化学诱导的急性和慢性小鼠肠炎模型的构建—更新方案

化学诱导的急性和慢性小鼠肠炎模型的构建—更新方案

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炎性肠病（IBDs）如克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）的特征是慢性腹泻和腹痛。然而，随着时间的推移许多患者发生严重并发症，如组织纤维化，狭窄，瘘和结肠癌。动物模型有助于了解IBDs的免疫发病机制和新型治疗方案的设计。在这里，作者Wirtz等介绍了其在2007年发布的关于2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS），恶唑酮（oxazolone）和硫酸葡聚糖钠（DSS）诱导的急性和慢性结肠炎模型的更新实验方案。论文在线发表在《Nature Protocols》。

TNBS结肠炎。在该模型中，通过直肠内给予半抗原物质TNBS和乙醇，在易感性小鼠品系中诱导结肠炎症。乙醇是损害屏障功能，允许TNBS渗透肠壁的关键。TNBS给药导致结肠或微生物蛋白衍生蛋白的半抗原化，随后导致TNP特异性CD4 + T细胞和抗体的产生。由于该模型与高活性T细胞的增加相关，因此T细胞在TNBS结肠炎中具有关键的致病作用，该模型适用于确定发炎肠道中的CD4 + T细胞依赖性免疫。先天性免疫机制也参与TNBS结肠炎的发展。炎症过程的强度和长度在很大程度上取决于几个因素，例如小鼠的遗传背景以及当地动物设施中T细胞活化细菌菌株的存在与否。因此，每个小鼠系和每个设施中TNBS给药的个体优化是必不可少的。

恶唑酮结肠炎。恶唑酮是一种半抗原试剂，在小鼠内直肠给药后引起严重的结肠炎。远端结肠粘膜和粘膜下层的急性炎症的特征在于嗜中性粒细胞，巨噬细胞和淋巴细胞的溃疡和固有层浸润。虽然SJL / J和C57BL / 10小鼠是高度敏感的品系，但是C57BL / 6小鼠对恶唑酮结肠炎更具抗性，并且可能在直肠内给药之前需要皮下致敏步骤。该模型已被用于研究肠道炎症期间的2型和9型相关免疫应答。重要的是，较低剂量的恶唑酮也可能诱导混合的Th1 / Th2反应，在每种小鼠品系中，恶唑酮结肠炎需要单独的优化策略。

DSS结肠炎。通过饮用水将硫酸多糖DSS以口服方式给予小鼠，导致以体重减轻，血性腹泻，溃疡形成，上皮细胞丧失和嗜中性粒细胞浸润为特征的严重结肠炎。该模型已被用于探究微生物群对结肠炎发展的影响，及导致微生物群组成变化的因素（如饮食因素）。例如，有研究已经表明，缺乏炎症性蛋白质NLRP6的小鼠更容易发生DSS结肠炎。基于其简单性和重复性，剂量和治疗周期的修改允许模拟急性，复发和慢性肠炎症形式，以及分析上皮损伤时重复的组织再生和慢性伤口愈合。

实验方案设计：

图▲由TNBS，恶唑酮和DSS诱导的急性和慢性鼠结肠炎模型的最新方案

A）急性TNBS结肠炎的诱导。10–14天。

预敏化: 麻醉小鼠, 使用电动剃刀在背面肩膀之间皮肤刮1.5×1.5厘米的面积，防止动物舔该区域。舔可能潜在地诱发口服耐受。使用移液管将150μl 1％（wt / vol）TNBS 预敏化溶液施用于剃光皮肤区域。TNBS应迅速被皮肤吸收。

注意：在第8天称重小鼠。跟最初相比，这个时间点实验小鼠的体重不应该变化很大，如果小鼠体重小于初始体重的95％，则从实验组中剔除掉。

结肠内腔注射浓度：2.5％（wt / vol）TNBS，100μl。

B）慢性TNBS结肠炎的诱导。45–49天。

预敏化同A。

将100μl的0.75％（wt / vol）TNBS溶液慢慢注射到结肠的内腔中。

在第15天，对小鼠称重。如果小鼠体重小于初始体重的95％，则从实验组中剔除掉。注射100μl的1.5％（wt / vol）TNBS溶液。

在第22天，对小鼠称重。如果小鼠体重小于初始体重的90％，则从实验组中剔除掉。注射100μl的2.5％（wt / vol）TNBS溶液。

在第29天，对小鼠称重。如果小鼠体重小于初始体重的90％，则从实验组中剔除掉。注射100μl的2.5％（wt / vol）TNBS溶液。

在第36天，对小鼠称重。如果小鼠体重小于初始体重的90％，则从实验组中剔除掉。注射100μl的2.5％（wt / vol）TNBS溶液。

在第43天，对小鼠称重。如果小鼠体重小于初始体重的90％，则从实验组中剔除掉。C）急性恶唑酮结肠炎的诱导。10-14 天。

预敏化: 同前。使用移液管将150μl 3％（wt / vol）恶唑酮预敏化溶液施用于剃光皮肤区域。恶唑酮应迅速被皮肤吸收。

注意：在第8天称重小鼠。如果小鼠体重小于初始体重的95％，则从实验组中剔除掉。结肠内腔注射浓度：0.5-1％（wt / vol）恶唑酮，100μl。

D）慢性恶唑酮结肠炎的诱导。36-42 天。

预敏化同C。

在第6天，对小鼠称重。如果小鼠体重小于初始体重的95％，则从实验组中剔除掉。

将100μl 0.5％（wt / vol）恶唑酮溶液慢慢注入结肠的内腔—在第20天，称小鼠的体重—注射100μl 0.5％（wt / vol）恶唑酮溶液——在第34天，称小鼠的体重—注射100μl 0.5％（wt / vol）恶唑酮溶液。

E）急性DSS结肠炎的诱导。8-14 天。

第1天每只小鼠给予5ml DSS溶液（浓度均为2%）—在第3天，清空瓶子并测量剩余的DSS溶液—用新鲜的DSS溶液（每只小鼠每天5ml）填充瓶子—在第5天，清空瓶子并测

量剩余的DSS溶液—用新鲜的DSS溶液（每只小鼠每天5ml）填充瓶子—在第8天，清空瓶子并测量剩余的DSS溶液——用灭菌自来水填充瓶子。

F）慢性DSS结肠炎的诱导。时间 52-56 天。

同E—在第22-26天，同E—在第43-47天，同E。

G）结肠炎相关结肠直肠癌的诱导。时间52-77 天。

注射小鼠i.p.，10 mg / kg AOM溶液—同F。

具体实验步骤见文献（P5-P11）。步骤1和10-14是2007版本上的更新步骤。

虽然这些实验步骤很容易操作，但是有些因素对疾病的结果有很大的影响，如小鼠近交系的遗传异质性和动物设施的局部微生物群等。尤其是肠道微生物群体的组成差异，即使在同一动物设施中，也可能大大影响疾病预后。因此，实验中所有组的小鼠应该具有共同的来源。当比较野生型和转基因小鼠之间的结肠炎易感性时，强烈建议使用同窝出生者。此外，可通过实验小鼠的并笼饲养，平衡微生物群，来减少笼养效应（图2）。

图▲通过并笼平衡微生物群

如同人类的许多自身免疫性疾病一样，性别差异导致的结肠炎易感性是存在的，必须加以考虑。例如，在DSS结肠炎中，雄性小鼠往往比雌性小鼠更易感。不同生产批次的结肠炎诱导物质存在很大差异，因此新批次可能需要更新剂量优化。由于TNBS，DSS和恶唑酮诱导剂量依赖性肠损伤，高剂量可能导致大量死亡率（结肠炎，坏死和结肠穿孔导致）。相比之下，不足的低剂量可能导致短期，弱或甚至完全没有结肠炎活动。