反转录pcr原理

反转录pcr原理

反转录聚合酶链式反应（reverse transcriptase PCR, RT-PCR）

是一种广泛应用于分子生物学和遗传学领域中的实验技术。

反转录PCR是通过利用酶的催化作用将RNA转录成为cDNA，再对其进行PCR扩增，得到想要检测的基因或mRNA的技术。

PCR扩增过程中需要模板，而RNA不是PCR的良好模板，因此转录成cDNA可以克服RNA的不足。同时，cDNA的合成

是由反转录酶引导完成的，反转录酶还可以分解RNA的二级

结构，从而使RNA模板更容易转录成cDNA，同时反转录酶

还可以进行链延伸，从而形成单链cDNA，便于进一步的

PCR扩增。

反转录PCR的优势

1. 可以利用非常少量的RNA样本来检测目标基因或mRNA，

异常表达的RNA，例如，在肿瘤细胞或某些医学检测中，只

需要一些组织样本或血液检测样本即可。

2. 反转录过程中可以对RNA进行过滤，去除其中的DNA，而且可以对花粉孢子，原虫和肠道微生物的RNA进行转录。

3. cDNA是双链结构，可以使用两个引物同时扩增目标基因，PCR效率高，容易检测出关键的目标信息。

4. cDNA对PCR的稳定性更高，可以稳定地保存很长时间，

从而方便后续实验操作。

反转录PCR的基本步骤

1. 反转录：需要选用适当的反转录酶、引物和反转录缓冲液将RNA反转录为cDNA。

2. PCR扩增：根据目标基因的特点和反转录产物的质量，设计合适的引物，进行PCR扩增，通常采用热启动PCR反应，提高反应的特异性和积极性。

3. 产品检测：用凝胶电泳或者Real-time PCR等技术来鉴定扩增产物的数量、大小、纯度和特异性等。

可见反转录PCR技术不仅可以来检测细胞内RNA的表达，而且还可以检测病毒、细胞质RNA的表达状况，因此是目前用于发现和检测RNA的最好方法之一。

然而，反转录PCR虽然在分子生物学和遗传学研究中被广泛应用，但其有一定的不适应性，需要注意以下几个问题：

1. 只能从RNA模板转录到cDNA，不能转录其他类型的RNA 或DNA。

2. 如果遇到RNA样本太少或RNA片段太短的情况，则容易出现假阴性结果。

3. 反转录操作时间过长，可能导致RNA的分解或者降解，而

且会对反转录产物的质量产生负面影响。

4. 在PCR扩增过程中，输入量和扩增条件是否合适，以及引

物和其他试剂成分的影响，都会直接或间接地影响PCR结果。

总之，反转录PCR是一种非常重要的分子生物学技术，可以

检测RNA表达水平，尤其在病毒学、癌症诊断和 RNA统计

分析方面发挥着无以伦比的作用。然而，正如其他实验技术一样，反转录PCR技术也有其自身的局限性和缺点，需要实验

人员根据具体情况选择和应用。