丹参总酚酸及三七总皂苷配伍对缺氧复氧损伤心肌细胞的保护作用研究

丹参总酚酸及三七总皂苷配伍对缺氧复氧损伤心肌细胞的保护作用研究目的：探索丹参总酚酸及三七总皂苷配伍对心肌细胞缺氧复氧（hypoxia，reoxygenation，HR）损伤的保护作用机制。

方法：采用缺氧复氧损伤H9c2细胞模型，MTT法测定丹参总酚酸、三七总皂苷配伍对细胞活力的影响，并测定细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）漏出率，评价丹参总酚酸、三七总皂苷配伍对心肌细胞的保护作用；采用Hoechst33342荧光染色观察细胞凋亡，并用流式细胞术检测不同药物干预后心肌细胞凋亡率；采用Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl，2，Bax，Caspase，3的表达情况；定磷法检测细胞内Na+〖KG-*3〗，K+，ATPase，Ca2+，Mg2+，ATPase的变化，化学发光法检测细胞内ATP含量的变化。

结果：丹参总酚酸、三七总皂苷分别在0.05～0.5，5～50 mg·L-1配伍时对缺氧复氧损伤的心肌细胞具有浓度依赖性的协同保护作用；丹参总酚酸与三七总皂苷均能减轻缺氧复氧导致的心肌细胞的凋亡并且改善心肌细胞的能量代谢，配伍后作用更为明显。

结论：丹参总酚酸、三七总皂苷配伍具有协同增效作用，可通过抑制细胞凋亡和改善能量代谢对抗缺氧复氧对心肌细胞的损伤。

标签：丹参总酚酸；三七总皂苷；H9c2；配伍；凋亡；能量代谢复方丹参方是临床确有疗效的中药验方，其制剂在心绞痛、无症状心肌缺血、冠心病等心血管疾病的预防与治疗上效果显著[1]。

现代药理学研究表明，丹参对血管的效应强于三七，三七对缺氧心肌保护作用强于丹参，二者配伍后存在协同互补效应[2]。

本课题组在前期研究工作中采用犬结扎冠脉左前降支造成急性心肌缺血模型，研究发现丹参、三七不同比例配伍在降低心肌耗氧量、改善心肌缺血，抗心律失常，调节微循环等方面呈现不同的作用，各自存在着最佳配伍比例[3，6]。

还研究了丹酚酸B和丹参酮ⅡA不同配比对缺氧损伤心脏微血管内皮细胞的影响，表明两者配伍优于单一药物[7，8]。

丹参总酚酸是丹参的主要水溶性成分，三七总皂苷是三七的主要活性成分。

有报道表明，丹参总酚酸与三七总皂苷按一定比例配伍，可使麻醉犬心肌氧摄取率显著下降，存在协同增效作用[9]，然而二者配伍的心肌保护作用机制尚不明确。

本研究采用缺氧复氧损伤心肌细胞模型，从抗细胞凋亡以及调节能量代谢2个方面探讨丹参总酚酸、三七总皂苷及其配伍对心肌细胞的保护作用机制。

1 材料1.1 细胞株H9c2 大鼠心肌细胞株，购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 药物与试剂丹参总酚酸（TSA）由本实验室制备，三七总皂苷（PNS）由黑龙江珍宝岛药业股份有限公司提供，纯度均高于90%；高糖DMEM培养基，无糖DMEM培养基，胎牛血清，胰蛋白酶（美国Gibco公司）。

MTT，二甲基亚砜（DMSO），Hoechst33342（美国Sigma公司）。

FITC，Annexin V/PI试剂盒（美国Calbiochem公司，批号D0*******）。

乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒，超微量ATP酶测试盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为20120424，20120512）。

ATP检测试剂盒（碧云天生物技术研究所，编号S0026）。

Bax，Caspase，3抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；Bcl，2抗体（美国Santa Cruze公司）；Tublin抗体，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG，苯甲基磺酰氟（PMSF），BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所）。

RIPA裂解液（武汉博士德生物工程有限公司）。

ECL显色液（Milipore公司）。

1.3 仪器Bio，Tek ELX800酶标仪（美国Bio，Tek公司）；Infinite 200多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）；荧光显微镜（日本Olymbus公司）；BD FACSCalibur 流式细胞仪（美国BD公司）；缺氧小室，二氧化碳培养箱，超净工作台（美国Thermo公司）；DYY，6C电泳仪（北京六一仪器厂）；iBlot转膜仪（美国Invitrogen 公司）。

2 方法2.1 缺氧复氧模型的制备H9c2细胞于二氧化碳培养箱常规培养后接种至不同培养板中，用含10%FBS的DMEM培养基培养，贴壁生长24 h后弃去培养基，PBS洗2遍，换成用混合气（95%CO2+5%N2）预饱和过的无糖DMEM 培养基（不含FBS），同时将细胞转移至缺氧小室中，持续通入混合气（95%CO2+5%N2）10 min，夹紧进气管和出气管，置于二氧化碳培养箱中培养12 h，此过程为缺氧。

缺氧完毕后，换成完全培养液（高糖DMEM+10%FBS），置于二氧化碳培养箱中培养6 h。

此过程为复氧。

2.2 分组与给药将H9c2细胞分成6组，分别为：正常对照组（control）、模型组（model）、丹参总酚酸组（0.5 mg·L-1）、三七总皂苷组（50 mg·L-1）、配伍低剂量组（丹参总酚酸0.25 mg·L-1+三七总皂苷25 mg·L-1）、配伍高剂量组（丹参总酚酸0.5 mg·L-1+三七总皂苷50 mg·L-1）。

给药组按模型组方法处理，在缺氧复氧的同时给予不同的药物干预。

对照组细胞继续用含10%FBS的高糖DMEM，置于二氧化碳培养箱培养。

2.3 心肌细胞活力的测定将细胞种于96孔板中，经缺氧复氧及不同浓度的丹参总酚酸（0.05，0.10，0.25，0.5 mg·L-1）和三七总皂苷（5，10，25，50 mg·L-1）配伍干预后，吸去培养基并洗涤，再加入含0.5 g·L-1 MTT的培养液，培养箱内继续孵育4 h。

弃去上清，加入150 μL DMSO，振荡10 min，用酶标仪于550 nm处检测定吸光度。

按公式计算细胞存活相对保护率= （A处理组-A模型组）/（A正常组-A模型组）。

并依据Chou，Talalay中效原理，以CalcuSyn药效学分析软件计算协同作用指数（CI），评价联合作用效应（CI1时，为拮抗作用）[10]。

2.4 LDH漏出率的测定将细胞种于48孔板中，经缺氧复氧及不同浓度的丹参总酚酸（0.05，0.10，0.25，0.5 mg·L-1）和三七总皂苷（5，10，25，50 mg·L-1）配伍干预后，吸取每孔内的细胞培养上清液，按LDH试剂盒说明书操作，比色法检测细胞上清中LDH的活力。

按公式计算细胞LDH释放相对抑制率= （LDH 模型组-LDH处理组）/（LDH模型组-LDH正常组）。

并以CalcuSyn药效学分析软件计算协同作用指数（CI）。

2.5 荧光染色观察细胞形态学变化将细胞种于35 mm培养皿中，缺氧复氧及不同药物干预之后，吸去培养基并洗涤后，加入含5 mg·L-1 Hoechst33342的PBS，37 ℃孵育15 min，PBS洗1遍，于荧光显微镜下观察。

2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡率将细胞种于6孔板中，缺氧复氧及不同药物干预之后，采用胰酶消化收集细胞，于4 ℃，1 000×g离心5 min；去上清，细胞重悬后加入1.25 μL Annexin V，FITC荧光染料，室温避光染色15 min，再1 000×g离心5 min去除上清，细胞重悬，加入10 μL PI（避光冰上操作），充分混匀后，流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。

2.7 Western blot法检测凋亡相关蛋白表达将细胞种于6孔板中，缺氧复氧及不同药物干预之后将加入含蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解5 min。

用细胞刮刮下细胞，转移至EP管中，于4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min。

BCA法测定蛋白含量。

将蛋白样品与2×上样缓冲液按1：1混合后94 ℃充分变性10 min。

10%SDS，PAGE 胶进行蛋白电泳，转PVDF 膜之后，5%脱脂牛奶封闭，分别孵Caspase，3，Bax，Bcl，2和Tublin一抗（1：1 000），室温2 h，用TPBS洗涤，用辣根过氧化物酶标记的二抗（1：1万）室温孵育 1 h，TPBS 洗涤后，ECL显色。

2.8 检测细胞中Na+，K+，ATPase，Ca2+，Mg2+，ATPase，ATP的含量将细胞种于6孔板中，缺氧复氧及不同药物干预之后，采用胰酶消化后离心收集细胞，采用生理盐水重悬细胞，用超声粉碎机粉碎细胞后，得到细胞匀浆液，按照说明书操作，采用定磷法检测细胞内Na+，K+，ATPase，Ca2+，Mg2+，ATPase 含量。

对于ATP含量测定，需在裂解细胞后，于4 ℃，12 000×g离心10 min，取上清，用化学发光法检测细胞内ATP含量。

采用BCA法进行蛋白含量。

结果以每毫克蛋白中Na+，K+，ATPase，Ca2+，Mg2+，ATPase，ATP含量来表示。

2.9 统计学分析实验数据用±s表示，采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，组间比较采用方差分析（One Way，ANOV A），P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果3.1 丹参总酚酸和三七总皂苷及其配伍对缺氧复氧损伤H9c2细胞的保护作用根据前期细胞毒性实验结果，选择丹参总酚酸质量浓度范围为0.05～0.5 mg·L-1，三七总皂苷质量浓度范围为5～50 mg·L-1。

结果显示丹参总酚酸和三七总皂苷在此范围内对缺氧复氧损伤的H9c2心肌细胞具有剂量依赖性的保护作用，能显著改善缺氧复氧导致的细胞存活力的降低和LDH的大量释放。

软件分析结果显示，两药联用时在一定浓度范围内CI<1，且随着浓度升高CI逐步减少，表明丹参总酚酸和三七总皂苷配伍具有剂量依赖的协同效应，见图1。

A.细胞存活相对保护率的量效图；B.LDH漏出相对抑制率的量效图；C.细胞存活相对保护率的协同指数图；D.LDH漏出相对抑制率的协同指数图。

图1 丹参总酚酸和三七总皂苷配伍对缺氧复氧损伤H9c2细胞的保护作用（n=3）Fig.1 Protective effects of salvianolic acids and Panax notoginseng saponins and their combination on cardiomyocytes with hypoxia，reoxygenation injury （n=3）3.2 丹参总酚酸和三七总皂苷及其配伍对缺氧复氧损伤H9c2细胞凋亡的影响荧光染色观察H9c2细胞核变化：Hoechst33342染色结果显示，对照组细胞核形态正常，染色均匀，缺氧复氧损伤后H9c2细胞核皱缩变形，部分细胞呈现致密浓染，高度凝聚。