5g琼脂20g蒸馏水1000mlph7.0按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115℃15min，倒平板，4皿*15ml*5组+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml筛选培养基(200ml)：含抗生素50mg/L。
【报告】大肠杆菌培养实验报告
【关键字】报告大肠杆菌培养实验报告篇一：大肠杆菌检测实验报告国标法测定大肠杆菌样本的细菌总数实验目的实验原理：国标法操作的原理实验器材：培养箱，10只移液管，1只250ml锥形瓶，5只大试管，试管架，4个平皿，500ml大烧杯1个，电子天平，纱布，脱脂棉，灭菌锅，PH计或PH试纸，100ml量筒，橡皮手套，超净台实验药品：磷酸盐缓冲液，蒸馏水，LB培养基，琼脂，5%NaOH，5%HCl实验步骤：一：10只移液管，1只250ml锥形瓶，5只大试管，4个平皿，500ml大烧杯1个，100ml 量筒进行洗涤，然后一起放入高压蒸汽灭菌锅中在121摄氏度条件下灭菌20min。
灭完菌后烘干，完成后放入超净台中。
用酒精擦拭超净台，紫外消毒30min二：1：用电子天平称取成品LB 3.1241g和琼脂1.8756g放入250ml的洁净锥形瓶中。
2：用量筒量取125ml的蒸馏水加入该锥形瓶中，制成培养基。
3：用棉花堵住该锥形瓶的瓶口，用牛皮纸包住瓶口，用橡皮筋扎牢，再将培养基放入灭菌锅中在121摄氏度之下灭菌20min。
4：灭完菌后放入超净台中备用。
三：1：取1只无菌250ml锥形瓶，用量筒向其中加入49ml PBS2：将1ml样品加入到该锥形瓶中，摇匀制成1:50的细菌溶液。
3：取4只试管，编号1—44：用无菌移液管分别向4只试管中加入9ml的PBS5：用1ml无菌移液管从样品中移取1ml菌液加入到1中.震荡试管使菌液均匀。
6：用1ml无菌移液管从1号试管中移取1ml的细菌溶液加入2号试管中，摇匀7：用另一只1ml无菌移液管从2号试管中移取１ｍｌ细菌溶液，加入3中，摇匀．．．．．．以此类推直至4只试管中均加入了细菌溶液。
9：取4只平皿，编号1—410：分别用4只无菌移液管从这4只试管中移取１ｍｌ的菌液置于4只平皿中，加入４５—５０摄氏度温度下的培养基，约１５ｍｍ厚度。
缓慢旋转平皿使菌液与培养基混合均匀；待培养基冷凝后倒置。
重组大肠杆菌DH5_发酵培养基的优化_张怡洁
广州化工2009年37卷第3期摘要：为了提高重组大肠杆菌DH5α生产rNGR-Tum-5，研究了培养基中不同种类的碳氮源物质和微量元素对工程菌生产蛋白能力的影响。
得出在培养基组分（%）为：甘油1，酵母粉3，蛋白胨1，氯化钠0.5，微量元素母液150μ时，重组大肠杆菌DH5α生产rNGR-Tum-5最强，较初始培养基提高了5倍。
关键词：重组大肠杆菌；培养基优化；rNGR-Tum-5Optimization for Fermentation Medium of Recombinant E.coli DH5α*ZHANG Yi-jie 1,LI Cong 2,WANG Peng 3,SHEN Ye-hua 2,3,ZHANG Ying-qi 3（1Department of Life Science,Northwest University,Shaanxi Xi'an 710069;2Key Laboratory of Synthetic and Natural Functional Molecule Chemistry of M intistry of Eduction,College of Chemistry andMaterials Science,Institute of Drug Discovery,Northwest University,Shaanxi Xi'an 710069;3Biotechnology Center,School of Pharmacy,Fourth M ilitary Medical University,Shaanxi Xi'an 710033,China)Abstract:To improve the productivity of rNGR-Tum-5from recombinant E.coli DH5,the effect of different types of carbon,nitrogen sources and trace elements in the culture medium on the yield of rNGR-Tum-5were investigated with shaking flask method.It was found that the productivity of rNGR-Tum-5from recombinant E.coli DH5was the highest and raised five times over that in the initial culture medium under the condition of 1%glycerol,3%yeast extract,1%peptone,0.5%sodium chloride and 150μtrace elements solution in the culture medium (w/w).Key words:recombinant E.coli ;the optimization of culture medium;rNGR-Tum-5重组大肠杆菌DH5α发酵培养基的优化*张怡洁1，李聪2，王鹏3，申烨华2,3，张英起3（1西北大学生命科学院，陕西西安710069；2西北大学合成与天然功能分子化学教育部重点实验室，化学与材料科学学院，新药研究所，陕西西安710069；3第四军医大学药学系生物技术中心，陕西西安710033）*基金项目：第四军医大学博士后基金，陕西省科学技术研究发展计划，2005K-G1(8)；陕西省教育厅产业化教育项目05JC30。
大肠杆菌培养实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除大肠杆菌培养实验报告篇一：大肠杆菌实验报告大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选0740063阿噟兰1.前言抗生素能破坏细菌细胞壁的结构，使细菌的繁殖和生长受到抑制。
但某些细菌对抗生素表现出抗性，原因是其基因发生了改变，产生能抵抗抗生素的性状。
在自然情况下，细菌的基因突变率很低，而且突变是不定向的，因此在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。
当给与适当的物理条件时，其突变率会大大增加。
如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时，能够促进遗传物质突变。
DnA对紫外线（uV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。
紫外线引起DnA结构变化的形式有DnA链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。
因此，紫外线通常作为诱变剂，用于微生物菌种选育。
一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变率高，诱变最有效的波长253~265nm。
选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键，过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。
在紫外线诱变下，菌株发生不定向的突变，想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。
本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。
若菌株没有发生定向突变，则该菌株不能在抗性培养基上正常生长，只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。
紫外线对于菌株有诱变作用外，对菌株还有较强的致死作用，因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。
因此，通过本实验的操作，在合适的照射剂量的设置下，比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率，并初步分析两者的相关性。
在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上，能了解诱变育种的机理和方法，为做进一步的诱变实验做准备。
2.材料和方法2.1实验材料、仪器和试剂菌种：大肠杆菌仪器：超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器试剂：牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理盐水2.2实验方法2.2.1制备培养基普通培养基——牛肉膏蛋白胨培养基（400ml）：牛肉膏5g蛋白胨10gnacl5g琼脂20g蒸馏水1000mlph7.0按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115℃15min，倒平板，4皿*15ml*5组+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml筛选培养基(200ml)：含抗生素50mg/L。
实验四大肠杆菌发酵培养基的优化
基本工具——正交表 记号：Ln（tm） L：正交表的符号 n：表的行数（可安排试验的次数） t：表中的字码数（水平数） m：表的列数（最多可安排因素个数） L8(27) L9(34) L16(45)
A
试验点分布均匀、整齐可比
B
任何一列中各字码（水平）都出现，且出现的次数相等
X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9
k1 k2 k3
(X1+X2+X3)/3 (X4+X5+X6)/3 (X7+X8+X9)/3
(X1+X4+X7)/3 (X2+X5+X8)/3 (X3+X6+X9)/3
(X1+X5+X9)/3 (X2+X6+X7)/3 (X3+X4+X8)/3
极差
对照两者的结果，若试验1结果值大于试验2，则试验1条件即为最优化条件。若试验2结果值大于试验1，则应再改变因素C的水平，继续做对照实验，直至达最佳结果。
06
试验2： A2 B2 C4
04
若某一因素k3或者k1 最大，则说明所选择的该因素的水平范围不合适， 如：对于因素C，k3最大，说明因素水平表中所设计的最高水平0.6% 不一定为最佳。如果该因素的R值较大，影响较显著，则必须进行重复实验或对照实验。
单因素法
01
正交试验法
01
均匀试验设计 培养基优化方法（原材料种类和浓度配比优化）
01
概念
利用已经设计好的表格--正交表--来安排试验并进行数据分析的一种方法。
它是从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。
“大肠杆菌的培养和分离”实验步骤的修正与优化
“大肠杆菌的培养和分离”实验步骤的修正与优化张泽悠 （上海师范大学生命与环境科学学院 ２０００３０） 茅英莎 （华东师范大学生命科学学院 上海 ２０００６２）陆文妹 （浙江省台州市第一中学 ３１８０００）摘 要 以“大肠杆菌的培养和分离”实验为例，修正了实验步骤中的疏漏之处，优化了实验步骤中专业词汇的表述方式，并对学生难以理解的实验步骤和现象做了相应的注释，使整个实验过程更有利于学生的学习和理解。
关键词 大肠杆菌培养与分离 实验步骤 修正优化 高考改革为“３＋３”模式，意味着选修模块的重要性将会逐渐凸显出来。
在生物学科中，选修一枟生物技术实践枠被列入选考范围，所涉及的内容基本为相关实验的原理及操作。
学生了解相关实验操作的步骤及注意事项尤其重要，而教材中的实验步骤是学生学习实验步骤与操作的基础。
本文以（浙科版）枟生物技术实践枠中的“大肠杆菌的培养和分离”实验为例，以教材中的实验步骤为基础，对其中涉及的实验操作———ＬＢ固体平面培养基的制作以及细菌的划线分离的实验步骤进行修正和优化。
１ “大肠杆菌的培养和分离”实验步骤修正在枟生物技术实践枠中详细阐述了大肠杆菌培养和分离的实验步骤，在实际操作后发现，教材介绍的实验步骤需要修正。
１．１ 封口膜的使用 教材在实验步骤中提到“在两个２５０ｍＬ的三角瓶中分别装入５０ｍＬＬＢ液体培养基和５０ｍＬＬＢ固体培养基，加上封口膜”。
目前，实验室所用的封口膜材料多为ＰＰ（聚丙烯），遇明火易燃，且燃烧后会熔化，因此在使用过程中应尽量避免接触明火。
而在接下来的实验操作中，出于无菌的要求，所有的操作均要求尽量靠近酒精灯进行，实验又要求在取下封口膜时“在酒精灯旁，以右手无名指及小指夹持含有固体培养基的三角瓶的封口膜”。
在这种情况下，封口膜与酒精灯火焰的距离较近，封口膜可能会被点燃，存在一定的安全隐患。
微生物实验中所用的封口材料要满足密封、无菌、耐高温的要求，且不易点燃。
出于以上要求的考虑，可以在实验中选择由８层纱布绑成的棉塞。
大肠杆菌的分离及培养条件的优化-第二组
• 3.根据所需波长转动波长选择钮。 • 4.将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦
镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光 路。
分光光度计
• 5.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘 指针指向t=0处。
0.5% 1%
---
2%NH4NO3 0.5% 1%
0.5% 2%
---
1%
0.5% 1%
0.5% ---
1%
（NH4)2SO4
2%
0.5% 1%
0.5% ---
2%
（NH4)2SO4
原LB培养基 0.5% 1%
0.5% ---
---
尿素
1% 2%
----
--
--
优化过程
• 配制培养基：首先配置lb培养基，分装于七 个锥形瓶中，按方案称取无机氮源依次加 入瓶中，混匀
• 该仪器应放在干燥的房间内，使用时放置 在坚固平稳的工作台上，室内照明不宜太 强。
结果
1%尿素 2%尿素 1%NH4NO3 2%NH4NO3
OD值1 OD值2 OD值平均 PH
0.234
0.335
0.2845
8.0
0.116
0.164
0.14
9
0.556
0.538
0.547
6.8
0.626
0.676
蛋白胨 3.5g
NaCl 1.75g
琼脂
4g
水 350ml
ph在7.2左右
灭菌
倒平板
• 用左手握住三角瓶的底部，倾斜三角瓶，用 右手旋松棉塞，用右手的小指和手掌边缘夹 住棉塞并将它拔出将瓶口在火焰上过一下
大肠杆菌培养实验报告
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但某些细菌对抗生素表现出抗性，原因是其基因发生了改变，产生能抵抗抗生素的性状。
在自然情况下，细菌的基因突变率很低，而且突变是不定向的，因此在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。
当给与适当的物理条件时，其突变率会大大增加。
如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时，能够促进遗传物质突变。
DnA对紫外线（uV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。
紫外线引起DnA结构变化的形式有DnA链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。
因此，紫外线通常作为诱变剂，用于微生物菌种选育。
一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变率高，诱变最有效的波长253~265nm。
选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键，过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。
在紫外线诱变下，菌株发生不定向的突变，想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。
本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。
若菌株没有发生定向突变，则该菌株不能在抗性培养基上正常生长，只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。
紫外线对于菌株有诱变作用外，对菌株还有较强的致死作用，因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。
因此，通过本实验的操作，在合适的照射剂量的设置下，比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率，并初步分析两者的相关性。
在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上，能了解诱变育种的机理和方法，为做进一步的诱变实验做准备。
2.材料和方法2.1实验材料、仪器和试剂菌种：大肠杆菌仪器：超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器试剂：牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理盐水2.2实验方法2.2.1制备培养基普通培养基——牛肉膏蛋白胨培养基（400ml）：牛肉膏5g蛋白胨10gnacl5g琼脂20g蒸馏水1000mlph7.0按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115℃15min，倒平板，4皿*15ml*5组+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml筛选培养基(200ml)：含抗生素50mg/L。
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由图表可看出，当温度为42摄氏度，PH为9时，实验数据较其他相差较大，为可疑数据。
平均值为0.1872标准差S=0.398478
偏差为0.7128
2S=0.796956>0.7128
根据拉伊达准则，当显著性水平等于0.05时，0.9这一可疑值不能舍去
关于大肠杆菌培养基的优化实验
一、实验目的：研究培养基中适宜的PH值，温度及含水量最佳配比，学会处理实验中的各种误差，掌握发酵培养基的配制方法。
二、
（1）实验单元：培养基，无菌移液器，恒温箱，玻璃棒，大肠杆菌，灭菌箱，营养液等。
（2）实验效应：发酵液中的OD值。
（3）实验因素：温度，PH值，含水量等。
（4）测定各摇瓶中的OD值并分析比较。
四、实验结果
假设当温度为38摄氏度，PH值为8时，大肠杆菌的生长速度最快。
大肠杆菌的生长速度与设定温度的最佳温度成正比例函数态分布，与PH值呈正态函数分布。
下表为实验数据：
PH温度
8
15
38
42
50
6
0.0000
0.0060
0.0100
0.0078
0.0027
7
所以F>F0.05（4，4），两方差有显著差异性
T=0.9044df=3
T0.0025(3)=3.182
t>t0.0025(3)两平均值间有显著差异，存在系统误差
(2)关于随机误差——F检验法
F=3947.7 F>1df2=4 df4=4
所以采用单侧检验法
查F表得F0.025（4，4）=9.60
F>F0.025（4，4）则方差2比方差4有显著增大
纵向比较
X1=0.00666 0.000046753
X2=0.0095 0.00004
X3=0.013 0.000017185
X4=0.1892 0.157907465
X5=0.00442 0.000011787
根据上述数据，比较第二组及第四组数据
F=3947.7
已知n2=5 n4=5所以df2=4 df4=4茬F表的F0.05（4，4）=4.11
0.0079
0.0105
0.0123
0.0102
0.00பைடு நூலகம்2
8
0.0167
0.0190
0.0200
0.0193
0.0093
9
0.0082
0.0100
0.0129
0.900
0.0049
10
0.0005
0.0020
0.0098
0.0087
0.0000
单位：g/ml/min
五、误差分析
(1)关于系统误差——T检验法
三、实验过程：
（1）将培养基灭菌、标记、包扎，将培养好的菌种摇匀用无菌移液器分别移至个实验组中（注意等量原则）；
（2）将实验组分别放置在8、15、38、42、50摄氏度的恒温箱中培养30分钟，其他实验变量保持相同；
（3）将实验组分别放置在PH为6、7、8、9、10的恒温箱中培养30分钟，其他实验变量保持相同；