第八章 产物分离纯化 一

反复冻融法： 将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多 次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构 遭到破坏，亲水性增加，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶 液浓度变化，引起细胞突然膨胀而破裂。 适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次， 此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。
通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质
等生物大分子结合的配体，如免疫球蛋白-A蛋白；酶-辅酶；凝
集素-糖蛋白、细胞表面受体；酶、蛋白质-肝素；酶、蛋白质-活 性色素（染料）；酶、蛋白质-过渡金属离子（铜、锌等）。通 用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选 择合适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具 有结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优 点，所以在实验中得到了广泛的应用。
亲和吸附介质的配基
（1）谷胱甘肽：谷胱甘肽巯基转移酶的底物，三肽小分子化合 物，通过间隔臂连接在载体分子上。 目标蛋白：谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白 洗脱条件：还原型谷胱甘肽 载体：pGEX，pET41，pET42
离心分离 高速离心：离心力一般在数万g范围以内，主要用来去除 未破碎的细胞和细胞壁碎片等； 超速离心：离心力一般100,000 g以上，可用来去除细胞 膜碎片等高分子复合物。 附：离心力和转速的换算公式： RCF=11.18×(N/1000)2×r RCF：相对离心力，单位为重力加速度 g N：转头旋转速度（转速），用 r/min 表示 r：转头半径，为离心管中轴底部内壁到离心机转轴中心的距 离，单位为厘米（cm）
在亲和层析中，起可逆性结合的特异性物质称为配体。配体需
必须偶联与不溶性的支撑物上，这种支撑物称为载体或担体。

找与待分离蛋白专一 可逆结合的配基； 将配基与载体偶联； 配基选择性的吸附待 分离蛋白； 洗脱待分离蛋白。
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亲和配基必须具备的条件： 1、专一性识别或特异性结合（决定着产品纯度） 2、结合是可逆的，解离常数要适当（吸附和解吸的难易程度） 3、稳定性好；必须具有适当的化学基团，可用于和载体相连， 同时又不影响配基与生物分子之间的亲和力
Steric considerations & spacer arms
Small ligand (<1,000)
Risk of steric interference with binding between matrix and target molecule
Often need spacer arm
渗透休克法：即通过突然改变渗透压以使细胞发生物理性裂解
，从而释放出周质空间中的物质。 主要步骤： 将细菌放在用Tris缓冲液配制、含EDTA的20%蔗糖溶液中保温
，使其发生质壁分离，
接着快速地用4℃的0.005mol/L的MgCl2溶液稀释并降温，使细
胞外膜（细菌外膜）突然破裂并释放周质蛋白。
经离心即可从上清液中提取周质蛋白。
第八章 外源基因表达产物的分离纯化
第一节 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 第二节 不同表达形式的蛋白质的分离纯化
第三节 重组蛋白质的质量检测
概ห้องสมุดไป่ตู้述：
基因工程产物分离纯化的费用约占整个生产费用的80%-90% ，因此，这一过程理所当然应该受到高度重视。基因工程产物的 分离纯化过程与传统的发酵产物相比，具有以下特点：
理想的分离纯化介质应具有下列性质：
对目标蛋白具有较高的分离效率 对目标蛋白不会造成变性 化学性能和机械性能稳定，重复性好 价格低廉 常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Superose。
5. 纯度要求和规模
产物的用途决定了产品所要达到的纯度。体外诊断试剂允许存
在一定量的杂质，一般要求纯度在80%以上，而用作体内治疗 的产品应该有较高的纯度，一般应达到98%以上。 体外诊断试剂的纯化工艺较为简单，主要要分离去除影响蛋白 质产品保存期的蛋白水解酶类；体内诊断产品的纯化工艺要求 比较复杂：毒素、免疫原、以及其他残存的有害物质都应该分 离去除。
亲和层析
生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性地 与其中某一种分子相结合，生物分子间的这种特异性相互作用 称为亲和作用。如：抗原与抗体；激素与其受体；蛋白酶与辅 酶/底物/竞争性抑制剂；凝集素与糖蛋白等。 亲和层析是利用被分离大分子物质与特异性配体之间能可逆性
结合与解离的原理而建立的层析方法。
过滤法：过滤法分为一般介质过滤和膜过滤。进行细胞分 离采用一般介质过滤。膜过滤用于选择性分离分子量大小不一 样的蛋白质等。
细胞的破碎 对于进行分泌型表达的细胞来说，这一步可以省略。对于
非分泌型表达的细胞可采用不同的细胞破碎方法。
变性剂裂解法： 常用于破碎哺乳动物，破碎细胞条件温和，加入变性剂即可。 常用的变性剂有盐酸胍和脲。 Nonidet P-40，即乙基苯基聚乙二醇，为非离子型表面活性剂， 对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂。
样品的浓缩（分泌表达的目的蛋白）
沉淀法：
简便有效，能处理大量的样品、并除去 大量的杂蛋白。常用硫酸氨或有机溶剂 对离心后的样品进行分步沉淀。
超滤浓缩法：目前最常用的浓缩方法。不加入化学试 剂，不产生热量，不改变pH值，蛋白质 不容易变性，失活。
柱层析
柱层析用于对目的蛋白作进一步分离纯化。 基本原理：所有的层析系统都是由互不相溶的两相组成，一个 是固定相即层析介质，一个是流动相。利用混合溶液中蛋白质 分子的理化特性差异（如吸附力、分子形状大小、分子极性、 分子亲和力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在两相 中，并以不同的速度移动，最终彼此分开。 包括亲和层析、凝胶柱层析、离子交换层析、吸附层析、疏水 层析等。
第二节
1.
不同表达形式的蛋白质的分离纯化
分离纯化的一般步骤：
发酵液预处理：改善发酵液物理性质，提高固液分离的效 率；转移产物至后续处理的相中；出去部分杂质。 细胞分离：无论目的蛋白位于胞内还是胞外，都应该将细 胞与培养基分开。常用沉降法和过滤法。 沉降法：低黏度介质中的细菌，2000-3000 g，10-15min； 高黏度溶液需要更高的离心力和更长的时间。
配基的选择 根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两 类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体（general ligand）。
特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物 大分子结合的配体。抗原-单克隆抗体；激素-受体蛋白；酶-底 物、产物、抑制剂；生物素和亲和素，它们结合都具有高特异 性。配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻 找特异性配体一般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解 的生物大分子，要找到合适的特异性配体通常需要大量的实验 。

增加亲和柱的长度来提高吸附率。 配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。 理想的配基浓度为1-10 μmol/L。
间臂分子


当配基的分子量较小时，将其直接固定在载体上，会由于载 体的空间位阻，配基与生物大分子不能发生有效的亲和吸附 作用。 如果在配基与载体之间连接间隔臂，可以增大配基与载体之 间的距离，使其与生物大分子发生有效的亲和结合。
产品的需求量决定的工艺的规模。因此，在工艺设计前应对产
品的市场需求量进行调查研究，确定产量纯化的规模。
一般实验室的常规层析设备，能够得到一定量纯度较高的目的
蛋白，能满足科研的需要（如未知蛋白的测序，空间结构解析
等），但实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必合 适，如： 实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁） 实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心） 因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。
KD=10-4 M，则解离百分比约为1% 。
KD=10-6 M，则解离百分比约为0.1% 。
KD=10-8 M，则解离百分比约为0.01% 。
因此亲和层析常用的配体的解离常数在10-8-10-4 mol/L之间。
配基的浓度

对亲和势比较低的时候（KD≥10-4mol/L），增加配基浓度 有利于吸附。
且还应在夹套中连续通入冷却剂进行冷却。另外，超声波产生
的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。可以通过添加 自由基清洗剂如半胱氨酸或谷胱甘肽，或用氢气预吹细胞悬浮 液来缓和。
机械破碎法：
利用物理外力将细胞破碎，适用于细菌、酵母和植物细胞的 破碎。加入石英砂，玻璃珠，与细胞混合，然后碾磨。可事 先用液氮冻干，效果更好。 酶溶法： 利用酶降解细胞壁，从而使细胞破碎的方法。不同细胞的细 胞壁组成成分不同，需要使用不同的酶。 G+ G放线菌 酵母菌 霉菌 植物 溶菌酶 溶菌酶、EDTA 溶菌酶 β-葡聚糖酶 几丁质酶、 纤维素酶、半纤维素酶
3. 多种分离纯化技术的联合运用
在进行纯化目的蛋白时，通常要综合使用多种分离纯化技术， 一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则： 应选择不同分离纯化机理的方法联合使用 应首先选择能除去含量最多的杂质的方法 应尽量选择高效的分离方法
应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段
4. 合适分离纯化介质的选择
有很大差别，对工艺设计的影响非常大。
分泌型表达的重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应 在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理； 以包涵体形式表达的重组蛋白，应先离心回收包涵体； 以融合形式表达的重组蛋白，一般是胞内可溶性的，应 首选亲和层析进行纯化； 表达在周质空间的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理， 然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。
Spacer arm
AC ver 990326 30
but watch out for adsorption to the spacer!


加入间臂的长度要恰当，太短则效果不明显；太长则容易由 疏水性非特异吸附造成弯曲，反而降低吸附效率。 间臂的疏水性也需要考虑，应尽量减小对配基的影响。如间 臂和配基疏水性较强，则效果不明显。