第八章 产物分离纯化 一
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有很大差别,对工艺设计的影响非常大。
分泌型表达的重组蛋白,通常体积大、浓度低,因此应 在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理; 以包涵体形式表达的重组蛋白,应先离心回收包涵体; 以融合形式表达的重组蛋白,一般是胞内可溶性的,应 首选亲和层析进行纯化; 表达在周质空间的蛋白质,应用低浓度的溶菌酶处理, 然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。
第二节
1.
不同表达形式的蛋白质的分离纯化
分离纯化的一般步骤:
发酵液预处理:改善发酵液物理性质,提高固液分离的效 率;转移产物至后续处理的相中;出去部分杂质。 细胞分离:无论目的蛋白位于胞内还是胞外,都应该将细 胞与培养基分开。常用沉降法和过滤法。 沉降法:低黏度介质中的细菌,2000-3000 g,10-15min; 高黏度溶液需要更高的离心力和更长的时间。
产品的需求量决定的工艺的规模。因此,在工艺设计前应对产
品的市场需求量进行调查研究,确定产量纯化的规模。
一般实验室的常规层析设备,能够得到一定量纯度较高的目的
蛋白,能满足科研的需要(如未知蛋白的测序,空间结构解析
等),但实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必合 适,如: 实验室方法在工程上可能难以实现(超声波破细胞壁) 实验室方法在大规模生产中可能成本过高(超速离心) 因此,在很多情况下,实验室的技术路线不等于生产工艺。
Steric considerations & spacer arms
Small ligand (<1,000)
Risk of steric interference with binding between matrix and target molecule
Often need spacer arm
理想的分离纯化介质应具有下列性质:
对目标蛋白具有较高的分离效率 对目标蛋白不会造成变性 化学性能和机械性能稳定,重复性好 价格低廉 常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Superose。
5. 纯度要求和规模
产物的用途决定了产品所要达到的纯度。体外诊断试剂允许存
在一定量的杂质,一般要求纯度在80%以上,而用作体内治疗 的产品应该有较高的纯度,一般应达到98%以上。 体外诊断试剂的纯化工艺较为简单,主要要分离去除影响蛋白 质产品保存期的蛋白水解酶类;体内诊断产品的纯化工艺要求 比较复杂:毒素、免疫原、以及其他残存的有害物质都应该分 离去除。
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SDS(十二烷基磺酸钠)为阴离子表面活性剂,也可使细胞破碎。
超声波破碎法: 常用的破碎方法,在实验室和小规模生产中应用较广。适用于
细菌和酵母等,对酵母菌的效果较差。 一般杆菌比球菌易破碎,
G-细菌比G+细菌易破碎,破碎前先将细胞悬浮于一定pH值得缓
冲液中,细胞浓度一般在20%左右。
操作时会产生大量热,因而常把悬浮液预先冷却到0~5℃,并
且还应在夹套中连续通入冷却剂进行冷却。另外,超声波产生
的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。可以通过添加 自由基清洗剂如半胱氨酸或谷胱甘肽,或用氢气预吹细胞悬浮 液来缓和。
机械破碎法:
利用物理外力将细胞破碎,适用于细菌、酵母和植物细胞的 破碎。加入石英砂,玻璃珠,与细胞混合,然后碾磨。可事 先用液氮冻干,效果更好。 酶溶法: 利用酶降解细胞壁,从而使细胞破碎的方法。不同细胞的细 胞壁组成成分不同,需要使用不同的酶。 G+ G放线菌 酵母菌 霉菌 植物 溶菌酶 溶菌酶、EDTA 溶菌酶 β-葡聚糖酶 几丁质酶、 纤维素酶、半纤维素酶
KD=10-4 M,则解离百分比约为1% 。
KD=10-6 M,则解离百分比约为0.1% 。
KD=10-8 M,则解离百分比约为0.01% 。
因此亲和层析常用的配体的解离常数在10-8-10-4 mol/L之间。
配基的浓度
对亲和势比较低的时候(KD≥10-4mol/L),增加配基浓度 有利于吸附。
过滤法:过滤法分为一般介质过滤和膜过滤。进行细胞分 离采用一般介质过滤。膜过滤用于选择性分离分子量大小不一 样的蛋白质等。
细胞的破碎 对于进行分泌型表达的细胞来说,这一步可以省略。对于
非分泌型表达的细胞可采用不同的细胞破碎方法。
变性剂裂解法: 常用于破碎哺乳动物,破碎细胞条件温和,加入变性剂即可。 常用的变性剂有盐酸胍和脲。 Nonidet P-40,即乙基苯基聚乙二醇,为非离子型表面活性剂, 对疏水性物质具有很强的亲和力,能结合并溶解磷脂。
2. 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型
蛋白质分子的理化参数和生物学特征:等电点、生物特异性、 分子量、疏水性、稳定性、溶解性等对分离纯化的工艺设计有 着不同的影响和意义。 等电点处于极端区域(pI≤5 或 pI≥8)的重组蛋白应首选离 子交换法进行分离,这样很容易除去几乎所有的杂蛋白; 若重组蛋白具有特异性的配体、底物、抗体等,通常首选亲合 层析。 凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的(脱 盐;蛋白质分级分离;除去多聚体和降解产物); 疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的; 稳定性决定工艺的温度和流程的时间。
样品的浓缩(分泌表达的目的蛋白)
沉淀法:
简便有效,能处理大量的样品、并除去 大量的杂蛋白。常用硫酸氨或有机溶剂 对离心后的样品进行分步沉淀。
超滤浓缩法:目前最常用的浓缩方法。不加入化学试 剂,不产生热量,不改变pH值,蛋白质 不容易变性,失活。
柱层析
柱层析用于对目的蛋白作进一步分离纯化。 基本原理:所有的层析系统都是由互不相溶的两相组成,一个 是固定相即层析介质,一个是流动相。利用混合溶液中蛋白质 分子的理化特性差异(如吸附力、分子形状大小、分子极性、 分子亲和力、分配系数等),使各组分以不同程度分布在两相 中,并以不同的速度移动,最终彼此分开。 包括亲和层析、凝胶柱层析、离子交换层析、吸附层析、疏水 层析等。
配基的选择 根据配体对待分离物质的亲和性的不同,可以将其分为两 类:特异性配体(specific ligand)和通用性配体(general ligand)。
特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物 大分子结合的配体。抗原-单克隆抗体;激素-受体蛋白;酶-底 物、产物、抑制剂;生物素和亲和素,它们结合都具有高特异 性。配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的重要因素,但寻 找特异性配体一般是比较困难的,尤其对于一些性质不很了解 的生物大分子,要找到合适的特异性配体通常需要大量的实验 。
在亲和层析中,起可逆性结合的特异性物质称为配体。配体需
必须偶联与不溶性的支撑物上,这种支撑物称为载体或担体。
找与待分离蛋白专一 可逆结合的配基; 将配基与载体偶联; 配基选择性的吸附待 分离蛋白; 洗脱待分离蛋白。
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亲和配基必须具备的条件: 1、专一性识别或特异性结合(决定着产品纯度) 2、结合是可逆的,解离常数要适当(吸附和解吸的难易程度) 3、稳定性好;必须具有适当的化学基团,可用于和载体相连, 同时又不影响配基与生物分子之间的亲和力
亲和吸附介质的配基
(1)谷胱甘肽:谷胱甘肽巯基转移酶的底物,三肽小分子化合 物,通过间隔臂连接在载体分子上。 目标蛋白:谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白 洗脱条件:还原型谷胱甘肽 载体:pGEX,pET41,pET42
通用性配体一般是指特异性不是很强,能和某一类的蛋白质
等生物大分子结合的配体,如免疫球蛋白-A蛋白;酶-辅酶;凝
集素-糖蛋白、细胞表面受体;酶、蛋白质-肝素;酶、蛋白质-活 性色素(染料);酶、蛋白质-过渡金属离子(铜、锌等)。通 用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体,但通过选 择合适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具 有结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优 点,所以在实验中得到了广泛的应用。
Spacer arm
AC ver 990326 30
but watch out for adsorption to the spacer!
加入间臂的长度要恰当,太短则效果不明显;太长则容易由 疏水性非特异吸附造成弯曲,反而降低吸附效率。 间臂的疏水性也需要考虑,应尽量减小对配基的影响。如间 臂和配基疏水性较强,则效果不明显。
离心分离 高速离心:离心力一般在数万g范围以内,主要用来去除 未破碎的细胞和细胞壁碎片等; 超速离心:离心力一般100,000 g以上,可用来去除细胞 膜碎片等高分子复合物。 附:离心力和转速的换算公式: RCF=11.18×(N/1000)2×r RCF:相对离心力,单位为重力加速度 g N:转头旋转速度(转速),用 r/min 表示 r:转头半径,为离心管中轴底部内壁到离心机转轴中心的距 离,单位为厘米(cm)
3. 多种分离纯化技术的联合运用
在进行纯化目的蛋白时,通常要综合使用多种分离纯化技术, 一般来说,在选择分离纯化方法时应遵循下列原则: 应选择不同分离纯化机理的方法联合使用 应首先选择能除去含量最多的杂质的方法 应尽量选择高效的分离方法
应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段
4. 合适分离纯化介质的选择
第八章 外源基因表达产物的分离纯化
第一节 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 第二节 不同表达形式的蛋白质的分离纯化
第三节 重组蛋白质的质量检测
概 述:
基因工程产物分离纯化的费用约占整个生产费用的80%-90% ,因此,这一过程理所当然应该受到高度重视。基因工程产物的 分离纯化过程与传统的发酵产物相比,具有以下特点:
[A] + [B] ↔ [AB]
解离常数KD:处于平衡状态时[AB]的解离程度。 KD=[A][B]/[AB] KD越大说明解离越多,代表AB之间亲和力越弱,KD越小说 明解离越少,代表AB间亲和力越强; 根据KD,可以计算出AB发生解离的比例(百分比), 如:假设发生解离的百分比为x,则KD=x*x/1-x。
产物大多位于细胞内,提取前需要破碎细胞,增加了很多困难
; 产物浓度低,杂质多,而最后成品对纯度的要求高,故提取困 难,且回收率不高,所需要的操作步骤多,还需要用到高分辨力 的精制方法;
产物大多是大分子蛋白质,通常不稳定,遇热、极端pH值、有 机溶剂和剪切力等容易失活。
第一节
重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则
渗透休克法:即通过突然改变渗透压以使细胞发生物理性裂解
,从而释放出周质空间中的物质。 主要步骤: 将细菌放在用Tris缓冲液配制、含EDTA的20%蔗糖溶液中保温
,使其发生质壁分离,
接着快速地用4℃的0.005mol/L的MgCl2溶液稀释并降温,使细
胞外膜(细菌外膜)突然破裂并释放周质蛋白。
经离心即可从上清液中提取周质蛋白。
反复冻融法: 将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化,反复多 次而达到破壁作用。由于冷冻,一方面使细胞膜的疏水键结构 遭到破坏,亲水性增加,另一方面胞内水结晶,使细胞内外溶 液浓度变化,引起细胞突然膨胀而破裂。 适用于细胞壁较脆弱的菌体,破碎率较低,需反复多次, 此外,在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。
亲和层析
生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子,选择性地 与其中某一种分子相结合,生物分子间的这种特异性相互作用 称为亲和作用。如:抗原与抗体;激素与其受体;蛋白酶与辅 酶/底物/竞争性抑制剂;凝集素与糖蛋白等。 亲和层析是利用被分离大分子物质与特异性配体之间能可逆性
结合与解离的原理而建立的层析方法。
增加亲和柱的长度来提高吸附率。 配基浓度太高使吸附力太强,洗脱困难。 理想的配基浓度为1-10 μmol/L。
间臂分子
当配基的分子量较小时,将其直接固定在载体上,会由于载 体的空间位阻,配基与生物大分子不能发生有效的亲和吸附 作用。 如果在配基与载体之间连接间隔臂,可以增大配基与载体之 间的距离,使其与生物大分子发生有效的亲和结合。
1. 针对产物的表达形式采取不同的策略 不同的宿主具有不同的蛋白质合成、转运、后加工机制, 因此基因的表达产物常以不同的形式存在,真菌、动植物细胞 一般以分泌的形式表达,产物表达水平在每升培养基1-100 mg 之间,差别很大。大肠杆菌由于本身的特点,表达产物的形式 有包涵体、胞内可溶性表达,周质表达等多种。不同的表达形 式具有不同表达水平及完全不同的杂质,因此分离纯化的策略