分子荧光光谱分析课件

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荧光物质）间接测定。
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探测剂称为荧光探针
• 样品浓度的定量计算采用标准曲线法
四、荧光分析法的应用
• 无机物分析 无机离子中除少数例外一般不发荧光.但很多无 机离子能与一些有机试剂形成荧光络合物,而进行定量测定.
• 生物化学及生理医学方面的应用 荧光法对于生物中许多重 要的化合物具有很多的灵敏度和较好的物效性,故广用于生 物化学分析,生理医学和临床分析.
• 高荧光分子Φf 1，无荧光分子Φf 0
• 2、影响荧光强度的因素
• 1）荧光与分子结构的关系
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a、能吸收紫外可见光，有共轭双键，分子呈刚
性、平面、多环结构，而且共轭平面越大、π电子共
轭度越大， Φf越高。
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b、取代基的影响
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给电子基团使Φf增强，如-NH2、-OH
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与π电子体系相互作用小的取代基对荧光影响小
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状态。大多数有机物分子的基态是单重态。
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当基态一对电子中的一个被激发到较高能
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级，其自旋方向不会立刻改变，分子仍处于
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单重态。
• 三重态 有两个电子的自旋不配对而平行的状态 。
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激发三重态能量较激发单重态低。
• 一、分子退激发的过程
• 激发态分子回基态的途径很多，速度最快的途径占 优势。
• 1、振动驰豫
• 1）分子吸收光子后，可能被激发到激发态的各个
• 振动能级
• 2）通过碰撞（非辐射跃迁）到达同一激发态的最
• 低振动能级
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需时间10-13—10-11sec，效率较高
• 2、荧光发射
• 分子从单重激发态的最低振动能级发射光子回到 基态——荧光发射。
• 荧光光谱的波长比吸收光的波长大（长），这种 现象叫作红移或斯托克斯位移。
• 3、内部转换 • 1）分子内过程，热退激 • 2）两个激发态重叠的能级发生内转换，因此吸
收λ1、λ 2 两种波长的光后，都产生λ’ 2 的荧光。 • 4、外转换 • 激发态分子与溶剂或其它溶质间相互作用和能量
• 转换。
• 5、能系间交叉跃迁 • 电子自旋被反转，使分子的多重性发生变化 • 6、磷光 • 从三重态最低振动能级回到基态，放出磷光。 • 二、影响荧光强度的因素 • 1、荧光效率（荧光量子产率Φ） • 物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ）表
• 光致发光（Photoluminescence）:
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荧光和磷光是分子吸光成为激发态分子，在返
• 回基态时的发光现象.
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荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最
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低振动能级回到基态所发出的辐射。
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磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到
•
基态所发出的辐射。
• 分子的多重态
• 单重态 一个所有电子自旋都配对的分子的电子
• 药物分析 • 荧光分光光度计作为高效液相色谱,薄层色谱和高效毛细管
电泳等的检测器,使有效的分离手段与高灵敏度,高选择性的 测定方法结合起来,可用于测定复杂的混合物
荧光团杂化纳米二氧化硅微球
溶剂极性增加有时会使荧光强度增加，荧 光波长红移；若溶剂和荧光物质形成氢键或 使荧光物质电离状态改变，会使荧光强度、 荧光波长改变。
• 3）pH值的影响
• 荧光物质的电离与非电离形式的Φf有差别，带有
酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pH关；
• 4）溶解氧的影响
• 溶解氧的存在使Φf下降
• 第二节 荧光分光光度计
• 高原子序数的原子引入π电子体系，使荧光减弱 • 吸电子基团，如：-COOH 、–NO2 、–N=O2、 卤素 • 使荧光熄灭。 • 刚性平面结构有利于荧光，因为刚性结构可以
减少分子振动，减少能系交叉和碰撞退激。 • 2）温度和溶剂效应
• 温度升高， Φf下降 • 溶液黏度下降， Φf下降
• 不能使用含有重原子的溶剂
示：
Ff =
发射荧光的分子数 激发态的分子数
= 发射的光子数 吸收的光子数
Φf与退激发过程的速率常数k有关
Ff =
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱkf
kf + k i + k ec
+ k ic
凡是使荧光速率常数kf增大而使其他退激发过程 （能系间交叉、外转换、内转换的速率常数减小的
因素都可使荧光增强。
Kf、Ki与分子结构有关，Kec、Kic与分子所处的环 境有关
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产生荧光的相对效率。
• 发射光谱:固定激发波长(λEx),一般在最大吸收位置
•
做If– λEM的光谱，既最大吸收波长下产
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生荧光的相对强度。
• 目的:找到λEXmax 和λEMmax
• 三、荧光分析法
• 直接荧光法：样品本身发荧光，直接测定其荧光强
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度，按吸收定律计算样品浓度。
• 间接荧光法：样品本身不发荧光，通过探测剂（强
• 一、基本构造
• 1、光源
• 强度较高的氙灯或氙汞灯，要求有稳定的供电源。
• 2、单色器
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两个，互成直角
• 3、样品池
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四通杯
• 4、检测器
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光电倍增管
• 二、仪器光路
光源
激发单色器
样品池 发射单色器
检测器
• 第三节 荧光光谱法的基本参数及测量
• 一、荧光强度
• 根据朗伯-比尔定律
• Ia=I0-I=I0(1-10-εbc)
则If=ΦfI0（1-10-kbc)=φI0(1-e-2.303k=bc) 对于稀溶液，kbc=A A＜0.05
If= 2.303 φf I0 kbc
当I0一定并且浓度C很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比
If= K·C
K = 2.303 φ I0 kb)
• Cmax≈0.05/kb • 当C超过Cmax 时，If—C偏离线性 • 溶液浓度太大，荧光分子之间及荧光分子与溶剂分
子之间碰撞，发生非辐射跃迁，使荧光强度下降。
• 荧光自熄灭： • C增大到一定程度，就会发生荧光自熄灭现象 • 荧光自吸收： • 荧光荧光波长与激发光波长重叠时，荧光被吸收
• 二、激发光谱与发射光谱
• 激发光谱:固定发射波长(λEM),一般在最大发射位置
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做If– λEX的光谱，既不同波长激发光所