甲烷细菌与沼气发酵

甲烷细菌与沼气发酵

在自然界中的湖泊、池塘、河流、沼泽地，常常看到有许多气泡从底部淤泥中冒出水面，如果把这些气体收集起来可以点燃，这种气体称沼气。因为沼气最早从沼泽地发现而得名。

沼气是宝贵的生物能源，可以人为产生，对解决能源和环境保护有突出重要意义。沼气是多种气体的混合气体，包括甲烷占60％～70％，CO2占30%～35%，H2S、N2、H2和NH3这些气体含量微小，约占沼气的5％左右。在沼气中CH4含量50％以上就可燃烧。沼气是来自有机物质的分解，但有机物质的分解不一定都能产生沼气。沼气是在特定的厌氧条件，同时又不存在硝酸盐、硫酸盐和日光的环境中形成的。形成沼气的过程叫沼气发酵。在沼气发酵过程中二氧化碳为碳素氧化的终产物，甲烷为碳素还原的终产物。在沼气发酵过程中参与甲烷形成的细菌统称为甲烷细菌。

（一）甲烷细菌的特性

1．是专性严格厌氧菌

甲烷细菌都是专性严格厌氧菌，对氧非常敏感，遇氧后会立即受到抑制，不能生长、繁殖，有的还会死亡。

2．生长繁殖特别缓慢

甲烷细菌生长很缓慢，在人工培养条件下需经过十几天甚至几十天才能长出菌落。据麦卡蒂（McCarty）介绍，有的甲烷细菌需要培养七八十天才能长出菌落，在自然条件下甚至更长。菌落也相当小，特别是甲烷八叠球菌菌落更小，如果不仔细观察很容易遗漏。菌落一般圆形、透明、边缘整齐，在荧光显微镜下发出强的荧光。甲烷细菌生长缓慢的原因，是它可利用的底物很少，只能利用很简单的物质，如CO2、H2、甲酸、乙酸和甲基胺等。这些简单物质必须由其它发酵性细菌，把复杂有机物分解后提供给甲烷细菌，所以甲烷细菌一定要等到其它细菌都大量生长后才能生长。同时甲烷细菌世代时间也长，有的细菌20分钟繁殖一代，甲烷细菌需几天乃至几十天才能繁殖一代。

3．都是原核生物

能形成甲烷的细菌都是原核生物，目前尚未发现真核生物能形成甲烷。甲烷细菌有球形、杆形、螺旋形，有的呈八叠球状，还有的能联成长链状。

4．培养分离比较困难

因为甲烷细菌要求严格厌氧条件，一般培养方法很难达到厌氧，培养分离往往失败。又因为甲烷细菌和伴生菌生活在一起，菌体大小形态都十分相似，在一般光学显微镜下不好判明。美国著名微生物学家——Hungate 50年代培养分离甲烷细菌获得成功。以后世界上有很多研究者对甲烷细菌进行了培养分离工作，并对Hungate分离方法进行了改良，能很容易地把甲烷细菌培养分离出来。

甲烷细菌在自然界中分布极为广泛，在与氧气隔绝的环境都有甲烷细菌生长，海底沉积物，河湖淤泥，沼泽地，水稻田以及人和动物的肠道，反刍动物瘤胃，甚至在植物体内都有甲烷细菌存在。

沼气发酵液中甲烷细菌的数量可用MPN法计数，测定接种的试管中有无甲烷存在，作为计数的数量指标。甲烷细菌数量与甲烷含量成正比，发酵装置运行越好，甲烷细菌数量越多。作者曾于1991年计数了东北制药总厂用UASB（上流式厌氧污泥床）处理制药废水消化液中甲烷细菌数量为4.2×105个·ml-1。

另一方面产甲烷细菌利用乙酸、氢和二氧化碳合成甲烷，也消耗了酸和二氧化碳，甲烷细菌及其伴生菌共同作用使pH稳定在一个适宜范围内，不会使发酵液中的pH出现对沼气发酵不利的情况。但当发酵条件控制不好，如温度，进料负荷，原料中的C：N、pH等可能会出现酸化或液料过碱；前者较为多见，这样会严重影响甲烷细菌的活动，甚至使发酵中断。

（二）沼气发酵

在自然界中绿色植物经光合作用合成碳水化合物，主要形成糖、淀粉、纤维素等。纤维素合成的数量最大，贮量也最多，是地球上很难被微生物分解的物质。在好氧条件下，纤维素可被少数微生物氧化分解，最终产生CO2和H2O。目前所知绿色木霉是分解纤维素最强的微生物。

（C6H10O5）n+nO2→nCO2+nH2O

在厌氧条件下，纤维素经厌氧微生物发酵作用最终产生CH4。

在自然界形成甲烷的地方主要有沼泽地、水稻田、井地、河湖淤泥及反刍动物瘤胃。反刍动物瘤胃具有产甲烷的良好条件，所以瘤胃被称为产甲烷的天然高效能的连续发酵罐。

1．甲烷形成的微生物学过程

从有机物质厌氧发酵到形成甲烷，是非常复杂的过程，不是一种细菌所能完成的，是由很多细菌参与联合作用的结果。

（1）联合作用从有机物到甲烷形成，是由很多细菌联合作用的结果。甲烷细菌在合成的最后阶段起作用。它利用伴生菌所提供的代谢产物H2、CO2等合成甲烷。整个过程可分以下几个阶段：

以上几个阶段不是截然分开的，没有明显的界限，也不是孤立进行的，而是密切联系在一起互相交叉进行的。

（2）种间H

2

的转移作用在沼气发酵过程中，产酸菌、伴生菌发酵有机物产H2，H2又被甲烷细菌用于还原CO2合成CH4。

伴生菌和甲烷细菌在发酵过程中形成了共生关系，S-菌系分解乙醇产H2，H2对它继续分解乙醇有阻抑作用，而MOH-菌系可利用H2，这样又为S-菌系清除了阻抑，两者在一起生活互惠互利，单独存在都生活不了。

（3）由乙酸产生甲烷乙酸是有机物在厌氧发酵过程中主要中间代谢产物，也是形成甲烷的重要中间产物。McCarty实验证明，有机物发酵分解产生乙酸形成甲烷，约占甲烷总生成量的72％，由其他产物形成甲烷约占28％。由乙酸形成甲烷过程也是很复杂的，用14C示踪原子试验表明，由乙酸形成甲烷有两种途径：

①由乙酸的甲基形成甲烷

②由乙酸转化为CO

2和H

2

形成甲烷

2．沼气发酵微生物之间的生态关系

沼气发酵是一个极其复杂的生物化学过程，包括各种不同类型微生物所完成的各种代谢途径。这些微生物及其所进行的代谢都不是在孤立的环境中单独进行，而是在一个混杂的环境中相互影响。它们之间的互相作用包括有不产甲烷细菌和产甲烷细菌之间的作用；不产甲烷细菌之间的作用和甲烷细菌之间的作用。

在沼气发酵过程中，不产甲烷细菌和产甲烷细菌之间，相互依赖，互为对方创造与维持生命活动所需要的良好环境条件，但它们之间又互相制约，在发酵过程中总处于平衡状态。它们之间的主要关系表现在下列几方面：

①不产甲烷细菌为产甲烷细菌提供生长和产甲烷所需要的基质

不产甲烷细菌可把各种复杂的有机物，如碳水化合物、脂肪、蛋白质等厌氧分解生成H2、CO2、NH3、VFA、甲醇、丙酸、丁酸等，丙酸、丁酸还可被氢细菌和乙酸细菌分解转化成H2、CO2和乙酸，为甲烷细菌提供了合成细胞质和形成甲烷的碳前体，电子供体——氢供体和氮源，使甲烷细菌利用这些物质最终形成甲烷。

②不产甲烷细菌为产甲烷细菌创造了适宜的氧化还原电位条件

在沼气发酵初期，由于加料过程中使空气带入发酵装置，液体原料里也有溶解氧，这显然对甲烷细菌是很有害的。氧的去除需要依赖不产甲烷细菌的氧化能力把氧用掉。因此，降低了氧化还原电位。在发酵装置中，各种厌氧性微生物如