干细胞基础与临床应用基础研究

（三）基本步骤
取材 ：目的明确、取材准确、避免过多的损失和损伤。 分离: 制作细胞悬液。 纯化： 提高目的细胞富集度。 原代培养：目的细胞在体外条件下的生长、扩增。 传代培养：进一步扩增、纯化。 鉴定：定质、定量。 冻存与复苏：保存 连续传代培养
一、取材
1
取材是整个实验的重要步骤之一，决定 了后续实验步骤的效率。
理化条件的模拟
温度： 液体渗透压： 氧与酸碱度： 细胞之间的相互关系： 培养基的选择
一、水
细胞及机体内环境～溶解或分散状态离子 和/或分子的水溶液（化学基础） 水的重要性质： 1. 惰性～大多数物质溶于水而不发生化学 反应。 2. 热稳定性和导热性。 3. 表面张力等等：表面张力是维持细胞形 态的重要条件。
二、无机盐

存在形式：离子状态为主
质）
结合（蛋白质或脂
形成与维持培养液的晶体渗透压 对细胞功能活动的支持作用 细胞和组织类型不同，对无机盐的要求也 不同 实验目的不同，对培养基中无机盐的要求 也不同 实验步骤的目的不同，对培养基中无机盐 的要求也不同
Hale Waihona Puke 、理化条件1温度：35～37 ℃ 细胞对低温耐受能力强过高温 1、应该对实验有全过程的考虑 2、高温的结果是一样的 3、低温条件下细胞活动减缓至停止 4、对低温的耐受能力与细胞类型、个体年龄等因素有关 5、低温的危害与细胞内外冰晶形成的不均衡有关，故降 温应该是缓慢的，避免冰晶形成；复温应该是快速的。 液体渗透压：正常血浆 280～310 mOsm/kg； （主要由晶体渗透压构成 胶体渗透压〈1.5 mOsm/kg） 酸碱度： 7.36 ～ 7.44 耐受范围 6.0～8.0；
三、理化条件
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细胞之间的相互关系： 1、从组织水平的认识 细胞是结构和功能 的基本单位，而组织是细胞的存在形式。 2、从细胞水平的认识 a.直接接触型；膜表面分子结合 b.直接联系型；胞间间隙连接 c.间接联系型；生物因子传递
三、理化条件
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生长基质（Ground substance）：
大多数机体内的细胞不是生活在液态环 境中的，体外培养环境下表现为贴壁、附 壁生长，培养器皿的表面不适合细胞的这 一特性，必需包被某些物质，以帮助细胞 贴壁、附壁生长。
细胞密度和介质密度差 / 介质黏度
优点：无需对细胞进行复杂的（化学、生物 学等）处理，避免了细胞发生变化， 对细胞的活力影响较少。 关键：1、密度梯度形成介质的选择。 2、密度梯度的配置。
基于物理性状的分离纯化技术 2
介质选择的原则： 1、密度范围大 包括所需要的密度。 2、溶液的黏度低 较小离心力和较短离心 时间可达 到分离效果 3、易于测定其密度（浓度）。 4、不损伤细胞、不改变细胞生物学特性。 5、离心分离后易于除去。 6、不妨碍、不影响后续实验研究的目的。
二、分离与纯化 1
分离与纯化在概念上没有明确的区别，也不是一个 单一的、独立的步骤，往往贯穿在整个细胞培养 的过程之中。 分离与纯化是衡量细胞培养成功与否的重要标志； 也是建立细胞系（细胞株）的前提。 1、细胞分离（Separation）：从组织材料、细胞悬 液中获取目的细胞。 2、细胞纯化（Purification）：从异质性的混合 物中获得单一类型细胞。 3、富集（Enrichment）：分离纯化后，目的细胞数 量所达到的比例。
殖的细胞，如神经细胞）不受有丝分裂抑制剂的 影响，可分裂细胞明显受其抑制 逐渐消亡。
常用抑制剂：
阿糖胞苷（Ara-C）、氟尿嘧啶（FU）
三、原代培养
1
原代培养的概念： 1、是指“初次培养”的含义，没有培养物的分割。 2、“代”只是分割的记录与记数形式，与细胞分 裂增殖的“代”不同。 3、植块培养也可以分割，故也可以进行传代培养 4、更换培养液、更换培养器皿，仍是原代培养。
三、原代培养
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基本目的： 1、维持目的细胞在体外条件下生存一段 时间,适应体外培养的新环境。 2、更接近原来的组织形式，有利于目的 细胞适应体外培养的新环境。 3、使目的细胞在体外条件下稳定生长、 扩增，形成优势群体。
三、原代培养
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植块培养
植块培养目的： 1、观察组织生长行为及其规律。 2、获得向外迁移的细胞（应该有相应的松解、离散措 施）。 植块培养的优点： 保持了良好的3D组织结构、维持了细胞之间的相互作 用，细胞易于成活和生长。 植块培养的缺陷： 植块中央的物质交换受局限。适宜大小！1mm3 植块培养的关键： 1、植块的贴壁、固定。 2、培养液的添加。 3、如果是为了获得细胞，要注意植块的适时移出。
基于物理形状的分离纯化技术 4 常用介质
4、硅胶颗粒 Percoll （密度：1.13±0.005g/ml）
优点：（1）稳定性好。可长期保存。 （2）密度稀释范围大，包括了大多数细胞密度。 （3）溶液产生的渗透压小，全密度范围内维持 等张。 （4）黏度低，较小离心力和较短离心时间可达 到分离效果。 （5）易于洗涤清除，对细胞无毒性。 （6）高速离心时可形成连续密度剃度。 （10000 r/min） （7）用量少，经济。
1、多聚赖氨酸(Polylysine) 0.05 mg/ml 2、纤维连接蛋白(Fibronectin) 3、胶原 （如 鼠尾胶） 4、层粘连蛋白(Laminin) 5～10μ g/ml
四、培养基的选择
1
参考文献只能提供基本的参考，除重复性实验外，具体 的实验方案应该从多个角度来综合考虑，必要时还应该 做探索性实验。
三、原代培养
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细胞培养
优点：能在特定条件下，获得单一类型的细 胞并进行相关的研究。 关键：使细胞尽快进入分裂、增殖的生长状态。 1、促进细胞贴壁 2、适宜的细胞接种密度。 105 个/ml是常用的标准，但还应该考虑 细胞类型、生长能力、活力。 干细胞的培养会选择更低密度？
三、原代培养 5
培养空间
单个细胞存在于溶液（培养液、平衡液、缓冲液等）。
充分暴露、洗涤、剔除多余组 织。 ２、分割 1 mm 3植块植块培养 ３、分离（散）细胞 机械解离、酶消化、 鳌合剂解离。 ４、筛网过滤 ５、低速离心 500～800 r／m 5～10 min 800～1000 r／m 5～10 min ６、计数、调节细胞密度 10 5个／ml
基于物理形状的分离纯化技术 常用介质
3
1、血清白蛋白 早期常用，但黏度太高。 2、聚蔗糖（Polysucrose） 即Ficoll，实验室常见，缺点是：黏度、渗透毒性 随浓度增加而增加。使用时注意避免。 3、泛影酸盐 常用的“淋巴细胞分离液（密度：1.077±0.001g/ml）” 就是泛影酸盐和Ficoll配制而成，以避免Ficoll黏度、 渗 透毒性随浓度增加而增加的缺点。
四、培养基的选择
二、常用类型
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天然培养基：血清、胚胎渗出液、水解蛋白 合成培养基：RPMI1640、Eagle MEM系列（BME、DMEM、IMEM、
α MEM）、HamF12。
无血清培养基：化学成分确定的培养基，对实验目的 和细胞类型的针对性强。 1、基础培养液：DMEM ∶ HamF12 = 1 ∶ 1 2、附加成分： 根据实验目的、细胞类型等因素设 定。如B27、N-2，针对神经元；G-5，针对神经胶质 细胞
机械分离与酶学分离1
1、取材过程中的分离
尽可能剔除其它结构、组织。 充分冲洗，必要时可考虑添加抗生素。
2、筛网过滤
根据组织、细胞的类型，细胞大小来选择筛网的材 质、孔径大小
3、酶学分离
对同一种组织，采用不同的酶消化，细胞富集的类 型也不同。 举例：对皮肤消化 胰蛋白酶 ？ 胶原酶 ？
机械分离与酶学分离2
基于物理形状的分离纯化技术 常用方法
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1、一步密度梯度离心法
高密度介质、低速离心
依据细胞的密度和体积:
密度大于介质的在介质之下；密度小于介质的在介质之上
体积大的沉降速度快；体积小的沉降速度慢。 注意：对不同物种的细胞，分离介质的密度稍有 不同。
基于物理形状的分离纯化技术 常用方法
6
2、等密度梯度离心法 依据细胞的密度 a、连续密度梯度：
3、培养空间 构建适宜的培养体系： 培养体系由两大部分组成：液相和气相 调整培养空间的目的：保证细胞的供O2量 相关参数： （1）、液相∶气相 = 1 ∶ 10 （体积） （2）、液相高度：2～5 mm
根据其它细胞特性的分离方法1
一、反复植块培养法 原理：不同的细胞从植块中迁移出来的
时间、速度不同。
植块
第三周
雪旺细胞
第二周
成纤维细胞
第一周
成纤维细胞
优点：细胞在取材时受损伤少 缺点：纯化周期长，细胞纯度低，细胞产量低。
根据其它细胞特性的分离方法2
二、有丝分裂抑制剂法 原理：有丝分裂后细胞（不再分裂增
4、培养过程中的选择性
体外培养过程中的自然法则： a、富集多、活力强、增殖能力强的细 胞类型会表现出优势生长。 b、细胞集落可以出现区域性分布。
方法：
目的：
机械性刮除、选择性消化 清除 或 收集
基于物理性状的分离纯化技术 1
也称为密度梯度离心（Density
沉降速度=离心力 细胞体积
gradient centrifugation）技术
（一）基本概念
体内培养(In
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vivo culture) 方式：移植（Transplantation） 条件：异体相似环境 优点：最大限度模拟自然生长环境 目的：分化研究、临床治疗、特殊 目的（如珍贵细胞株污染的处理）
（二）基本条件（模拟）
营养条件的模拟
水： 无机盐： 葡萄糖： 维生素： 氨基酸： 细胞因子(Cytokine) ：未知因素

干细胞基础与应用基础研究 （一）
细胞体外培养 基本技术和策略讨论
（一）基本概念

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体外培养 (In vitro culture) 对象：细胞（特定条件下、单一细胞成份） 组织 器官 胚胎（全胚培养 Holo-embryo culture） 条件：体内生存环境的模拟 （天然优化环境～人工环境） 目的：1、建立活体结构成分在体外生存、生长的 适宜环境 2、应用
干细胞基础与应用基础研究
广西医科大学研究生选修课课程 组胚教研室 陈维平
Saturday, July 28, 2018
干细胞基础与应用基础研究
内容安排 一、理论课 1、细胞体外培养基本技术和方法讨论 2、干细胞的分离与培养 3、胚胎干细胞 4、成体（组织）干细胞 5、讨论交流 二、实验课 1、干细胞的分离、培养与观察 三、考核 内容：设计一份完整的“XX干细胞培养的基本方法（流程）” 时间：2014年1月
二、分离与纯化 2
（一）基本原理 1、根据细胞的物理特性，如密度、电荷等。 2、根据细胞的生物学特性，如贴壁紧密程度、贴壁 快慢、特异性表面标志等。 3、根据其它细胞特性 （二）基本方法 1、机械分离与酶学分离 2、基于物理性状的分离纯化技术、速度沉降法 3、根据细胞表面电荷的分离方法 4、利用细胞表面标志的分离方法 5、根据其它细胞特性的分离方法
（一）、实验的目的：
直接影响实验各环节，如培养基的选择、培 养时间的长短等等。
一、取材
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（二）、细胞及其所在组织的性质：
帮助确定分离的方法、消化酶的选择与使用等等。
（三）、操作流程的优化：
应该充分考虑保持细胞活力：操作时间短、细胞损 失和损伤少。
一、取材
一般程序：１、解剖
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细胞悬液(Cell suspension)：
一、基本概念
培养基(Nutrient medium)：多指商品，固态或粉剂，未 经溶剂溶解的状态。 培养液(Culture solution medium)：用溶剂溶解后的溶 液，一般添加有血清、抗生素、活性因子等等。 条件培养液(Conditioned medium)：经过某些细胞培养， 含有特定的（已知或未知）细胞分泌物的培养液。
密度逐渐增高的介质体系 ρ c = ρ m 时，沉降速度为零，细胞停留在密度相同 的介质区带内。
b、不连续密度梯度：
密度递减、顺序、分层分布介质体系， 时细 胞停留在 ρ m 1 〉 ρ c 〉ρ m2的界面上。
基于物理形状的分离纯化技术 常用方法
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3、速度沉降法 依据细胞的密度和体积，但以体积为主 要因素。 a、单位重力速度沉降法： 单位重力作用，低密度介质（BSA + 0.01 mol/L PBS，梯度：1.0099～1.0123 g/ml） 优点：细胞回收率高、重复性好、分离量大。 缺点：时间太长（数个小时！！！），细胞活力易 受影响。 b、低速离心速度沉降法： 5%～20% Ficoll，100 g，25 min 的条件下。