第八章 荧光分光光度法与检测技术

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第一节 基本原理
任何荧光物质都具有两个特征光谱：
激发光谱和荧光光谱（发射光谱）
激发光谱是当荧光波长一定时，荧光强度随激发光
波长而变化的关系曲线（以激发光波长λex为横坐标
，荧光的发光强度F为纵坐标的光谱）。
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具有强的可见-紫外吸收，即具有K带强吸收 具有高的荧光效率
发射荧光的量子数 荧光效率 F 吸收激发光的量子数
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第一节 基本原理
（二）分子结构与荧光的关系

大的共轭π键结构 λex（激发） λem（激发） φF
苯
萘
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多组分混合物测定 与吸光度一样，荧光强度也有加和性，因此混合
物不需经过分离，可用解联立方程的方法测定。可选
择两物质不同的激发波长处的荧光强度测定，也可选 择不同荧光波长处的荧光强度测定，这样选择范围比 紫外-可见分光光度法广泛。
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第二节 荧光定量分析
一、荧光强度与物质浓度的关系
当溶液中荧光物质的浓度为 c，液层厚度为（吸收 池内径） L 时，由于荧光强度 F 正比于被荧光物质吸 收光的强度：F∝（I0 – I），用线性方程表示为：
F = K′（I0 – I）
286
278
321
0.11
0.29
蒽
四苯
365
390
400
480
0.46
0.60
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第一节 基本原理

分子的刚性和共平面性
联苯φF =0.18

芴F=1.0
取代基的影响
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第二节 荧光定量分析
点滴积累
当其他条件（即 φF 、 I0 、 ε 、 L）一定时，荧光物质在 稀溶液中的荧光强度F与浓度c成正比。 荧光分析的定量方法与紫外-可见分光光度法基本相同。
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第三节 应用与发展
第三节 应用与发展
F = Kc
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第二节 荧光定量分析
当其他条件也一定时，荧光物质在稀溶液中的 荧光强度与浓度呈线性关系，这是荧光定量分析的 依据。 但只有当荧光物质的浓度很小时， 即 ε· c· L ≤ 0.05，这种关系才成立。
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分别测其F1、F2、F3……值，用F~c作图绘制标准曲
线。
然后在同样条件下测定试样溶液的Fx，在标准
曲线上查找对应的浓度cx。
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第二节 荧光定量分析
比例法 若荧光分析标准曲线过原点，则可选择其线性范围
用比例法测定。即配制一对照品溶液（cs）测其荧光强
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第八章
荧光分析法检测技术及应用
◆学习目的⊙
◆知识要求⊙
◆能力要求⊙
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◆学习目的
通过学习荧光分析法的基本原理，产生荧光的条件以 及荧光光谱特征和用途，加深对荧光分析的依据、条 件和应用的理解，并能选择荧光物质的激发波长和荧 光波长进行分析。为学习药物分析、天然药物化学等 专业课程奠定基础。
第一节 基本原理
溶液荧光光谱具有如 下特征：
斯托克斯位移
荧光光谱的形状与激
发波长无关
荧光光谱与激发光谱
的镜像关系
蒽的激发光谱（虚）和荧光光谱（实）
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第一节 基本原理
三、荧光与分子结构
（一）荧光物质的特征

一、荧光分析的应用
（一）有机化合物的荧光分析
芳香族及具有芳香结构的化合物，因存在共轭体系 在紫外光照射下很多能发射荧光。为提高测定灵敏度 和选择性，可使弱荧光物质与某些荧光试剂作用，以 得到强荧光性产物。因此，荧光分析法在有机物测定 方面的应用很广。
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某些物质吸收紫外 - 可见光后，可以发射其波长比 吸收光更长的光，并且随照射光的消失而消失，这 种发射光称为荧光（fluorescence）。 荧光分析法（fluorometry）是利用某些物质发射荧 光的特性进行定性、定量分析的光学分析方法，又 称荧光光谱法
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第一节 基本原理
（二）磷光的产生 电子由激发三重态→基态单重态的跃迁
课堂互动
您能比较荧光和磷光的主要区别吗？
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第一节 基本原理
二、激发光谱和荧光光谱（发射光谱）
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◆能力要求 掌握荧光分光光度计的基本结构及仪器的基本操作 方法，学会使用荧光分光光度计对药物进行分析的 操作技术。
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第一节 荧光分光光度法的基本原理
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第一节 基本原理
（三）影响荧光强度的外界因素

温度


溶剂
溶液酸碱性


荧光熄灭剂
散射光
激发光源
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第一节 基本原理
（四）荧光分光光度计
荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出 的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发 射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏
原油试样在环乙烷中的 等角三维投影光谱图
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第八章 荧光分析法检测技术与应用
目标检测
一、选择题 (一)单项选择题
1. 荧光光谱属于（
A、吸收光谱
）。
C、红外光谱 D、质谱 ）。
B、发射光谱
2. 分子荧光分析比紫外-可见分光光度法选择性高的原因是（
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第八章 荧光分析法检测技术与应用
A、能发射荧光的物质比较少
B、分子荧光光谱为线状光谱，而分子吸收光谱为带状光谱 C、荧光波长比相应的吸收波长稍长
D、荧光光度计有两个单色器，可以更好地消除组分间的相互干扰
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第八章 荧光分析法检测技术与应用
3. 荧光量子效率是指（
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第一节 基本原理
（二）荧光分光光度计的基本结构
1.光源 2. 4. 7. 9. 狭缝 3. 激发单色器 5. 样品池 6. 表面吸光物质 8. 发射单色器 10. 检测器 11. 放大器 12. 指示器 13. 记录器
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第一节 基本原理
荧光光谱是当使激发光波长和强度不变，而让物质 所产生的荧光通过发射分光系统 ( II )分光，测定每 一发射波长荧光强度F，以发射光波长λem为横坐标 ，荧光的发光强度F为纵坐标作图所得的关系曲线。
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振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和
结构情况。
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第一节 基本原理
（一）仪器类型

滤光片荧光计 滤光片-单色器荧光计 荧光分光光度计
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度（Fs），再测定试样溶液（cx）的荧光强度（Fx）， 然后进行比较。测定时同样要以空白（F0）校正：
Fs F0 cs Fx F0 cx cs Fx F0 cx Fs F0
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第二节 荧光定量分析
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第一节 基本原理
课堂互动 请您比较荧光分光光度计与紫外-可见分光 光度计的主要区别
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第一节 基本原理
点滴积累
荧光和磷光在实验现象上的区别：激发光停止照射
）。
A、荧光强度与吸收光强度之比
B、发射荧光的量子数与吸收激发光的量子数之比
C、发射荧光的分子数与物质的总分子数之比 D、激发态的分子数与基态的分子数之比
4. 一种物质能否发出荧光主要取决于（
A、分子结构 B、激发光的波长
）。
D、溶剂的极性
C、温度
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第二节 荧光定量分析
课堂互动 请您分析为什么荧光分光光度法的灵敏度 比紫外-可见分光光度法要高？
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第二节 荧光定量分析
二、定量分析方法 标准曲线法
配制一系பைடு நூலகம்浓度为c1、c2、c3……对照品溶液，
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第一节 基本原理
一、荧光的产生过程 （一）单重态与三重态 A 单重基态 B 激发单重态 C 激发三重态
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第一节 基本原理
（二）荧光的产生 电子由激发单重态 →基态单重态的跃 迁
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第三节 应用与发展
（二）无机化合物的荧光分析 直接荧光法 荧光猝灭法 催化荧光法
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第三节 应用与发展
二、荧光分析新技术 激光荧光分析 时间分辨荧光分析 同步荧光分析 胶束增敏荧光分析 三维荧光光谱分析
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第一节 基本原理


光源
目前最常用的是氙灯
单色器（分光系统）
激发单色器

发射单色器
样品池 测定荧光用的样品池必须用低荧光材料或石英

检测器
光电倍增管
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第一节 基本原理
（三）仪器校准

灵敏度校准


波长校准
激发光谱和发射光谱校准
时，荧光随之消失而磷光则将延续一段时间。
最强荧光波长 λem和最强激发波长 λex是物质的定性 依据，也是定量测定时的最适宜波长。 强荧光物质的分子结构体征：一、具有长共轭结构， 如芳香环、稠环或杂环；二、刚性和共平面性。 影响荧光强度的主要因素是分子结构与外界条件。
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◆知识要求
熟悉掌握荧光和磷光产生的原理和特点及区别；激 发光谱与荧光光谱的概念及用途；溶液荧光光谱的 特征；产生荧光的条件；荧光定量分析的依据、条 件和方法。了解。 了解影响荧光强度的因素，荧光分析仪器及其与紫 外-可见分光光度计的区别，荧光分析新技术在分析 中的应用。
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第二节 荧光定量分析
K′为常数，称荧光比率，其大小取决于一定条 件下的荧光效率，结合比尔定律可得到下式：
F = 2.303· φF· I0· ε· c· L
入射光强度 I0 在波长一定，光源稳定时为固定 值，因此可以将2.303· φF· I0· ε· L视为常数K，故：
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第二节 荧光定量分析
第二节
荧光定量分析
由于荧光物质的结构不同，其吸收光的波长不同， 发射出荧光的波长也不同，这就是荧光分光光度法 对能产生荧光的物质进行定性分析的依据。实验 证
明 ，在稀溶液中，荧光强度与荧光物质的浓度成正
比，这是荧光分光光度法对荧光物质进行定量分析 的依据。