分子荧光光谱分析课件
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分子荧光分析法ppt
荧光物质在特定波长光的照射下，可以发出比照射光波长更 长的荧光，通过测量荧光强度和荧光波长，可以对荧光物质 进行定性和定量分析。
发展历程
1
分子荧光分析法的发展历程可以追溯到20世纪 初，当时科学家们开始研究荧光现象。
2
在20世纪50年代，随着荧光光谱仪的发明，分 子荧光分析法得到了广泛应用。
3
近年来，随着高灵敏度检测设备和技术的发展 ，分子荧光分析法在生物、医学、环境等领域 得到了越来越广泛的应用。
全自动化设备
实现样本自动进样、分析、数据处 理和结果输出等功能。
分析方法改进
优化荧光探针
改进荧光探针的设计，提高其 灵敏度和特异性。
多元分析方法
结合多种分析技术，形成多元 分析方法，拓展分析范围。
实时动态监测
实现实时、原位监测，提高分 析的及时性和可靠性。
06
结论与展望
研究成果总结
分子荧光分析法在生物样品检测方面具有较高 的灵敏度和选择性，能够实现对多种生物分子 的同时检测。
物样品检测。
在未来，分子荧光分析法将会在更多的领域得到 应用，如生物医药、环境监测、食品安全等，为
人类的生活和健康提供更可靠的保障。
THANKS
感谢观看
研究生物分子的结构和功能 检测生物样品中的基因突变 检测药物在生物体内的代谢过程
在化学分析中的应用
研究化学反应的动力学过程 分析化学合成中的产物
检测化学试剂的纯度和杂质含量
04
分子荧光分析法的优缺点
优点
选择性强
灵敏度高
荧光分析法对某些物质的选择性较高，可以 较为准确地测定某些特定的物质，适用于复 杂基质样品的检测。
荧光分析法的仪器设备相对昂贵，实验成本较高，需 要专业的技术人员进行操作和维护。
发展历程
1
分子荧光分析法的发展历程可以追溯到20世纪 初，当时科学家们开始研究荧光现象。
2
在20世纪50年代，随着荧光光谱仪的发明，分 子荧光分析法得到了广泛应用。
3
近年来，随着高灵敏度检测设备和技术的发展 ，分子荧光分析法在生物、医学、环境等领域 得到了越来越广泛的应用。
全自动化设备
实现样本自动进样、分析、数据处 理和结果输出等功能。
分析方法改进
优化荧光探针
改进荧光探针的设计，提高其 灵敏度和特异性。
多元分析方法
结合多种分析技术，形成多元 分析方法，拓展分析范围。
实时动态监测
实现实时、原位监测，提高分 析的及时性和可靠性。
06
结论与展望
研究成果总结
分子荧光分析法在生物样品检测方面具有较高 的灵敏度和选择性，能够实现对多种生物分子 的同时检测。
物样品检测。
在未来，分子荧光分析法将会在更多的领域得到 应用，如生物医药、环境监测、食品安全等，为
人类的生活和健康提供更可靠的保障。
THANKS
感谢观看
研究生物分子的结构和功能 检测生物样品中的基因突变 检测药物在生物体内的代谢过程
在化学分析中的应用
研究化学反应的动力学过程 分析化学合成中的产物
检测化学试剂的纯度和杂质含量
04
分子荧光分析法的优缺点
优点
选择性强
灵敏度高
荧光分析法对某些物质的选择性较高，可以 较为准确地测定某些特定的物质，适用于复 杂基质样品的检测。
荧光分析法的仪器设备相对昂贵，实验成本较高，需 要专业的技术人员进行操作和维护。
第十三章-荧光分析法PPT课件
内部能量转换
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠 时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
.
6
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收 发射
第一激发单重态的最低振动能级
振动驰豫 内部能量转换
.
8
例题
1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后， 吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射 光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线
.
24
三、影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 酸度 散射光
学习目的: 提高荧光分析的灵敏度和选择性
.
25
1 溶剂对荧光的影响
萘在下列哪种溶剂中的荧光强度最强？ A 1－氯丙烷 B 1－溴丙烷 C 1－碘丙烷 D 1，2－二氯丙烷
1. 一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移， 荧光强度也增强。
OH N
C H2
芴φf 1.0
O N Mg1/2
.
21
（三）分子的刚性和共平面性
CH3
SO3Na
N
CH3 CH3
SO3NaN CH3
H CCH
H CC H
结论：在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共 平面性越强，荧光效率越大，荧光波长长移
（四）取代基效应
给电子基团 －NH2、 －OH、－OCH3、－NHR、－NR2荧 光效率提高、荧光波长长移
•
• • • •
cx
cs
.
34
二、定量分析方法
2、比例法（对照法）
Fs F0 KCs
FxF0KCx
Cx
Fx Fs
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠 时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
.
6
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收 发射
第一激发单重态的最低振动能级
振动驰豫 内部能量转换
.
8
例题
1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后， 吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射 光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线
.
24
三、影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 酸度 散射光
学习目的: 提高荧光分析的灵敏度和选择性
.
25
1 溶剂对荧光的影响
萘在下列哪种溶剂中的荧光强度最强？ A 1－氯丙烷 B 1－溴丙烷 C 1－碘丙烷 D 1，2－二氯丙烷
1. 一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移， 荧光强度也增强。
OH N
C H2
芴φf 1.0
O N Mg1/2
.
21
（三）分子的刚性和共平面性
CH3
SO3Na
N
CH3 CH3
SO3NaN CH3
H CCH
H CC H
结论：在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共 平面性越强，荧光效率越大，荧光波长长移
（四）取代基效应
给电子基团 －NH2、 －OH、－OCH3、－NHR、－NR2荧 光效率提高、荧光波长长移
•
• • • •
cx
cs
.
34
二、定量分析方法
2、比例法（对照法）
Fs F0 KCs
FxF0KCx
Cx
Fx Fs
《分子发光光谱法》课件
分子对光的吸收具有选择性，激发光谱和发射光谱是荧光物 质的基本特征。
Δ 绘制激发光谱曲线时，固定测量波长为荧光（磷光）最大发
射波长 em，改变激发波长 ex，根据所测得荧光发射强度与
激发波长的关系，可绘制激发光谱曲线。
Δ 固定激发光波长为最大激发光波长 ex，测量不同的波长所
发射的荧光（磷光）强度时，使激发波长和强度保持不变，
二、化学发光分析仪器
⒈ 分立取样式仪器
放大器
数字 显示器
记录仪
高压 稳压电源
分立取样式化学发光仪器示意图
1－反应器 2－反应池 3－恒温水箱 4－贮液管 5－滤光片 6－光电倍增管
⒉ 流动注射式仪器
V
R
D
P
流动注射式化学发光仪器示意图
R-试剂载流 S-样品 P-蠕动泵 V-进样阀 D-检测器
第十四章 分子发光光谱法
Molecular Luminescence Analysis
本章要求
⒈ 掌握分子荧光和分子磷光的基本原理； ⒉ 了解荧光光谱仪的结构； ⒊ 了解化学发光分析法的原理及应用。
分子发光法研究高能态分子释放能量回到基态时所发生的 光辐射，包括：光致发光（分子荧光和分子磷光）、化 学发光、生物发光和电化学发光等 。
14.1 分子荧光光谱法
一、分子荧光的产生
分子吸收了电磁辐射后处于激发态，激发态分子经历一个 碰撞及发射的去激发过程。
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 每个电子能级上，都存在振动、 转动能级；基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)；
激发态→基态：多种途径和方式， 速度最快、激发态寿命 最短的途径占优势。
⑴ 光源：高压汞灯和氙弧灯（最广泛的光源，可发射 200~800 nm）。
Δ 绘制激发光谱曲线时，固定测量波长为荧光（磷光）最大发
射波长 em，改变激发波长 ex，根据所测得荧光发射强度与
激发波长的关系，可绘制激发光谱曲线。
Δ 固定激发光波长为最大激发光波长 ex，测量不同的波长所
发射的荧光（磷光）强度时，使激发波长和强度保持不变，
二、化学发光分析仪器
⒈ 分立取样式仪器
放大器
数字 显示器
记录仪
高压 稳压电源
分立取样式化学发光仪器示意图
1－反应器 2－反应池 3－恒温水箱 4－贮液管 5－滤光片 6－光电倍增管
⒉ 流动注射式仪器
V
R
D
P
流动注射式化学发光仪器示意图
R-试剂载流 S-样品 P-蠕动泵 V-进样阀 D-检测器
第十四章 分子发光光谱法
Molecular Luminescence Analysis
本章要求
⒈ 掌握分子荧光和分子磷光的基本原理； ⒉ 了解荧光光谱仪的结构； ⒊ 了解化学发光分析法的原理及应用。
分子发光法研究高能态分子释放能量回到基态时所发生的 光辐射，包括：光致发光（分子荧光和分子磷光）、化 学发光、生物发光和电化学发光等 。
14.1 分子荧光光谱法
一、分子荧光的产生
分子吸收了电磁辐射后处于激发态，激发态分子经历一个 碰撞及发射的去激发过程。
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 每个电子能级上，都存在振动、 转动能级；基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)；
激发态→基态：多种途径和方式， 速度最快、激发态寿命 最短的途径占优势。
⑴ 光源：高压汞灯和氙弧灯（最广泛的光源，可发射 200~800 nm）。
分子荧光分析法优秀课件
荧光物质分子其它物质分子相互作用引起荧光强度降低的 现象
1） 碰撞猝灭：荧光分子与淬灭剂分子碰撞 2）静态猝灭：荧光分子与淬灭剂分子生成非荧 光配合物 3） 转入三重态猝灭：引入溴、碘、溶解氧 4） 发生电荷转移反应的猝灭：甲基蓝与Fe2+ 5）荧光物质自猝灭
3.2 荧光光谱仪
3.2.1 荧光光谱仪基本结构
cs
cs和cx应很接近
3.3.4 荧光分析法的应用 1 无机化合物的荧光分析 衍生化法：与荧光试剂形成荧光配合物
3.3.4 荧光分析法的应用 直接法：可测定的化合物很少 2 有机化合物的荧光分析 衍生化法：与荧光试剂形成共价化合物
待测物
试剂
丙三醇 糠醛 氨基酸 维生素A 蛋白质 肾上腺素
苯胺 蒽酮 氧化酶 无水乙醇 曙红丫 乙二胺
If f Ia
AlogIt cl
I0 It I0 1 0 cl I0 e 2 .3 cl IaI0 ItI0(1 e 2 .3 c)l
If fI0(1e2.3c)l
e 2 .3 c l1 2 .3c l( 2 .3c)2 l ( 2 .3c)3 l
2 !
3 !
当lc0.05 e2.3cl12.3cl
0.92
1
0.18
（4）取代基效应
1）给电子取代剂加强荧光 —HN2， — NHR ， —NR2， — OH， — OR ， — CN
产生 p →π共轭
化合物
苯
苯酚 苯胺 苯基氰 苯甲醚
λ
em max
(nm)
278~310
285~365
310~405
280~390
285~345
相对荧光强度
10
18
1） 碰撞猝灭：荧光分子与淬灭剂分子碰撞 2）静态猝灭：荧光分子与淬灭剂分子生成非荧 光配合物 3） 转入三重态猝灭：引入溴、碘、溶解氧 4） 发生电荷转移反应的猝灭：甲基蓝与Fe2+ 5）荧光物质自猝灭
3.2 荧光光谱仪
3.2.1 荧光光谱仪基本结构
cs
cs和cx应很接近
3.3.4 荧光分析法的应用 1 无机化合物的荧光分析 衍生化法：与荧光试剂形成荧光配合物
3.3.4 荧光分析法的应用 直接法：可测定的化合物很少 2 有机化合物的荧光分析 衍生化法：与荧光试剂形成共价化合物
待测物
试剂
丙三醇 糠醛 氨基酸 维生素A 蛋白质 肾上腺素
苯胺 蒽酮 氧化酶 无水乙醇 曙红丫 乙二胺
If f Ia
AlogIt cl
I0 It I0 1 0 cl I0 e 2 .3 cl IaI0 ItI0(1 e 2 .3 c)l
If fI0(1e2.3c)l
e 2 .3 c l1 2 .3c l( 2 .3c)2 l ( 2 .3c)3 l
2 !
3 !
当lc0.05 e2.3cl12.3cl
0.92
1
0.18
（4）取代基效应
1）给电子取代剂加强荧光 —HN2， — NHR ， —NR2， — OH， — OR ， — CN
产生 p →π共轭
化合物
苯
苯酚 苯胺 苯基氰 苯甲醚
λ
em max
(nm)
278~310
285~365
310~405
280~390
285~345
相对荧光强度
10
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分子荧光光谱法 ppt课件
分子荧光光谱法
Molecular Fluorescence Spectroscopy
ppt课件
1
荧光是指一种光致发光的冷发光现象。
当某种常温物质经某种波长的入射光 （通常是紫外线）照射，吸收光能后 进入激发态，并且立即退激发并发出 比入射光的的波长长的出射光（通常 波长在可见光波段）；而且一旦停止 入射光，发光现象也随之立即消失。 具有这种性质的出射光就被称之为荧 光。
3!
ppt课件
26
溶液浓度较低时：
F K I 0 2.303bc
当入射光的λ1 和 I0一定时 ： F=Kc
即： 在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质
的浓度成正比。 ————这是荧光法定量的基础。ppt课件 Nhomakorabea27
7.影响荧光强度的因素
（1）内部因素
自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射 转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。
40
2.激发光谱与发射光谱的关系
（1）镜像规则 荧光光谱的形状与基态中振动能级的分布有
关，而激发光谱的形状反映了第一激发态单重态 中的振动能级的分布。一般情况下，基态和第一 激发单重态中的振动能级分布是相似的，通常荧 光光谱与激发光谱大致呈镜像对称。
ppt课件
41
ppt课件
42
（2）Stokes位移 Stokes位移是指激发光谱与荧光光谱之间的波长
凡是使荧光速率常数kf增大而使其他失活过程（系 间窜越、外转换、内转换）的速率常数减小的因 素（环境因素和结构因素）都可使荧光增强。
ppt课件
24
6. 荧光强度与浓度的关系
荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度 （F）与
Molecular Fluorescence Spectroscopy
ppt课件
1
荧光是指一种光致发光的冷发光现象。
当某种常温物质经某种波长的入射光 （通常是紫外线）照射，吸收光能后 进入激发态，并且立即退激发并发出 比入射光的的波长长的出射光（通常 波长在可见光波段）；而且一旦停止 入射光，发光现象也随之立即消失。 具有这种性质的出射光就被称之为荧 光。
3!
ppt课件
26
溶液浓度较低时：
F K I 0 2.303bc
当入射光的λ1 和 I0一定时 ： F=Kc
即： 在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质
的浓度成正比。 ————这是荧光法定量的基础。ppt课件 Nhomakorabea27
7.影响荧光强度的因素
（1）内部因素
自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射 转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。
40
2.激发光谱与发射光谱的关系
（1）镜像规则 荧光光谱的形状与基态中振动能级的分布有
关，而激发光谱的形状反映了第一激发态单重态 中的振动能级的分布。一般情况下，基态和第一 激发单重态中的振动能级分布是相似的，通常荧 光光谱与激发光谱大致呈镜像对称。
ppt课件
41
ppt课件
42
（2）Stokes位移 Stokes位移是指激发光谱与荧光光谱之间的波长
凡是使荧光速率常数kf增大而使其他失活过程（系 间窜越、外转换、内转换）的速率常数减小的因 素（环境因素和结构因素）都可使荧光增强。
ppt课件
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6. 荧光强度与浓度的关系
荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度 （F）与
第10章-分子光谱分析PPT课件
产生p-共轭)，使- *跃迁能量降低，跃迁几率变大。
.
20
③红移、蓝移
吸收峰位置向长波方向的移动，叫红移。吸收峰位置 向短波方向移动，叫蓝移 ④增色效应和减色效应——波长不变 使吸收强度增加的现象称为增色效应。使吸收强度降 低的现象称为减色效应
.
21
10.1.2 分光光度计---测定吸光度
1.分光光度计的基本组成 基本结构是由五个部分组成：即光源、单色 器、吸收池、检测器和显示装置。
• 摩尔吸收系数()比较低，即吸收峰强度比较小，很少在
.
14
近紫外区观察到。
一些化合物n-*跃迁所产生吸收的数据
.
15
n-*和-*跃迁
• 吸收波长在200~700nm范围。
• 绝大多数有机分子的吸收光谱都是由n电子或电 子向*激发态跃迁产生的。
• 这两种跃迁都要求分子中存在具有轨道的不饱 和基团，这种不饱和的吸收中心称做生色基团 （简称生色团）。
.
8
吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长max
max和是定性的主要依据
吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之
一。
.
9
2. 溶液的吸收定律---朗伯-比尔定律
（1）朗伯-比尔定律
• 一束平行电磁辐射，强度为I0，穿过厚度为b、浓度为C 的透明介质溶液后，由于介质中粒子对辐射的吸收，结
主要有3个方面： 第一，非单色光引起的偏离（仪器偏差）。主要来自光的 单色性、平行性和散射性等因素造成的偏差。 第二，介质不均匀引起的偏离（比尔定律本身的局限性）， 朗伯-比尔定律主要适用于稀溶液，忽略了分子之间的相 互作用，当浓度高时，分子间作用增强会引起偏差。 第三，溶液本身的化学反应引起的偏离（化学偏离）。当 被分析的粒子发生分解、缔合或与溶剂发生反应生成一种 具有不同光谱的产物时会发生这种偏离；
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子之间碰撞，发生非辐射跃迁，使荧光强度下降。
• 荧光自熄灭： • C增大到一定程度，就会发生荧光自熄灭现象 • 荧光自吸收： • 荧光荧光波长与激发光波长重叠时，荧光被吸收
• 二、激发光谱与发射光谱
• 激发光谱:固定发射波长(λEM),一般在最大发射位置
•
做If– λEX的光谱，既不同波长激发光所
• 一、基本构造
• 1、光源
• 强度较高的氙灯或氙汞灯，要求有稳定的供电源。
• 2、单色器
•
两个，互成直角
• 3、样品池
•
四通杯
• 4、检测器
•
光电倍增管
• 二、仪器光路
光源
激发单色器
样品池 发射单色器
检测器
• 第三节 荧光光谱法的基本参数及测量
• 一、荧光强度
• 根据朗伯-比尔定律
• Ia=I0-I=I0(1-10-εbc)
示：
Ff =
发射荧光的分子数 激发态的分子数
= 发射的光子数 吸收的光子数
Φf与退激发过程的速率常数k有关
Ff =
kf
kf + k i + k ec
+ k ic
凡是使荧光速率常数kf增大而使其他退激发过程 （能系间交叉、外转换、内转换的速率常数减小的
因素都可使荧光增强。
Kf、Ki与分子结构有关，Kec、Kic与分子所处的环 境有关
• 3、内部转换 • 1）分子内过程，热退激 • 2）两个激发态重叠的能级发生内转换，因此吸
收λ1、λ 2 两种波长的光后，都产生λ’ 2 的荧光。 • 4、外转换 • 激发态分子与溶剂或其它溶质间相互作用和能量
• 转换。
• 5、能系间交叉跃迁 • 电子自旋被反转，使分子的多重性发生变化 • 6、磷光 • 从三重态最低振动能级回到基态，放出磷光。 • 二、影响荧光强度的因素 • 1、荧光效率（荧光量子产率Φ） • 物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ）表
• 光致发光（Photoluminescence）:
•
荧光和磷光是分子吸光成为激发态分子，在返
• 回基态时的发光现象.
•
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最
•
低振动能级回到基态所发出的辐射。
•
磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到
•
基态所发出的辐射。
• 分子的多重态
• 单重态 一个所有电子自旋都配对的分子的电子
• 药物分析 • 荧光分光光度计作为高效液相色谱,薄层色谱和高效毛细管
电泳等的检测器,使有效的分离手段与高灵敏度,高选择性的 测定方法结合起来,可用于测定复杂的混合物
荧光团杂化纳米二氧化硅微球
• 高荧光分子Φf 1，无荧光分子Φf 0
• 2、影响荧光强度的因素
• 1）荧光与分子结构的关系
•
a、能吸收紫外可见光，有共轭双键，分子呈刚
性、平面、多环结构，而且共轭平面越大、π电子共
轭度越大， Φf越高。
•
b、取代基的影响
•
给电子基团使Φf增强，如-NH2、-OH
•
与π电子体系相互作用小的取代基对荧光影响小
则If=ΦfI0（1-10-kbc)=φI0(1-e-2.303k=bc) 对于稀溶液，kbc=A A＜0.05
If= 2.303 φf I0 kbc
当I0一定并且浓度C很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比
If= K·C
K = 2.303 φ I0 kb)
• Cmax≈0.05/kb • 当C超过Cmax 时，If—C偏离线性 • 溶液浓度太大，荧光分子之间及荧光分子与溶剂分
•
状态。大多数有机物分子的基态是单重态。
•
当基态一对电子中的一个被激发到较高能
•
级，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于
•
单重态。
• 三重态 有两个电子的自旋不配对而平行的状态 。
•
激发三重态能量较激发单重态低。
• 一、分子退激发的过程
• 激发态分子回基态的途径很多，速度最快的途径占 优势。
• 1、振动驰豫
•
荧光物质）间接测定。
•
探测剂称为荧光探针
• 样品浓度的定量计算采用标准曲线法
四、荧光分析法的应用
• 无机物分析 无机离子中除少数例外一般不发荧光.但很多无 机离子能与一些有机试剂形成荧光络合物,而进行定量测定.
• 生物化学及生理医学方面的应用 荧光法对于生物中许多重 要的化合物具有很多的灵敏度和较好的物效性,故广用于生 物化学分析,生理医学和临床分析.
• 1）分子吸收光子后，可能被激发到激发态的各个
• 振动能级
• 2）通过碰撞（非辐射跃迁）到达同一激发态的最
• 低振动能级
•
需时间10-13—10-11sec，效率较高
• 2、荧光发射
• 分子从单重激发态的最低振动能级发射光子回到 基态——荧光发射。
• 荧光光谱的波长比吸收光的波长大（长），这种 现象叫作红移或斯托克斯位移。
•
产生荧光的相对效率。
• 发射光谱:固定激发波长(λEx),一般在最大吸收位置
•
做If– λEM的光谱，既最大吸收波长下产
•
生荧光的相对强度。
• 目的:找到λEXmax 和λEMmax
• 三、荧光分析法
• 直接荧光法：样品本身发荧光，直接测定其荧光强
•
度，按吸收定律计算样品浓度。
• 间接荧光法：样品本身不发荧光，通过探测剂（强
溶剂极性增加有时会使荧光强度增加，荧 光波长红移；若溶剂和荧光物质形成氢键或 使荧光物质电离状态改变，会使荧光强度、 荧光波长改变。
• 3）pH值的影响
• 荧光物质的电离与非电离形式的Φf有差别，带有
酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pH关；
• 4）溶解氧的影响
• 溶解氧的存在使Φf下降
• 第二节 荧光分光光度计
• 高原子序数的原子引入π电子体系，使荧光减弱 • 吸电子基团，如：-COOH 、–NO2 、–N=O2、 卤素 • 使荧光熄灭。 • 刚性平面结构有利于荧光，因为刚性结构可以
减少分子振动，减少能系交叉和碰撞退激。 • 2）温度和溶剂效应
• 温度升高， Φf下降 • 溶液黏度下降， Φf下降
• 不能使用含有重原子的溶剂
• 荧光自熄灭： • C增大到一定程度，就会发生荧光自熄灭现象 • 荧光自吸收： • 荧光荧光波长与激发光波长重叠时，荧光被吸收
• 二、激发光谱与发射光谱
• 激发光谱:固定发射波长(λEM),一般在最大发射位置
•
做If– λEX的光谱，既不同波长激发光所
• 一、基本构造
• 1、光源
• 强度较高的氙灯或氙汞灯，要求有稳定的供电源。
• 2、单色器
•
两个，互成直角
• 3、样品池
•
四通杯
• 4、检测器
•
光电倍增管
• 二、仪器光路
光源
激发单色器
样品池 发射单色器
检测器
• 第三节 荧光光谱法的基本参数及测量
• 一、荧光强度
• 根据朗伯-比尔定律
• Ia=I0-I=I0(1-10-εbc)
示：
Ff =
发射荧光的分子数 激发态的分子数
= 发射的光子数 吸收的光子数
Φf与退激发过程的速率常数k有关
Ff =
kf
kf + k i + k ec
+ k ic
凡是使荧光速率常数kf增大而使其他退激发过程 （能系间交叉、外转换、内转换的速率常数减小的
因素都可使荧光增强。
Kf、Ki与分子结构有关，Kec、Kic与分子所处的环 境有关
• 3、内部转换 • 1）分子内过程，热退激 • 2）两个激发态重叠的能级发生内转换，因此吸
收λ1、λ 2 两种波长的光后，都产生λ’ 2 的荧光。 • 4、外转换 • 激发态分子与溶剂或其它溶质间相互作用和能量
• 转换。
• 5、能系间交叉跃迁 • 电子自旋被反转，使分子的多重性发生变化 • 6、磷光 • 从三重态最低振动能级回到基态，放出磷光。 • 二、影响荧光强度的因素 • 1、荧光效率（荧光量子产率Φ） • 物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ）表
• 光致发光（Photoluminescence）:
•
荧光和磷光是分子吸光成为激发态分子，在返
• 回基态时的发光现象.
•
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最
•
低振动能级回到基态所发出的辐射。
•
磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到
•
基态所发出的辐射。
• 分子的多重态
• 单重态 一个所有电子自旋都配对的分子的电子
• 药物分析 • 荧光分光光度计作为高效液相色谱,薄层色谱和高效毛细管
电泳等的检测器,使有效的分离手段与高灵敏度,高选择性的 测定方法结合起来,可用于测定复杂的混合物
荧光团杂化纳米二氧化硅微球
• 高荧光分子Φf 1，无荧光分子Φf 0
• 2、影响荧光强度的因素
• 1）荧光与分子结构的关系
•
a、能吸收紫外可见光，有共轭双键，分子呈刚
性、平面、多环结构，而且共轭平面越大、π电子共
轭度越大， Φf越高。
•
b、取代基的影响
•
给电子基团使Φf增强，如-NH2、-OH
•
与π电子体系相互作用小的取代基对荧光影响小
则If=ΦfI0（1-10-kbc)=φI0(1-e-2.303k=bc) 对于稀溶液，kbc=A A＜0.05
If= 2.303 φf I0 kbc
当I0一定并且浓度C很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比
If= K·C
K = 2.303 φ I0 kb)
• Cmax≈0.05/kb • 当C超过Cmax 时，If—C偏离线性 • 溶液浓度太大，荧光分子之间及荧光分子与溶剂分
•
状态。大多数有机物分子的基态是单重态。
•
当基态一对电子中的一个被激发到较高能
•
级，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于
•
单重态。
• 三重态 有两个电子的自旋不配对而平行的状态 。
•
激发三重态能量较激发单重态低。
• 一、分子退激发的过程
• 激发态分子回基态的途径很多，速度最快的途径占 优势。
• 1、振动驰豫
•
荧光物质）间接测定。
•
探测剂称为荧光探针
• 样品浓度的定量计算采用标准曲线法
四、荧光分析法的应用
• 无机物分析 无机离子中除少数例外一般不发荧光.但很多无 机离子能与一些有机试剂形成荧光络合物,而进行定量测定.
• 生物化学及生理医学方面的应用 荧光法对于生物中许多重 要的化合物具有很多的灵敏度和较好的物效性,故广用于生 物化学分析,生理医学和临床分析.
• 1）分子吸收光子后，可能被激发到激发态的各个
• 振动能级
• 2）通过碰撞（非辐射跃迁）到达同一激发态的最
• 低振动能级
•
需时间10-13—10-11sec，效率较高
• 2、荧光发射
• 分子从单重激发态的最低振动能级发射光子回到 基态——荧光发射。
• 荧光光谱的波长比吸收光的波长大（长），这种 现象叫作红移或斯托克斯位移。
•
产生荧光的相对效率。
• 发射光谱:固定激发波长(λEx),一般在最大吸收位置
•
做If– λEM的光谱，既最大吸收波长下产
•
生荧光的相对强度。
• 目的:找到λEXmax 和λEMmax
• 三、荧光分析法
• 直接荧光法：样品本身发荧光，直接测定其荧光强
•
度，按吸收定律计算样品浓度。
• 间接荧光法：样品本身不发荧光，通过探测剂（强
溶剂极性增加有时会使荧光强度增加，荧 光波长红移；若溶剂和荧光物质形成氢键或 使荧光物质电离状态改变，会使荧光强度、 荧光波长改变。
• 3）pH值的影响
• 荧光物质的电离与非电离形式的Φf有差别，带有
酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pH关；
• 4）溶解氧的影响
• 溶解氧的存在使Φf下降
• 第二节 荧光分光光度计
• 高原子序数的原子引入π电子体系，使荧光减弱 • 吸电子基团，如：-COOH 、–NO2 、–N=O2、 卤素 • 使荧光熄灭。 • 刚性平面结构有利于荧光，因为刚性结构可以
减少分子振动，减少能系交叉和碰撞退激。 • 2）温度和溶剂效应
• 温度升高， Φf下降 • 溶液黏度下降， Φf下降
• 不能使用含有重原子的溶剂