核干细胞因子的研究进展

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孙永刚综述，房殿春审校

第三军医大学西南医院全军消化研究所．重庆４０００３８

【关键词】核干细胞因子；干细胞；肿瘤细胞

Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｎｕｃｋｏｓｔｅｍｉｎ

【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｎｕｃｌｅｏｓｔｅｍｉｎ；Ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ；Ｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ

【Ｆｉｒｓｔａｕｔｈｏｒ’Ｓｎａｍｅａｎｄａｄｄｒｅｓｓ】ＳＵＮＹｏｎｇｇａｎｇ。Ｄｅｐａｒｔ－ｍｅｎｔｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＨｏｓｐｉｔａｌ。ＴｈｅＴｈｉｒｄＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０００３８，Ｃｈｉｎａ

中图分类号：Ｑ５１３＋．１文献标识码：Ａ收稿日期：２００７—１０－２３文章编号：１００６—５７０９（２００８）０ｌ一０００８—０４

干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化增殖潜能的原始细胞，根据干细胞的来源及分化潜能，可将干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞¨ｊ，肿瘤细胞无限增殖特性与干细胞相似，肿瘤可能通常起源于正常干细胞的转化，相似的信号通路可能既调节干细胞也调节癌细胞的自我更新，且肿瘤细胞中可能包含有“肿瘤干细胞”口１（ｃａｎｃｅｒｓｔｅｍｃｅｌｌｓ）一它们是一些极少的具有自我更新不定潜能的驱使肿瘤形成的细胞。正是这群特异性细胞促使肿瘤的产生和发展。２００２年，Ｔｓａｉ和Ｍｃｋａｙ¨１在研究一些被干细胞优先表达并与细胞增殖调控有关的基因和蛋白时，报道发现了１个新的核内蛋白。并将它命名为核干细胞因子（ｎｕｃｌｅｏｓｔｅ．ｒａｉｎ，ＮＳ），本文将就ＮＳ的生物学特性及其作用机制做一综述。

１核干细胞因子的发现及其生物学特性

Ｔｓａｉ等¨１在实验中发现通过无性系的分析显示中枢神经系统干细胞能够从发育的鼠脑中分离出来，在分化以前，所有的干细胞分开并表达巢蛋白，即一种神经上皮前体的特征性中间丝，在培养基中撤掉碱性成纤维细胞生长因子，增加ｌＯ％的胎牛血清，８ｄ后这些细胞有效的分化为神经元，星形胶质细胞，少突胶质细胞。利用体外中枢神经系统干细胞快速分化的特点，通过使用未分化池作为检验器，分化池作为驱动器建立一个消减信息库，从这个信息库里，在皮质层干细胞中鉴定出含量丰富的两个克隆（ＳＲ２０４和ＳＲ７５），一个已知的基因（３．羟基．３一甲基戊二酰辅酶Ａ还原酶），３．羟基一３一甲基戊二酰辅酶Ａ还原酶在胆固醇合成中是个限速酶，在调节果蝇属的原生殖细胞迁移中起着胆固醇依赖性的作用。目前的研究集中在克隆ＳＲ２０４上，发现它在干细胞中丰富的表达，在干细胞分化后表达量迅速下调。ＳＲ２０４命名为ＮＳ是因为它的核仁定

ｓｕｎｙ９０２３＠１６３．ｃｏｒｎ位与优先表达在皮质层干细胞。兔的ＮＳｃＤＮＡ包含１８１０核苷酸，鼠的ＮＳｃＤＮＡ包含ｌ８１３个核苷酸，序列分析显示全长的ｍＲＮＡｓ由１６１７个核苷酸的开放阅读框架，５’非翻译区（ＵＴＲ）的１个框内终止密码子一个最佳的Ｋｏｚａｋ序列，３７ＵＴＲ的多腺苷酸化信号，开放阅读框架编码一个５３８个氨基酸，分子量为６１ｋＤ的蛋白，兔与鼠的ＮＳ有９０％同源性和９４％相似性，ＰＲＯＳＩＴＥ分析和保守区的搜寻鉴定出两个限定ＧＴＰ结合蛋白的共有基序，Ｎ末端的碱基区和Ｃ端的酸性结构域。ＰＳＯＲＴ分析显示多重核定位系列和卷曲螺旋区，在基因数据库中ｂｌａｓｔ分析显示人类的同系物与兔的序列有８１％的同源性，人类的基因是从雌激素诱导的增强表达的乳腺癌细胞系中分离出来的。人的ＮＳ基因定位于３ｐ２１．１，与小鼠有８ｌ％的编码同源，Ｎｓ蛋白有５３８个氨基酸，分子量为６１ＫＤ，由１个碱性区域（Ｂ），１个双螺旋区（ＣＣ）、ＧＴＰ结合构件（Ｇ４、Ｇ１）和１个酸性区域（Ａ）组成。

２核干细胞因子的作用机制

２．１ＮＳ功能的分子机制为了说明ＮＳ功能的分子机制，Ｔｓａｉ等口。进行了一系列的突变分析，构建了缺失碱性区域（ｄＢ；密码子２＿４６）、卷曲螺旋区域（ｄＣＣ；密码子６ｌ一８７），Ｇ４ＧＴＰ结合基序、（ｄＧ４；密码子１７７—１８０）、ＧＩＧＴＰ结合基序（ｄＧｌ；密码子２５６－２６３）、酸性结构域（ＤＡ；密码子４６０．５０３）、碱性和Ｇ１区域双缺失区域的情况，当转染至Ｕ２０Ｓ细胞，所有的突变体位于细胞核，但是在细胞核的分布表现出不同的分布模式，没有Ｎ末端碱性区域（ｄＢ），突变蛋白（ｄＢ）则在核浆分布更加弥散。另一方面，缺乏Ｇ４或Ｇ１．ＧＴＰ结合基序的突变体与核仁区域结合形成不规则聚集物并扭曲核仁结构。为了测试这些突变体形成聚集物的能力是否依赖它们的核仁定位，制成缺失碱基和Ｇ１区域的双突变（ｄＢ／Ｇ１），虽然这个突变蛋白仍然形成聚集物，但从核仁区域离解而ｄＣＣ或ＤＡ却不能产生与细胞内ＮＳ分布或核仁形态相一致的改变，说明Ｎ末端碱性区域决定了核仁的定位，ＧＴＰ结合基序则调节ＮＳ蛋白聚集状态。

２．２ＮＳ与Ｐ５３Ｐ５３是一个与应激反应有关的关键细胞周期检查点蛋白和肿瘤抑制基因，功能丧失或基因突变将导致异常的细胞周期恶性循环，细胞生长失控，促使恶性肿瘤形成。Ｐ５３的功能被几种核仁蛋白

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调节，包括ＡＲＦ、Ｗｅｒｎｅｒ综合征蛋白。ＡＲＦ是一个通过ＭＤＭ２来稳定Ｐ５３的肿瘤抑制因子，它和Ｎｓ一样，也位于核仁，Ｐ５３在干细胞群中表达而且在整个分化过程中保持不变，另一方面，ＡＲＦ的表达水平在中枢神经系统干细胞中是低水平表达，当干细胞分化时表达水平上调，表达模式与ＮＳ相反。ＡＲＦ敲除的小鼠表现出对衰老的抵抗力增强，带有ＷＲＮ基因突变的病人显示出基因不稳和过早老化。小鼠ＮＳ基因敲除实验和免疫共沉淀发现ＮＳ和Ｐ５３存在于一个蛋白复合体，ＮＳ可能与Ｐ５３相互作用并阻碍它的生长抑制能力。由于在核仁中未发现Ｐ５３，ＮＳ与Ｐ５３的相互作用可能发生在核质中旧１。Ｍａ”’等认为ＮＳ受ＡＲＦ的调节，并且ＮＳ以Ｐ５３依赖途径调控着细胞Ｇ．／Ｓ的转换。

２．３ＮＳ的干扰和过表达ＮＳ蛋白敲除实验揭示ＮＳ的功能能够保持干细胞和肿瘤细胞的增殖能力，通过ＲＮＡｉ敲除，８％的Ｕ２０Ｓ细胞残留在细胞周期中，甚至免疫染色不能检测到ＮＳ，增殖能力的保持可能是通过剩余的Ｎｓ所驱动。蔡子微等”ｏ用ＮＳ特异性ｓｉＲＮＡ表达载体转染Ｈｅｌａ细胞，观察转染的Ｈｅｌａ细胞体内外增殖的变化，发现体外培养的ＮＳ－ｓｉＲＮＡ—Ｈｅｌａ细胞中ＮＳ表达显著降低，Ｓ期细胞的百分率明显低于正常Ｈｅｌａ细胞组，Ｇ。／Ｇ。期细胞百分率显著升高，而处于Ｓ期细胞的百分率降低和Ｇ。／Ｇ，期百分率的升高则是细胞增殖减慢的一个指标峥１。张志宏等¨１运用ＲＮＡ干扰抑制膀胱肿瘤细胞ＢＩＵ２８７核干细胞因子基因表达，发现ＮＳ的表达丰度明显下调，且其体外增殖速率明显降低。

ＮＳ的过表达也会降低干细胞和Ｕ２０Ｓ细胞的增殖速率，缺失分析为过表达类型提供了一个解释，为ＮＳ的调节机制提供了一个新的观点，缺失分析显示缺少Ｎ末端碱基的突变体弥散分布在核浆里，缺少ＧＴＰ结合位点的突变体聚集在核仁形成聚集物并使核仁结构断裂，缺失碱基和Ｇ１ＧＴＰ结合基序的突变体则分布在核仁外，这些结果提示Ｎ末端碱基区域决定了核仁的定位，ＧＴＰ结合基序调节着蛋白聚集物的结构。ＮＳ的过表达导致分裂前期的细胞数量减少但不影响Ｓ期细胞数量，死亡细胞数量的增加依赖与Ｎ末端碱基区域，在ＧＴＰ结合位点缺失的突变体中。ＮＳ过表达对有丝分裂期中的细胞数量和细胞存活能力的影响效应得到了显著性的增强，虽然ｓ期的细胞数量保持不变，与野生型蛋白相比，在表达ＧＴＰ缺失的突变体中，ＢｒｄＵ标记的模式则完全不同，ＢｒｄＵ标记的模式发生在突变蛋白的聚集物中，表明Ｎｓ的过表达可能直接分裂了核仁复合体或间接引起细胞周期停留在Ｓ期末，导致细胞的死亡ｐ１。２．４ＮＳ与ＴＲＦＩ蛋白我们知道，ＴＲＦＩ蛋白是端粒长度的负调节因子¨Ｊ，能够以二聚体的形式通过其Ｃ端的ｍｙｂ结构域与端粒ＤＮＡ结合，强化端粒的有序结构，使其处于一种“关闭”状态，导致端粒酶无法接近端粒末端发挥作用，缩短端粒长度，而端锚聚合酶（Ｔａｎｋｙｒａｓｅ）对它进行聚ＡＤＰ２核糖基化修饰，可使其从端粒ＤＮＡ上脱落，解除它对端粒长度的调节作用一１，而且从端粒上解离下来的ＴＲＦｌ分子可被蛋白酶体系通过泛素化修饰所降解‘ｌＯ］。Ｚｈｕ等ｎ¨证明ＮＳ能够和ＴＲＦｌ蛋白相互作用，提高其降解率，但并不是通过泛素化修饰的途径来降解ＴＲＦｌ蛋白。

２．５ＮＳ在干细胞中的表达Ｋａｆｉｅｎａｈ等¨副研究发现ＮＳｍＲＮＡ在骨髓干细胞中有很高的表达量，随着细胞在培养基中的扩增，其量仍然保持不变，当干细胞被成纤维细胞生长因子刺激增生时，ＮＳ的表达的增加呈剂量依赖性，ＲＮＡ干扰实验消除了ＦＧＦ－２的增殖效应，当骨髓干细胞分化成为软骨细胞，脂肪细胞，骨细胞时候，ＮＳ的表达量是７０％一９０％低于在单层（细胞）培养中的未分化细胞。因此推断ＮＳ是成人骨髓干细胞未分化的标志，它调节着这些细胞的增殖。Ｂａｄｄｏｏ等Ⅲ’也发现ＮＳ在鼠的间充质干细胞中有表达。有作者认为ＮＳ的阳性并不能认为是皮肤干细胞的表面标志¨“。骨髓间充质干细胞是多能干细胞，它有自我更新的能力和分化为多种细胞的潜力，Ｙａｇｈｏｏ．ｂｉ等¨副运用ＲＴ．ＰＣＲ和免疫细胞化学法检测神经分化诱导前后的鼠骨髓间充质干细胞中ＮＳ表达，发现与Ｏｃｔ－４，Ｎａｎｏｇ，ＮｅｕｒｏＤ等增殖与分化的关键调节因子相比，在未分化或已分化好的骨髓间充质干细胞中未检测ＮＳ的表达，相反ＮＳ在未分化的骨髓间充质干细胞中有高表达，在诱导分化后表达量迅速下降在分化后的６ｈ，表达完全消失，ＮＳ的表达量的消失与神经微丝Ｍ、神经微丝Ｈ、肌腺苷磷酸、突触素、神经元特异性烯醇酶等的出现是一致的。ＮｅｕｒｏＤ和ＣｙｃｌｉｎＤ１的表达在分化过程中也会下降，但下降速率要小于ＮＳ，因此认为Ｎｓ而不是Ｏｃｔ－４或Ｎａｎｏｇ调节着骨髓间充质干细胞的自我更薪与增殖。在水螈的再生中，分化好的细胞能够恢复为干细胞样细胞，仍保留着增殖能力与分化潜能。Ｍａｋｉ等¨钊克隆了水螈ＮＳ的同系物，并分析了它的调节机制，发现在晶状体的再生过程中，ＮＳ的表达被启动，在进入下一个细胞周期前，迅速累积于去分化的色素上皮细胞中，在肢体的再生过程中，在芽基形成前也迅速累积退化了多核肌纤维的核仁中，由此认为ＮＳ在水螈细胞的去分化中起着重要的作用。

２．６ＮＳ在肿瘤细胞中的表达Ｌｉｕ等Ⅲ１检测了ＮＳ在胃腺癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、食管鳞癌、正常肾组

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