食品卫生细菌学检验技术

锯取样品，也可以用无菌钻头钻取碎样品，放入无菌容器。

注：固体样品或冷冻食品取样还应
注意检样目的，若需检验食品污染情况，可取表层样品；若需检验其品质情况，应再取深部样品。

（5）生产工序监测采样
车间用水：自来水样从车间各水龙头上采取冷却水，汤料从车间容器不同部位用100ml无菌注射器抽取。

车间台面、用具及加工人员手的卫生监测：用板孔5cm2无菌采样板及5支无菌擦拭25cm2面积。

车间空气采样：将5个直径90mm的普通营养琼脂平板分别置于车间的四角和中部，打开平皿盖5min，然后盖上平板送检
3、
采样的标签：采样前或后应立即贴上标签，每件样品必须标记清楚，如品名、来源、
数量、采样地点、采样人及采样时间（年、月、日）
取样注意事项：
（1）防止交叉污染或二次污染：取样人员的个人卫生控制；取样地点的环境控制，空气净化要达到要求；取样的器皿要求彻底消毒，避免直接与空气接触；取样的操作要规范、迅速（无菌操作）；减少样品存放的时间（保持样本原有的状态、易变质的样本要冷藏）
(2)取样要有代表性：取样的数量标准；取样的方法
二、送检
采样后，在送检过程中，要尽可能保持检样原有的物理和微生物状态，不要因送检过程而引起微生物的减少或增多。

1、无菌方法采样后，所装样品的容器要无菌，装样后尽可能密封，以防止环境中的微
生物进一步污染；
2、进行微生物检验的样品，送达实验室要越快越好，一般不应超过3h。

若路途遥远，
可将不需冷冻的样品，保持在1～5 ℃环境中送检，可采用冰桶等装置；若需保持在冷冻状态（如已冰冻的样品），则需将样品保存在泡沫塑料隔热箱内，箱内可置干冰，使温度维持在0℃以下，或采用其他冷藏设备；
3、送检样品不得加入任何防腐剂；
4、水产品因含水分较多，体内酶的活力较旺盛，易于变质。

因此，采样后应在3h内送
检，在送检途中一般都应加冰保存；
5、对于某些易死亡病原菌检验的样品，在运送过程中可采用运送培养基。

6、检样标注适当的标记并填写微生物学检验特殊要求的送检申请单。

其内容包括：样
品的描述，采样者的姓名，采样的日期、时间、地点，采样时的温度和湿度等
•三、样品处理
•
•
•
•
四、检验与报告
检验：检验样品送到实验室后，立即将样品置于普通冰箱或低温冰箱中，并进行登记、填写实验序号，按检样检样要求，积极准备条件进行检验。

样品收集后应于36h内检验；
报告：按样品项目完成各类检验后，检验人员应及时填写检验报告单，签名后送主管人员签字，加盖单位印章，以示生效，立即交食品卫生监督人员处理；
实验室必须具有专用冰箱存放样品，对于一般阳性样品，在发出报告3天（特殊情况可适当延长）方可处理样品；进口食品的阳性样品，需保存6个月，才可处理；而对于阴性样品可及时处理。

§5-2食品卫生细菌学检验技术
1、肉与肉制品检样的制备
2、乳与乳制品检样的制备
3、蛋与蛋制品检样的制备
4、水产品检样的制备
5、饮料、冷冻饮品检样的制备
6、调味料检样的制备
7、糖果、糕点和蜜饯检样的制备
8、酒类检样的制备
9、方便面（速食米粉）检样的制备
10、罐藏食品检样的制备
小结：
后记：
2、操作要点
（1）将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基置于45 ℃恒温水浴锅中保温备用。

（2）编号:无菌试管（10-1 、10-2 、10-3 、10-4。

）、无菌培养皿、空白对照平板（3）稀释菌液：
（4）摇匀平板：平板前后、左右或者以顺时针、逆时针。

（5）倒置培养
例次不同稀释度的平均菌落数菌落总平均数及报告方式（个
/ml，或个/g）
10-1 10-2 10-3 两个稀释度菌落数之
比
1 1468 174 20 －17400或×104
2 多不可计295 46 460/295＝37750或×104
3 多不可计271 60 600/271＝27100或×104
4 多不可计1550 511 －511000或×105
5 28 10 7 －280或×102
6 0 0 0 －< 1 ×10或< 10
7 多不可计303 18 －30300或或×104
产品名称? 生产车间 ? 班次?
生产日期? 抽样日期 ? 检验日期?
细菌总数
5、注意事项
（1）检验中所用玻璃器皿，如培养皿，吸管、试管等必须是完全灭菌的，并在灭菌前彻底洗涤干净，不得残留有抑菌物质。

（2）充气饮料应在无菌条件下进行排气；酸性样品用经过灭菌的20～30％碳酸钠溶液调整pH值至中性；高盐样品应用灭菌蒸馏水进行稀释。

(3)在作10倍递增稀释中，吸管插入检样稀释液内不能低于液面；吸入液体时，应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖端贴于玻璃瓶或试管的内壁使吸；当用吸管将检样稀释液加至另一装有9mL空白稀释液的试管内时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液，以防吸管尖端外侧部分粘附的检液也混入其中。

(4)为了防止细菌增殖及产生片状菌落，在检液加入平皿后，应在20分钟内向皿内倾入琼脂，并立即使其与琼脂混和均匀。

（5）计数表示方法：CFU /ml或个（国际标准
6、其他菌落总数的测定
1、平板菌落计数法测定的是在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧或兼性厌氧的菌落总数。

厌氧菌、嗜冷菌、嗜热菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的一些细菌也受到了限制。

3、嗜冷菌计数（新鲜鱼贝）操作要点：采样后尽快冷藏检验；稀释液涂布于TS或CVT琼
脂平板上，平板倒置于冰箱中冷藏培养。

4、嗜热菌操作要点：采样煮沸5min（杀死细菌繁殖体）；
5、厌氧菌操作要点：稀释液与45℃硫乙醇酸钠琼脂混合摇匀，倒平板，在其上封一层3％
无菌琼脂。

7、出现的实际工作问题
1、做菌落总数检测时,发现稀释倍数大的比稀释倍数小的平皿上生长的菌落数还多,而且空白对照又没长菌,我找不出啥原因？
2、我做的菌落总数的测定，是把浓缩的复合芽孢杆菌进行10-8、10-9、10-10稀释，在涂
布法吸取的3个浓度的时候，培养皿中长出来的菌2个10-9长了一大片的菌连在一起，10-8也有一个这样，其他的几乎不长，究竟怎么会事？
3、检测菌落总数时,有些菌落难以区别,有没有什么好的试剂,能增加菌落的可见率？
4、我公司做的菌落总数和技术监督局所测的数目存在巨大差别.
5、是这样的:我公司跟客户采购一批的鸡粉，多次检测此批产品菌落总数均在5000左右，
超过我司的内控标准。

但客户检测数目与我司不符，于是我司把产品送到当地的技术监督局检测，所得结论是菌落总数为：205个/克。

所以我们老总怀疑我们的工作能力，但问题是在其中一次操作中，我们同时化验两种不同品牌的鸡精，一种不符合要求，一种可以。

二、
三、电阻抗法测定细菌总数
原理：供细菌生长的液体培养基是电的良导体，在特制的测量管底部装入
电极插头，即可对接种生长的培养基的阻抗变化进行检测。

阻抗变化的产
生是由于微生物生长过程中的新陈代谢使培养基中的大分子营养物质(糖、
脂类、蛋白质等）被分解成小分子代谢物，即较小的带电离子（乳酸盐、
醋酸盐、重碳酸或氨等）这些代谢产物的出现和聚集，增强了培养基的导
电性能，从而降低了其阻抗值:
M=(R0-RT)/R0×100% ，其中R0表示开始时培养基的阻抗值，RT表示任意时
刻培养基的阻抗值，M表示培养基电阻减少的百分数。

电阻越小细菌活动越多，在一定范围内，菌落形成单位（CFU）的对数
Log(CFU)与IDT（阻抗检测时间）呈直线关系。

四、电阻抗法测定细菌总数
优缺点：
1、常规经典检测方法结果准确可靠，，但却存在繁琐、工作量大，好时过长；电阻抗法
叫省力，样品细菌数在4～18小时内出结果。

2、电阻抗法制作标准曲线过程中工作量较大，但以后的检测简便的多，不需要一系列
稀释，只需样品1ml，培养基9ml，测量管一只。

§5-4食品卫生大肠菌群的检验技术
一、基本概念
1、大肠菌群指一群37℃、24h能发酵乳糖，产酸，产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

该菌主要来源于人畜粪便，以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量。

3、大肠菌群包括大肠埃希氏菌（大肠杆菌）、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆
菌等。

大肠菌群的来源分粪便来源和非粪便来源，在℃仍能生长的大肠菌群，称为粪大肠菌群，粪大肠菌群又叫耐热大肠菌群，在人和动物粪便中所占的比例较大，而且在自然界容易死亡。

因此，粪大肠菌群对粪便污染的指示作用更为直接和贴切，主要就是大肠杆菌，但也包括克雷伯氏菌属，正是由于包括了克雷伯氏菌属，使其与粪便污染的相关性受到了影响。

4、大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌这三个指标在实际工作中都在应用，但用途有所
不同，一般认为大肠菌群是水源的卫生指标和食品加工卫生状况的通用指标，粪大
肠菌群主要用于贝类和贝类养殖用水的卫生指标，大肠杆菌用于指示食品受到近期粪便污染或不卫生加工。

5、大肠菌群表示方法：MPN（most?probable?number）/100mL
二、乳糖发酵法（国标）
1、检验稀释
取样及稀释方法与菌落总数检验方法相同。

2、乳糖发酵试验
根据食品卫生要求或对检样污染程度的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。

接种量在1ml以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1ml及1ml以下者, ➢用单料乳糖胆盐发酵管。

置36±1℃温箱内,培养24±2小时,如所有发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则与对照的混合菌种一起按下列程序进行。

➢将产气的发酵管分别在伊红美兰琼脂（EMB琼脂）平板上划线分离。

然后置36±1℃温箱内，培养18～24小时后取出,?观察菌落形态,并作革兰氏染色和证实试验。

3、证实试验
4、在上述平板上,挑取可疑大肠菌落1～2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±
1℃温箱培养24±2小时,观察产气情况,凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌,即可报告为大肠菌群阳性.
4报告
根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。

➢?
三、粪大肠菌群的测定
1、检验稀释
2、44 ℃乳糖发酵试验
将接稀释液的乳糖胆盐发酵管，置于（44±）℃水浴中，经（24 ±2）h培养。

3、证实试验：将所有产气发酵管，分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置（36±1）℃
培养18～24h，并同时接种蛋白胨水，置（44±）℃培养24h。

在平板上观察典型菌落，并做镜检。

在蛋白胨水内加入靛基质试剂约，观察靛基质反应。

5、结果靛基质阳性，平板上有典型菌落者，则证实为粪大肠菌群阳性。

四、出口食品行业标准
⏹
⏹
五、注意事项
1、初发酵阳性管，只能经过平板分离和证实实验后，才有可能成为阳性。

一般地说，
如果平板上有较多典型大肠菌群菌落，革兰氏染色为阳性杆菌，即可做出判定。

如果平板上有典型菌落甚少或不够典型，则应多挑菌落做证实试验，以免出现假阳性。

只做一步初发酵，就作判定，会有相当部分的合格产品被作为不合格样品处理。

2、在实际工作中，有时遇到初发酵时产酸，但导管内无气泡产生，复发酵却证实为大
肠菌群阳性。

有时导管内无气体，但在液面及管壁却可看到小气泡。

导管管口的完整情况与导管外有无沉渣存在均可影响产气反应的观察，管口不完整性有利于气体进入导管，管口周围有沉渣能阻碍或延缓气体进入。

3、大肠菌群菌落的色泽形状与检出率密切相关，伊红美蓝平板上大肠菌群菌落呈，有
光泽或无光泽时，检出率最高。

红色、粉红色菌落检出率较低。

4、MPN检索表第一栏阳性管数下面列出的毫升（克）系指原样品的毫升（克）数，并
非样品稀释后的毫升（克）数。

在进行产品检测前，根据产品标准选择度，如大肠菌群标准30个/100毫升（克）时，应选择稀释度为毫升（克）。

大肠菌群标准
5、3个/100毫升（克）时，稀释度则为毫升（克）
注意事项
➢如何避免放小倒管时产生气泡（大肠菌群检测）？
➢客户要求大肠菌群＜３／ml(g),请问如何检测和报告？
➢伊红美蓝是鉴别培养基，请问鉴别的原理是什么？
六、快速检测方法
⏹LTSE快速检测法：
⏹
⏹TTC（氯化三苯四氮唑）显色快速法
⏹DC（去氧胆酸钠）半固体试管快速法
后记：。