酵母转化PEG LiAC法

酵母转化

(一)原理：

我们采用的是PEG/LiAc法转化酵母。

PEG是一种高分子聚合物,只有分子量达到3000左右的PEG才会发挥最大的转化促进作用。本文使用的PEG分子量为3350,实验结果表明促转化效果可以达

到103～105cfu/μg。PEG在酵母转化中起到在高浓度醋酸锂环境中保护细胞膜,

减少醋酸锂对细胞膜结构的过渡损伤,同时促进质粒与细胞膜接触更紧密。PEG的

浓度是务必适宜,这一点很重要。

LiAc可使酵母细胞产生一种短暂的感受性状态,此时它们能够摄取外源性DNA。

鲑鱼精担体DNA为短的线形单链DNA,在转化实验中主要是保护质粒免于被DNA酶降解;另外还可能在酵母细胞摄取外源性环形质粒DNA中发挥协助作用。

在每次使用前务必进行热变性,使可能结合的双链DNA打开,保证鲑鱼精担体DNA

在转化实验体系中以单链形式存在

(二)材料、仪器设备及试剂：

1.SD培养基：

z YNB： 1.6g/L

z硫酸铵：5g/L

z氨基酸：根据质粒的筛选压力选择性添加

z调节pH=5.8，121°灭菌15min

2.YPDA培养基

z胰蛋白胨20g/L

z酵母浸膏10g/L

z琼脂20g/L(固体)

z腺嘌呤15ml0.2%腺嘌呤/L

z调节pH=7.5，121°灭菌15min

3.0.9%NaCl（w/v）

z NaCl:0.9g

z milipore水定容到100ml

z灭菌121°，20min

4.100%DMSO

从试剂瓶中分装到ep管中，500ul每管，室温保存

5.10×TE（pH=7.5）：（0.1M Tris-HCl，10mM EDTA）

z Tris-HCl 1.211g/100ml

z EDTA0.37g/100ml

z调节pH=7.5,121°，20min

6.10×LiAc（pH=

7.5）

z1M LiAc10.202g/100ml

z用醋酸调节pH=7.5，121°灭菌20min

7. 1.1×TE/LiAc

z Tris-HCl11ml10×LiAc（pH=7.5）/100ml

z EDTA11ml10×EDTA（pH=7.5）/100ml

z调节pH=7.5,121°，20min

8.50%PEG3350：

z PEG3350：50g

z已灭菌的milipore水：定容到100m

z（可用50°水浴助溶，PEG易吸水，不可灭菌）

9.PEG/LiAc：现配现用，在超净台中操作，吸取母液到ep管或50ml离心管中

终浓度10ml

PEG335040%8ml50%PEG3350

TE buffer1×1ml10×TE

LiAc1×1ml10×LiAc

10.变性的鲑鱼精DNA(10mg/ml)

ipore水，70%酒精棉球，50ml离心管4个，ep管一盒，15ml试管架，50ml试管

架，ep管架

(三)具体方法：

A：酵母感受态制备

1.从平板上或保种管中，挑少许酵母，在YPDA平板上划单克隆，30°培养3天左右。

2.从平板上分别挑取单克隆（直径2-3mm）到含有3ml YPDA的玻璃试管中（平行做3

管）

3.30°，250rpm，培养8-12h

4.取200ul菌液，测OD600

5.选取OD600值最大的一个试管（即活力最高的一个），吸取5ul转移至50m新鲜的YPDA

培养基中（培养基装在250ml三角瓶中）

6.30°，230rpm，培养16-20h，直至OD600=0.15-0.3

7.将培养好的菌液转入2个50ml离心管，室温离心3000g，3min，弃上清，用100ml新

鲜的YPDA悬起管底的菌体，并倒入干净的三角瓶中。

8.30°，230rpm培养直到OD600=0.4-0.5（3-5小时）

9.将菌液倒入2个50ml离心管，室温离心，3000g，3min，弃上清，每个离心管用30ml

milipore水重悬。

10.再次离心，3000g，3min，弃上清，每管用1.4ml1.1×TE/LiAc重悬。

11.将重悬的菌液转移到2个ep管中，12000rpm，15s

12.弃上清，每管用600ul 1.1×TE/LiAc重悬，将两管重悬菌液并入一管，准备进行转化。

B：酵母质粒转化

小规模转化大规模转化

1.加入质粒DNA100-500ng3-5ug

鲑鱼精DNA(变性的，10mg/ml)5ul20ul

加入感受态细胞,轻弹混匀50ul600ul

2.加入PEG/LiAc,轻弹混匀500ul 2.5ml

3.30°水浴，每10-15min轻弹混匀30min45min

4.加入DMSO,轻弹混匀20ul160ul

5.42°水浴，每5-10min轻弹混匀15min20min

6.离心，弃上清最大转速3000g

15s3min

7.用液体YPDA培养基重悬1ml3ml

8.30°，230rpm，培养90min90min

9.离心，弃上清最大转速3000g

15s3min

10.用0.9%NaCl重悬1ml15ml

11.涂板在相应的筛选培养基上。

(四)注意事项：

1.转化效率与很多因素有关，酵母活力是一个重要因素，一般制备酵母感受态的细胞必须

是没有经过4°保存的，活化过的，从培养箱中取出的新鲜酵母。

2.在制备酵母感受态时，不要超过上述的的OD值，要让酵母一直处在生长最旺盛的时期，

特别是最后一次培养，OD600的值不要超过0.5

3.酵母转化过程中，没有抗生素，极易染菌，所有实验都在超净台中进行，超净台需提前

一天用70%酒精棉擦拭，将第二天用到的物品（如，试剂，试管，架子等）都放入超净台，灭菌过夜，每次进入超净台操作时，需用70%酒精棉擦手消毒。

4.由于酵母生长周期较长，平板一般在培养箱中要放3天左右，所以在倒板时，不可吹得

太干，小板晾干10min左右，大板晾干15min左右即可

5.有些筛选培养基需要加入3-AT，必须是在培养基冷却到55°一下才可加入。