中枢神经系统的基因治疗

中枢神经系统的基因治疗

一.概述

1..基因治疗的概念:

基因治疗是指通过在特定靶细胞中表达该细胞本来不表达的基因,或采用特定方式关闭、抑制异常表达基因，达到治疗疾病目的的治疗方法。

在基因治疗的早期，基因治疗是指将目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内基因组发生整合，成为宿主遗传物质的一部分，目的基因表达产物起到对疾病的治疗作用，随着基因治疗基础研究的发展，治疗研究的技术不断增加，不仅可以将外源性正常基因导入到病变细胞中，替代或与缺陷基因共存，产生正常基因表达产物以补充缺失的或失去正常功能的蛋白质，而且可以采用适当的技术抑制细胞内过盛表达的基因，达到治疗疾病的目的。

2.基因治疗研究的主要内容或策略：

（一）基因标记：基因标记（gene labeling)实验是基因治疗的前奏。标记假定对患者有治疗作用的细胞，用标记实验验证两个问题：

（1）外源基因能否安全地转移到患者体内（2）从患者体内取出的细胞能否检测到转移基因的存在。接受标记实验的患者不一定直接获得治疗效果，其主要目的是得到进一步临床基因治疗有用的信息。

●目前常用的基因标记方法是将neo基因的重组逆转录病毒载体在体外转染细胞，然

后输入体内，可以很方便地跟踪这种标记细胞的命运。

●（二）基因置换：所谓基因置换（gene replacement)是指将特定的目的基因导入特定

的细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因

●基因置换的目的是纠正缺陷基因，将缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因的

缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。

●基因置换的必要条件是：

①对导入的基因及其产物有详尽的了解

②外来基因能有效地导入靶细胞；

③导入基因能在靶细胞中长期稳定驻留；

④导入基因能有适度水平的表达；

⑤基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害。

●应用基因打靶技术，在基因置换的实验研究中已取得了一些进展。

（三）基因添加：基因添加或称基因增补（geng augmentation)是通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。

●基因添加有两种类型：一是针对特定的缺陷基因导入其相应的正常基因，使导入的

正常基因整合到基因组中，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入的正常基因表达产物，从而补偿缺陷基因的功能；二是向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的；

（四）基因干预：基因干预（geneinterference)是指采用特定的方式来抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。

3.基因转移技术和靶细胞

（1）基因治疗的方式：

有两种。第一种是体内直接转移基因，称为体内法，这是最有前途的方式，也是各种基因转移技术集中攻关的方向。但目前仍存在转移和表达效率低等困难。现已在腹腔、静脉、肝、肌肉、气管、乳腺及脑等多种组织器官获得成功。第二种是细胞介导的基因

治疗，称为回体法，即先将合适的靶细胞在体外进行扩增，将外源基因导入细胞内使其能高效表达，然后再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内，使外源基因在体内表达，从而达到治疗目的。

这是目前最常用的方式，所使用的靶细胞既有细胞株也有原代细胞。

●无论采用何种方式，基因治疗都必须通过适当的基因转移（gene transfer)技术将外源

基因转移至特定细胞内。

（2）基因转移的生物学方法：

①逆转录病毒载体：逆转录病毒载体是基因治疗中最常用的载体。常用的逆转录病毒载

体是从小鼠白血病（Mo-MLV)的前病毒（DNA）制备的。

逆转录病毒载体要通过将外源性基因插入逆转录病毒载体后，所得到的是DNA，必须将其转变成假病毒，才能高效感染靶细胞，用于基因治疗，制备假病毒的过程是在包装细胞中完成的。

●包装细胞：包装细胞（pakaging cell)系是将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆

转录病毒（辅助病毒）导入哺乳动物细胞而制备成的一种特殊细胞系，这种细胞因携带与逆转录病毒基因组而能够大量产生病毒包转蛋白。

●将逆转录病毒载体（DNA）导入包装细胞后，插入基因组。

●逆转录病毒的特点：逆转录病毒载体转变成假病毒颗粒后，假病毒颗粒中所包含的

RNA与逆转录病毒基因组的结构相似，实际上只是以目的基因和标记基因取代了病毒的结构基因。感染靶细胞的过程与普通逆转录病毒一样。RNA 进入靶细胞后，通过逆转录过程转变成前病毒DNA并整合到宿主细胞的染色体DNA上，从而使目的基因成为宿主细胞染色体DNA 的一部分，靶细胞成为稳定表达目的基因的转化细胞

②腺病毒载体：腺病毒基因组为线性双链DNA，长36kb。腺病毒基因组是由非结构性

早期基因（E1-E4)、编码结构蛋白（L1-L5，IVa2)的晚期基因和RNA聚合酶Ⅲ转录子（V A）组成。每个早期基因有单独的启动子，晚期基因由单一主要晚期启动子控制,两端是含有顺式调控元件的短的反向末端重复系列（ITR),是病毒复制和包装所必须的系列。

●腺病毒载体具有以下优点：

1）宿主领域广，而人类是Ad的自然宿主；

2) Ad蛋白的表达不以宿主细胞增殖为必要条件，Ad载体不仅可以感染分裂期细胞，也

可以感染非分裂期的细胞；

3)可获得高病毒效价，其病毒滴度可达109-1011CFU/ml,适宜于临床基因治疗；

4)重组体非常稳定，未发现载体导入后重排；

5)与人类恶性肿瘤无关联，腺病毒仅能引起人呼吸道轻微炎症，不会引起肿瘤；

6)腺病毒疫苗开发研究表明，腺病毒疫苗长期应用，未见明显副作用，提示腺病毒载体

有较高的安全性；

7)Ad载体没有包膜，不易被补体所灭活，可直接体内使用；

8)Ad经受体介导进入细胞，形成内吞小体失去外衣后，病毒DNA进入核内，以附加体

形式存在，保持自身线性结构，不整合入染色体，非整合作用使其更安全。

③腺相关病毒载体

④单纯疱疹病毒载体

（2）基因转录的非生物学方法

●脂质体方法

●直接注射法

●电穿孔法