pcr和real-pcr检测技术及方法

One Step和Two Step RT-PCR的选择
One Step和Two Step RT-PCR的选择
Two-Step
RT-PCR
• 高扩增效率 • cDNA使用更加灵活 • 更多RT Primer选择 • PCR扩增失败时便于分析
原因 • 检测多种目的基因 • 半定量RT-PCR
One-Step
2. 引物的GC%含量：一般为40%-60%。上下游引物的GC含量不能相差太大。 3. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，
否则容易导致错配。 4. 引物3’端的末位碱基避开密码子的第3位，且最好不选择A 5. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 6. 引物无回文对称结构，否则会形成发夹结构；
成功的荧光定量PCR数据
理想的荧光物质的特点
✓ 本底低 ✓ 荧光强度高 ✓ 每轮PCR反应完成后都有荧光强度的增高，而且这
种荧光强度的增高和每轮循环后的PCR产物的量成 线性关系 ✓ 没有PCR产物，没有荧光 ✓ 该荧光物质的受激发后其发射光的波长范围窄， 各种荧光不会产生荧光的交叉干扰
荧光定量PCR化学原理
琼脂糖电泳原理
琼脂糖凝胶电泳步骤
配胶
点样
电泳
胶图分析
成像拍照
配胶
✓ 按所要分离的DNA分子的大小，称取适量的琼脂糖粉末 ，放入锥形瓶，加入适量0.5×TBE电泳缓冲液
✓ 置微波炉内加热摇匀至完全溶化呈透明状，适当冷却后 ，加入核酸染料（例EB或其他替代产品），混匀后，倒 入胶托模具内
✓ 待胶完全冷凝后放入电泳槽，电泳槽内的缓冲液没过胶 面
SYBR Green I：是一种能结合于所有dsDNA双螺旋小 沟区域具有绿色激发波长的染料。
TaqMan探针为一段寡核苷酸 5’端标记一个报告基团（Reporter） 3’端标记一个淬灭基团（Quencher）
SYBR Green数量关系
每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料 结合上去
染料一结合，就产生荧光信号 信号强度与DNA分子总数目成正比
引物自身不能配对，否则易形成约两个引物长度的引物二聚体；
引物二聚体
发夹结构
Primer Premier 5.0
PCR体系配置
引物合成稀释
➢ 冻干粉末，开启前10000rpm离心5min
成分
➢ 小心开盖，防止粉末喷出
➢ 储存液配置：用Rnase Free Water溶解， 加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时 为100pmol/μl，即100μM（例如：合成 9.5nmol，则加水量为10×9.5=95μL）
SYBR Green I 作用机理
SYBR Green I染料法-融解曲线
✓ 溶解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。 ✓ 扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生溶解
曲线，随着反应中双链DNA变性，荧光染料又回复到游离状态导致荧光信号 降低，用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图 ✓ 扩增产物的溶解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50％的温度），用这 个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不 同的温度溶解.
点样
根据样品的不同有两种点样体系： ✓ 样品+6×loading buffer ✓ 样品直接点样（如SSP） ✓ 最后记得点marker，并摆正胶的位置
电泳
✓ 点完样后连接电源，设置好电源的参数，开始电泳，当 溴芬兰的条带（蓝色）移动到一定长度后即可停止电泳
✓ 一般恒电压60-100V，电泳20-40min即可
RT-PCR
• 操作简便 • 有效降低污染 • 特异性RT Primer • 特异性和灵敏高 • 大量样品分析 • 定性
Real Time PCR引物设计
Real Time PCR引物设计原则
Real Time PCR探针设计原则
Real Time PCR的用途
绝对定量的定义
绝对定量分析要素
PCR和Real-Time PCR检测 技术及方法
常规wk.baidu.com酸检测技术
PCR Real-time PCR
PCR实验原理
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特 定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的 体外扩增法。
PCR不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷 酸序列分析，还可以用于突变体和重组体 的构建，基因表达调控的研究，基因多态 性的分析
Dye Fluorescein FAM SYBR Green I JOE VIC Cy3 TAMRA ROX Texas Red Cy5
Excitation maximum (nm) 490 494 494 520 538 552 560 587 596 643
Emission maximum (nm) 513 518 521 548 552 570 582 607 615 667
相对定量分析-双标曲线法
相对定量分析-双标曲线法
相对定量分析-
相对定量分析-
RealTime PCR体系配置
度得以测量。
基线
阀值
Ct值 [DNA]0
什么是Ct值？
✓ 扩增产物荧光信号达到设定阀值时经过的扩增循 环次数，或从基线到指数增长的拐点所对应的循 环次数
基线 阀值 Ct值
为什么Ct值∝ [DNA]0？
理想PCR反应：N=N0×
[DNA]0
为什么Ct值∝ [DNA]0？
标准曲线：Ct值对[DNA]0作图
10×buffer dNTP （10mM each） MgCl2 （2.5mM）
➢ 使用浓度配置：普通PCR引物溶度为20μM， Primer-F（20μM）
将100μM的储存液5倍稀释即可
Primei-R（20μM）
20 μ l体系 ➢ 根据说明书依次配置，如右图 ➢ PCR反应组分在在冰上配置 ➢ 设置阳参和阴参
实时定量PCR技术：
实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起 始模板进行定量。
荧光定量PCR数学原理
基线
阀值
Ct值 [DNA]0
实时定量与终点定量
起始DNA量是“天然”的量，更具有意义；终点DNA量是经过PCR“加工”的 量，存在部分“失真”
起点定量重复性好，终点定量误差大
扩增曲线“四个阶段”
成像拍照及胶图分析
PCR常见问题
无扩增产物
✓ 模板:含有抑制物，含量低 ✓ Buffer对样品不合适 ✓ 引物设计不当或者发生降解 ✓ 退火温度太高
PCR常见问题
非特异性扩增
✓ 引物特异性差 ✓ 模板或引物浓度过高 ✓ Mg2+浓度过高 ✓ 酶量过多 ✓ 退火温度偏低 ✓ 循环次数过多
PCR常见问题
核酸提取试 剂盒
国家/项目 标准
文献报道
PCR kit
设计合成
Taq酶 dNTP 缓冲液 Mg离子
特异性引物
国家/项目标准 文献报道
设计合成
引物设计
1. 引物的长度：配对引物的长度一般在15-30bp之间比较合适。
➢ 尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过 5℃） ➢ Tm值的计算：一般的公式：Tm = 4 (G+C) + 2(A+T)
PCR实验原理
以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与 模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片 段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半 保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成 新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的 DNA片段得到扩增。
正义链
反义链
模板DNA变性
PCR反应原理
1X
35X
1X
94ºC 5 min
数量关系
每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个单位信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
TaqMan法优缺点
优点
• 对目标序列的高度特异 性
• 阴性结果确定 • 引物设计相对简单 • 重复性比较好
缺点
• 只适合一个特定的目标 • 委托公司标记，价格较
高
Real-Time PCR使用的染料
94ºC 30 sec
55ºC 30 sec
72ºC 1 min
扩增 退火
变性
4ºC
∞ hold
PCR工作原理
变性
退火 Cycle 1
延伸
Cycle 2 Cycle 3 Cycle n
236 = 68,719,476,736 copies in ~ 2 hrs
PCR反应体系组成
模板DNA 特异性引物
X ul 0.16ul 0.16ul 补足至18 ul
2. 在核酸加样区加入 2ul模板
在扩增区进行扩增，逆转录（若模板为cDNA则进入PCR反应程序），变 性温度和时间与试剂盒说明一致，条件
巢式PCR-鼻病毒检测
巢式PCR优缺点
巢式PCR的常见问题及解决方案
扩增污染
✓ 发生:主要集中在第二步扩增 ✓ 解决：在第一步完成后，离心产物，小心吸取第一步产物
应用类似巢式PCR的原理，进行目的片段的扩增。 ✓ 低表达基因检测
巢式PCR工作原理
巢式PCR-鼻病毒检测
引物序列及扩增片段
引物
序列(5’-3’)
扩增基因
目标片 段长度
RT-PCR
RV-F1
CTCCGGCCCCTGAATRYGGCTAA
RV-R1
TCIGGIARYTTCCASYACCAICC
Nested PCR
✓ 各种试剂先进行分装，低温贮存。 ✓ 设置阳性和阴性对照，重复实验
巢式PCR
✓ 巢式PCR：嵌套式PCR，nest-PCR ✓ 巢式PCR是一种变异的PCR，使用2对（非1对）PCR引物
扩增完整的目的基因片段 巢式PCR的应用： ✓ 病毒检测：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等 ✓ 测序反应：Illumina公司平台的第二代高通量测序中，也
绝对定量质粒标准品的制备
质粒标准品稀释方法与拷贝数计算
绝对定量实验例子-血液中的HBV的绝对定量
绝对定量实验例子-血液中的HBV的绝对定量
绝对定量实验例子-血液中的HBV的绝对定量
绝对定量实验例子-血液中的HBV的绝对定量
相对定量的必要性
相对定量分析方法
相对定量分析要素
相对定量分析-管家基因的筛选
，并在另一封闭空间加样
巢式PCR的引物设计
✓ 外侧引物比内侧引物Tm值低4℃以上 ✓ 外侧引物比内侧引物相距大于6bp以上
实时荧光定量PCR定义
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光 信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对 起始模板进行定量分析的方法
与普通PCR的区别
普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。
RV-F2 RV-R2
ACCRASTACTTTGGGTRWCCGTG CTGTGTTGAWACYTGAGCICCCA
5’NCR-VP4/VP2 110bp
巢式PCR-鼻病毒检测
第一轮(RT)-PCR
1.在配液室配制反应体系
体系组成 扩增的酶和buffer等 RV-F1 50umol/L RV-R1 50umol/L RNase Free Water
拖尾
✓ 模板不纯或降解 ✓ Buffer不合适 ✓ 退火温度偏低 ✓ 酶量过多 ✓ dNTP、Mg2+浓度偏高 ✓ 循环次数过多
PCR常见问题
假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)
交叉污染 对策
✓ 操作时防止将靶序列吸入加样枪内或 溅出离心管外；
✓ 除不能耐高温的物质外，所有试剂器 材均高压消毒。离心管及枪头等一次 性使用。
基线
阀值
Ct值 [DNA]0
什么是基线？
基线就是扩增曲线中的水平部分,基线（空白）信号的产生是由于测 量的偶然误差引起的。
基线 阀值 Ct值 [DNA]0
什么是阀值？ ✓ 阀值=基线（背景）信号标准偏差×10. ✓ 由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阀值的概率
小于10-5 ✓ 当信号大于阀值时，可以肯定是由于PCR的扩增使得荧光强
Taq（5U/μl） 纯水 DNA 总体积
体积（μl）
2 1.6 1.2 1 1 0.2 12 1ng 20
PCR反应条件和电泳
反应条件：（约耗时1小时48分钟）
94℃5 ′
94℃ 30″ 55℃ 30″ 72℃ 1′ 35 Cycle
72 ℃ 5′
4℃
加样和电泳
1.5%琼脂糖凝胶加样
电压为100V，电泳1小时
SYBR Green I染料法-融解曲线
SYBR Green法优缺点
优点
• 对DNA模板没有选择性 • 使用方便 • 不必设计复杂探针 • 非常灵敏 • 便宜
缺点
• 容易与非特异性双链DNA 结合，产生假阳性。
• 对引物特异性要求较高 • 灵敏度相对较低
TaqMan探针的FRET
TaqMan作用机理