氨基酸的鉴定

氨基酸的鉴定——纸层析法

171850044钱诗晨

一、实验目的

掌握纸层析法的基本原理。

通过对氨基酸的分离，掌握纸层析的操作方法并不学会分析未知样品中的氨基酸组分

二、实验原理

1、层析法又称色谱法（Chromatography），是一种物理的分离方法。利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，并使各组分以不同速度移动，从而得到有效的分离。操作方式:纸层析、薄层层析、柱层析等。

分离机理:分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等。

2、纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，展层溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，在滤纸上水就被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。当有机溶剂（流动相）沿纸流动经过层析点时，层析点上溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。

物质被分离后在纸层析图谱上的移动速率用Rf值来表示：

在一定条件下，物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。

本实验利用纸层析法分离氨基酸，利用茚三酮反应将氨基酸层析点显色来鉴定氨基酸的种类。

三、实验试剂

1.酸性展层剂——正丁醇:88%甲酸:水=15:3:2

2.显色储备液：0.4mol/L茚三酮-异丙醇:甲酸:水=20:1:5

3.标准氨基酸溶液（6mg/ml，苯丙氨酸Phe、甘氨酸Gly、脯氨酸Pro、组氨酸His）

4.未知样品液：上述4种氨基酸中的一种或几种混合液（每组任选一个样品）

四、实验器材

1、滤纸

2、烧杯

3、剪刀

4、毛细管

5、层析缸

6、微量注射器

7、电吹风

8、保鲜膜

五、实验操作

（一）点样

1、量取30ml 层析溶剂、1ml 显色贮备液于层析缸中，混匀密闭，静置。

注：展层缸洗净后应除去多余的水，否则会影响展层溶剂的比例而影响展层

2、戴好手套，在桌上铺好一层保鲜膜。取一张干净滤纸，将其剪裁为18cm×14cm 左右。在纸的一端距边缘2cm 处用铅笔轻轻划一条直线，在此直线上等距离分出几个点作为点样原点。（点样操作时应戴手套，防止样品及滤纸受污染）

3、用毛细管将标准氨基酸及未知样品分别点在点样点上，每次点样后用电吹风冷风吹干再点下一次，点样点直径不超过

5mm。

（二）层析与显色

1、将滤纸卷成圆柱形，用针线缝合或钉书针固定成圆筒状，纸的两边不能接触。

2、将滤纸竖直放入盛有展层剂的层析缸中，迅速盖紧层析缸盖(点样点的一端在下，展层剂液面需低于点样线1cm 左右。

3、待溶剂前沿线距滤纸末端1~2cm (展层长度10cm，约2hr)时，取出滤纸(需带上手套)

4、用铅笔将前沿线作一标记。剪去缝合线，电吹风热风吹干(通风橱中进行)，即可见层析斑点。

5、用铅笔将层析图谱上的斑点圈出，分别测量点样点到层析点中心和点样点到溶剂前沿的距离。计算各种标准氨基酸的Rf 值，并根据样品分离的情况鉴定混合样品中氨基酸的组分。

六、结果处理

用铅笔将层析图谱上的斑点圈出，分别测量点样点到层析点中心和点样点到溶剂前沿的距离。计算各种标准氨基酸的R f 值，并根据样品分离的情况鉴定混合样品中氨基酸的组分。

点样点1-His2-Gly3-Pro4-Phe5-A026-A32

距离/cm

1.15 1.85 4.05 5.15 1.85/3.95/5.750.95/3.85/5.80点样点到层析

点中心

点样点到溶剂

7.15 6.45 4.25 3.15 6.45/4.35/2.557.35/4.45/2.5

前沿

Rf(His)=1.15/8.30=0.138

Rf(Gly)=1.85/8.30=0.223

Rf(Pro)=4.05/8.30=0.488

Rf(Phe)=5.15/8.30=0.620

样品：

A02:上：5.75/8.30=0.692；中：3.95/8.30=0.476；下：5.75/8.30=0.693；预估样品中含有Gly,Pro,Phe

A32:上：5.80/8.30=0.698；中：3.85/8.30=0.464：下：5.80/8.30=0.699；预估样品中含有His,Pro,Phe

六、误差分析

1、部分样品点样不足，显色不明显。

2、点样时吹风机鼓风温度较高，氨基酸浓度发生变化。

3、滤纸边缘不齐，影响氨基酸扩散速度。

4、显色时，热风温度不够，显色不明显。

5、测量不精确，扩散距离存在误差。

6、划圈的时候没有点在中心，导致样品中一些氨基酸的Rf与标准氨基酸不一样

七、注意事项

1.严格控制点样位置以及点样直径，防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，同时点样点应高于展层剂液面。

2.点样时宜采用冷风吹干。

3.展层剂需临用时配制，以免发生酯化而影响层析结果。展层剂比例应保持不变，因此展层缸应保持干燥。

4.若样品中溶质种类较多，且某些溶质在一种溶剂系统中的Rf值十分接近时，单向层析分离效果不佳，可采用双向层析。