_超高效液相色谱-飞行时间质谱法高通量筛查乳制品中20种镇静剂
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关键词 镇静剂； 乳制品； 超高效液相色谱； 飞行时间质谱； 高通量筛查
1引言
食品中兽药残留检测已从单一化合物发展为多种不同化合物的同时定性和定量分析。与低分辨的 三重四级杆质谱不同，高分辨飞行时间质谱 （ High resolution time-of-flight mass spectrometer，HRTOFMS） 能够采集高质量分辨率和高准确度的全扫描数据，目标化合物数目没有任何限制。利用精确分子 量和同位素峰形还可对异常未知峰进行准确的定性分析。研究人员已经利用该技术建立了蔬菜、水果、 肉制品中有害物质的同时检测方法［1 ～ 7］，显示了其在高通量筛查应用中的巨大潜力，但是国内该方面相 关的报道还较少。
严丽娟1 张 洁* 2 潘晨松3 林立毅1 张欣怡3 申河清2
1 （ 厦门出入境检验检疫局，厦门 361012） 2 （ 中国科学院城市环境研究所 城市环境与健康重点实验室，厦门，361021）
3 （ 美国布鲁克道尔顿公司北京代表处，北京 100081）
摘 要 利用超高效液相色谱 / 高分辨飞行时间质谱，结合数据库，建立了乳制品中 20 种镇静剂的高通量筛 查方法。样品以乙腈和酸化乙腈沉淀蛋白质和脂肪，冷冻离心浓缩，经超高效液相色谱分离，采用电喷雾离子 源，正离子模式，基质匹配法进行定量分析，可在 9 min 内对 20 种镇静剂进行高通量筛查和定量分析。镇静 剂的质量浓度在 1 ～ 500 "g / L 或 5 ～ 1000 "g / L 范 围 内 具 有 较 好 的 线 性 关 系，检 出 限 为 0． 3 ～ 1． 5 "g / L， 定量限为 1 ～ 5 "g / L。在 5 和 50 "g / L 添加水平时，平均回收率为 76． 1% ～ 108． 2% ，相对标准偏差为 2． 5% ～ 9． 0% 。利用 TargetAnalysis 软件建立镇静剂数据库，并应用于加标样品的筛查分析。通过数据库比对，样品 中添加的镇静剂被全部筛查出来，鉴定准确度达到了 100% ，保留时间偏差小于 0． 1 min，质量偏差小于 3 mDa，同位素峰形匹配度大于 89． 5% 。利用本方法对购自超市的 8 个不同品牌的 50 余份乳制品进行了筛查 分析，均未检出阳性样品。
最优条件下的 20 种镇静剂的离子流谱图如图 1 所示。
表 1 20 种镇静剂的线性方程、相关系数、检出限和定量限 Table 1 Linear equations，correlation coefficients，limits of detection （ LOD） and limits of quantification （ LOQ） of twenty tranquilizers
序号 No．
名称 Name
1 唑吡旦 Zolpidem 2 利眠宁 Chlordiazepoxide 3 氯氮平 Clozapine 4 咪达唑仑 Midazolam 5 氟西泮 Flurazepam 6 氟哌啶醇 Haloperidol 7 硝西泮 Nitrazepam 8 氟硝西泮 Flunitrazepam 9 异丙嗪 Promethazine 10 艾司唑仑 Estazolam 11 安眠酮 Methaqualone 12 诺氟西汀 Norfluoxetine 13 奥沙西泮 Oxazepam 14 阿普唑仑 Alprazolam 15 利血平 Reserpine 16 三唑仑 Triazolam 17 氯丙嗪 Chlorpromazine 18 替马西泮 Temazepam 19 甲硫达嗪 Thioridazine 20 地西泮 Diazepam
镇静剂药物具有抑制躁狂、镇吐等作用，可能被添加到奶牛饲料中以促进采食，提高饲料转化率，并 缓解奶牛热应激，提高产奶量［8］。但是，这类药物的残留会造成过敏、心悸、肝损害等不良反应。农业 部第 176 号公告中明确禁止在动物饲料和饮用水中添加氯丙嗪、异丙嗪、地西泮、利血平等镇静剂［9］。 国标 GB / T22993-2008 也制定了乳制品中氯丙嗪和氟哌啶醇等 8 种镇静剂的检测方法［10］。鉴于我国食 品安全的现状，有必要对更多镇静剂进行监测。本研究以氯丙嗪、氟哌啶醇、地西泮和艾司唑仑等 20 种 镇静剂为例，发展了基于超高效液相色谱-飞行时间质谱技术，结合筛查数据库的高通量分析方法，成功 应用于乳制品的快速筛查，方法检出限等技术指标满足相关法规要求。
第 41 卷 2013 年 1 月
分析化学 （ FENXI HUAXUE） 研究报告 Chinese Journal of Analytical Chemistry
第1 期 31 ～ 35
百度文库
DOI： 10． 3724 / SP． J． 1096． 2013． 20555
超高效液相色谱-飞行时间质谱法 高通量筛查乳制品中 20 种镇静剂
为了最大限度消除基质效应干扰，本研究采用基质匹配法进行定量分析。以空白牛奶样品的提取 液配制 0． 1 ～ 1000 "g / L 系列混合标准溶液。镇静剂（ 除唑吡旦外） 的质量浓度在 1 ～ 500 "g / L 或 5 ～ 1000 "g / L 范围内具有较好的线性关系，检出限为 0． 3 ～ 1． 5 "g / L，定量限为 1 ～ 5 "g / L（ 表 1） 。在 5 和 50 "g / L 两个添加水平测定方法回收率及精密度，平均回收率为 76． 1% ～ 108． 2% ，相对标准偏差为 2． 5% ～ 9． 0% 。
图 1 20 种镇静剂的高分辨提取离子流图 Fig． 1 High resolution extracted ion chromatograms （ hrEIC，± 0． 003 Da） of twenty tranquilizers 峰号同表 1（ The peak numbers are the same as in Table 1） 。
线性范围 Linear range
（ "g / L）
1 ～ 100 1 ～ 500 5 ～ 1000 1 ～ 500 1 ～ 500 1 ～ 500 5 ～ 1000 5 ～ 1000 1 ～ 500 5 ～ 1000 5 ～ 1000 5 ～ 1000 5 ～ 1000 5 ～ 1000 1 ～ 500 5 ～ 1000 1 ～ 500 5 ～ 1000 1 ～ 500 5 ～ 1000
考察了 5 mmol / L 甲酸胺-甲醇、5 mmol / L 甲酸胺-乙腈、0． 1% 甲酸-甲醇和 0． 1% 甲酸-乙腈 4 种流 动相对镇静剂离子化效率和峰形的影响。甲酸胺体系可以获得较低的背景值，但是分析物的信号也较 低，严重影响了检测灵敏度。采用甲酸体系时，虽然背景值有所升高，但是分析物的信号显著增强，信噪 比比甲酸胺体系提高了 5 ～ 20 倍。与甲醇相比，采用乙腈作为流动相时可以获得更好的峰形，信号响应值 也略高。因此，本研究采用 0． 1% 甲酸-乙腈作为流动相，20 种镇静剂在 9 min 内可得到较好地分离（ 图 1） 。
对于奶粉等固体样品，准确称取 0． 6 g 粉末样品，加入 2 mL 超纯水充分溶解，其它处理步骤同液态奶。 2． 3 超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱的分析条件
Waters ACQUITY BEH 色谱柱（ 100 mm × 2． 1 mm i． d． ，1． 7 "m） 。流动相 A 为 0． 1% （ V / V） 甲酸溶 液，流动相 B 为 0． 1% （ V / V） 甲酸-乙腈溶液。梯度洗脱： 0 ～ 2 min，30% B； 2 ～ 9 min，30% ～ 72% B。流 速： 0． 30 mL / min； 柱温： 30 ℃ ； 进样器温度 4 ℃ ； 进样体积： 1 "L。电喷雾离子源（ ESI） ； 正离子模扫描模 式； 毛细管电压： 4． 5 kV； 雾化气： 150 kPa； 干燥气温度： 180 ℃ ； 干燥气流速： 6 L / min； 采集质量数范围 m / z 50 ～ 1000。三氟乙酸钠溶液作为外标以校正分子量。
2012-06-01 收稿； 2012-09-21 接受 本文系质检公益性行业科研专项课题（ No． 200910145） 和厦门市科技项目（ Nos． 3502Z20112017，3502Z20092009） 资助 * E-mail： jzhang@ iue． ac． cn
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分析化学
第 41 卷
第1 期
严丽娟等： 超高效液相色谱-飞行时间质谱法高通量筛查乳制品中 20 种镇静剂
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3． 3 精密度、线性关系和回收率 在基于 UPLC / HRTOF-MS 的高通量筛查研究中，保留时间的重现性和质量准确度是定性分析的关
键参数。加标样品重复进样 5 次，保留时间偏差均小于 0． 1 min，测定分子量偏差均小于 3 mDa。测定 分子量偏差越小，数据处理时可设置更窄的提取离子窗口，从而可更有效排除干扰化合物，实现更准确 的定性分析。另外，高质量准确度使得在无标样情况下对未知物定性成为可能，特别是针对镇静剂这类 分子量较小的化合物。例如，某化合物的实测分子量为 388． 1591，与氟西泮的理论分子量（ 388． 1586） 的偏差仅为 0． 5 mDa，而且同位素峰形匹配度为 98． 6% ，依据这些信息即可将该化合物定性为氟西泮。
司和德国 Dr． Ehrenstorfer 公司； 甲酸（ 纯度为 99% ，美国 Acros Organics 公司） ； 乙腈、甲醇（ HPLC 级，美 国 Merck 公司） 。 2． 2 样品前处理
准确移取 2 mL 液态奶于离心管中，加入 2 mL 乙腈，旋涡振荡提取 1 min，8000 g 离心5 min； 将上层 清液全部转移至新离心管中，加入 6 mL 酸化乙腈（ 0． 2% 甲酸，V / V） ，旋涡振荡 1 min，8000 g 离心5 min； 小心吸取 5 mL 上层清液至 15 mL 离心管； 浓缩至溶液体积小于 1 mL，全部转移到 1． 5 mL 离心管中继 续浓缩至近干； 加入 0． 3 mL 30% 乙腈溶液溶解提取物，经过 0． 22 "m 滤膜过滤，转移到装有内插管的样 品瓶中，分析前置于!20 ℃ 保存。
分子式 Formula
C19 H21 N3 O C16 H14 ClN3 O C18 H19 ClN4 C18 H13 ClFN3 C21 H23 ClFN3 O C21 H23 ClFNO2 C15 H11 N3 O3 C16 H12 FN3 O3
C17 H20 N2 S C16 H11 ClN4 C16 H14 N2 O C16 H16 F3 NO C15 H11 ClN2 O2 C17 H13 ClN4 C33 H40 N2 O9 C17 H12 Cl2 N4 C17 H19 ClN2 S C16 H13 ClN2 O2 C21 H26 N2 S2 C16 H13 ClN2 O
3 结果与讨论
3． 1 样品前处理条件优化 本研究采用乙腈和酸化乙腈沉淀蛋白质和脂肪，并结合高速离心，有效去除了乳制品中大量蛋白质
和脂肪，大多数镇静剂的提取率可达到 80% 以上。固相萃取柱常被用于进一步去除基质的干扰［2］，本 研究通过对比发现，对于这 20 种镇静剂，虽然在不经固相萃取柱净化的情况下存在一定的基质干扰，但 是高分辨飞行时间质谱完全可以实现待测物和干扰物的区分，而且采用基质匹配法拟合标准曲线也可 在一定程度上消除基质干扰。经过和不经过固相萃取柱净化的两种方法的定量准确度基本相当，并无 明显差异。 3． 2 超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱条件的优化
2 实验部分
2． 1 仪器与试剂 超高效液相色谱（ 美国 Waters 公司） ； 四极杆 / 飞行时间质谱（ 美国 Bruker 公司） ； Speedvac 离心浓
缩仪（ 美国 Thermo 公司） ； 高速离心机（ 德国 Hettich 公司） 。 氯丙嗪、氟哌啶醇、地西泮和艾司唑仑等 20 种镇静剂标准品（ 纯度 ＞ 98% ） ，购自美国 Cerilliant 公
1引言
食品中兽药残留检测已从单一化合物发展为多种不同化合物的同时定性和定量分析。与低分辨的 三重四级杆质谱不同，高分辨飞行时间质谱 （ High resolution time-of-flight mass spectrometer，HRTOFMS） 能够采集高质量分辨率和高准确度的全扫描数据，目标化合物数目没有任何限制。利用精确分子 量和同位素峰形还可对异常未知峰进行准确的定性分析。研究人员已经利用该技术建立了蔬菜、水果、 肉制品中有害物质的同时检测方法［1 ～ 7］，显示了其在高通量筛查应用中的巨大潜力，但是国内该方面相 关的报道还较少。
严丽娟1 张 洁* 2 潘晨松3 林立毅1 张欣怡3 申河清2
1 （ 厦门出入境检验检疫局，厦门 361012） 2 （ 中国科学院城市环境研究所 城市环境与健康重点实验室，厦门，361021）
3 （ 美国布鲁克道尔顿公司北京代表处，北京 100081）
摘 要 利用超高效液相色谱 / 高分辨飞行时间质谱，结合数据库，建立了乳制品中 20 种镇静剂的高通量筛 查方法。样品以乙腈和酸化乙腈沉淀蛋白质和脂肪，冷冻离心浓缩，经超高效液相色谱分离，采用电喷雾离子 源，正离子模式，基质匹配法进行定量分析，可在 9 min 内对 20 种镇静剂进行高通量筛查和定量分析。镇静 剂的质量浓度在 1 ～ 500 "g / L 或 5 ～ 1000 "g / L 范 围 内 具 有 较 好 的 线 性 关 系，检 出 限 为 0． 3 ～ 1． 5 "g / L， 定量限为 1 ～ 5 "g / L。在 5 和 50 "g / L 添加水平时，平均回收率为 76． 1% ～ 108． 2% ，相对标准偏差为 2． 5% ～ 9． 0% 。利用 TargetAnalysis 软件建立镇静剂数据库，并应用于加标样品的筛查分析。通过数据库比对，样品 中添加的镇静剂被全部筛查出来，鉴定准确度达到了 100% ，保留时间偏差小于 0． 1 min，质量偏差小于 3 mDa，同位素峰形匹配度大于 89． 5% 。利用本方法对购自超市的 8 个不同品牌的 50 余份乳制品进行了筛查 分析，均未检出阳性样品。
最优条件下的 20 种镇静剂的离子流谱图如图 1 所示。
表 1 20 种镇静剂的线性方程、相关系数、检出限和定量限 Table 1 Linear equations，correlation coefficients，limits of detection （ LOD） and limits of quantification （ LOQ） of twenty tranquilizers
序号 No．
名称 Name
1 唑吡旦 Zolpidem 2 利眠宁 Chlordiazepoxide 3 氯氮平 Clozapine 4 咪达唑仑 Midazolam 5 氟西泮 Flurazepam 6 氟哌啶醇 Haloperidol 7 硝西泮 Nitrazepam 8 氟硝西泮 Flunitrazepam 9 异丙嗪 Promethazine 10 艾司唑仑 Estazolam 11 安眠酮 Methaqualone 12 诺氟西汀 Norfluoxetine 13 奥沙西泮 Oxazepam 14 阿普唑仑 Alprazolam 15 利血平 Reserpine 16 三唑仑 Triazolam 17 氯丙嗪 Chlorpromazine 18 替马西泮 Temazepam 19 甲硫达嗪 Thioridazine 20 地西泮 Diazepam
镇静剂药物具有抑制躁狂、镇吐等作用，可能被添加到奶牛饲料中以促进采食，提高饲料转化率，并 缓解奶牛热应激，提高产奶量［8］。但是，这类药物的残留会造成过敏、心悸、肝损害等不良反应。农业 部第 176 号公告中明确禁止在动物饲料和饮用水中添加氯丙嗪、异丙嗪、地西泮、利血平等镇静剂［9］。 国标 GB / T22993-2008 也制定了乳制品中氯丙嗪和氟哌啶醇等 8 种镇静剂的检测方法［10］。鉴于我国食 品安全的现状，有必要对更多镇静剂进行监测。本研究以氯丙嗪、氟哌啶醇、地西泮和艾司唑仑等 20 种 镇静剂为例，发展了基于超高效液相色谱-飞行时间质谱技术，结合筛查数据库的高通量分析方法，成功 应用于乳制品的快速筛查，方法检出限等技术指标满足相关法规要求。
第 41 卷 2013 年 1 月
分析化学 （ FENXI HUAXUE） 研究报告 Chinese Journal of Analytical Chemistry
第1 期 31 ～ 35
百度文库
DOI： 10． 3724 / SP． J． 1096． 2013． 20555
超高效液相色谱-飞行时间质谱法 高通量筛查乳制品中 20 种镇静剂
为了最大限度消除基质效应干扰，本研究采用基质匹配法进行定量分析。以空白牛奶样品的提取 液配制 0． 1 ～ 1000 "g / L 系列混合标准溶液。镇静剂（ 除唑吡旦外） 的质量浓度在 1 ～ 500 "g / L 或 5 ～ 1000 "g / L 范围内具有较好的线性关系，检出限为 0． 3 ～ 1． 5 "g / L，定量限为 1 ～ 5 "g / L（ 表 1） 。在 5 和 50 "g / L 两个添加水平测定方法回收率及精密度，平均回收率为 76． 1% ～ 108． 2% ，相对标准偏差为 2． 5% ～ 9． 0% 。
图 1 20 种镇静剂的高分辨提取离子流图 Fig． 1 High resolution extracted ion chromatograms （ hrEIC，± 0． 003 Da） of twenty tranquilizers 峰号同表 1（ The peak numbers are the same as in Table 1） 。
线性范围 Linear range
（ "g / L）
1 ～ 100 1 ～ 500 5 ～ 1000 1 ～ 500 1 ～ 500 1 ～ 500 5 ～ 1000 5 ～ 1000 1 ～ 500 5 ～ 1000 5 ～ 1000 5 ～ 1000 5 ～ 1000 5 ～ 1000 1 ～ 500 5 ～ 1000 1 ～ 500 5 ～ 1000 1 ～ 500 5 ～ 1000
考察了 5 mmol / L 甲酸胺-甲醇、5 mmol / L 甲酸胺-乙腈、0． 1% 甲酸-甲醇和 0． 1% 甲酸-乙腈 4 种流 动相对镇静剂离子化效率和峰形的影响。甲酸胺体系可以获得较低的背景值，但是分析物的信号也较 低，严重影响了检测灵敏度。采用甲酸体系时，虽然背景值有所升高，但是分析物的信号显著增强，信噪 比比甲酸胺体系提高了 5 ～ 20 倍。与甲醇相比，采用乙腈作为流动相时可以获得更好的峰形，信号响应值 也略高。因此，本研究采用 0． 1% 甲酸-乙腈作为流动相，20 种镇静剂在 9 min 内可得到较好地分离（ 图 1） 。
对于奶粉等固体样品，准确称取 0． 6 g 粉末样品，加入 2 mL 超纯水充分溶解，其它处理步骤同液态奶。 2． 3 超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱的分析条件
Waters ACQUITY BEH 色谱柱（ 100 mm × 2． 1 mm i． d． ，1． 7 "m） 。流动相 A 为 0． 1% （ V / V） 甲酸溶 液，流动相 B 为 0． 1% （ V / V） 甲酸-乙腈溶液。梯度洗脱： 0 ～ 2 min，30% B； 2 ～ 9 min，30% ～ 72% B。流 速： 0． 30 mL / min； 柱温： 30 ℃ ； 进样器温度 4 ℃ ； 进样体积： 1 "L。电喷雾离子源（ ESI） ； 正离子模扫描模 式； 毛细管电压： 4． 5 kV； 雾化气： 150 kPa； 干燥气温度： 180 ℃ ； 干燥气流速： 6 L / min； 采集质量数范围 m / z 50 ～ 1000。三氟乙酸钠溶液作为外标以校正分子量。
2012-06-01 收稿； 2012-09-21 接受 本文系质检公益性行业科研专项课题（ No． 200910145） 和厦门市科技项目（ Nos． 3502Z20112017，3502Z20092009） 资助 * E-mail： jzhang@ iue． ac． cn
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分析化学
第 41 卷
第1 期
严丽娟等： 超高效液相色谱-飞行时间质谱法高通量筛查乳制品中 20 种镇静剂
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3． 3 精密度、线性关系和回收率 在基于 UPLC / HRTOF-MS 的高通量筛查研究中，保留时间的重现性和质量准确度是定性分析的关
键参数。加标样品重复进样 5 次，保留时间偏差均小于 0． 1 min，测定分子量偏差均小于 3 mDa。测定 分子量偏差越小，数据处理时可设置更窄的提取离子窗口，从而可更有效排除干扰化合物，实现更准确 的定性分析。另外，高质量准确度使得在无标样情况下对未知物定性成为可能，特别是针对镇静剂这类 分子量较小的化合物。例如，某化合物的实测分子量为 388． 1591，与氟西泮的理论分子量（ 388． 1586） 的偏差仅为 0． 5 mDa，而且同位素峰形匹配度为 98． 6% ，依据这些信息即可将该化合物定性为氟西泮。
司和德国 Dr． Ehrenstorfer 公司； 甲酸（ 纯度为 99% ，美国 Acros Organics 公司） ； 乙腈、甲醇（ HPLC 级，美 国 Merck 公司） 。 2． 2 样品前处理
准确移取 2 mL 液态奶于离心管中，加入 2 mL 乙腈，旋涡振荡提取 1 min，8000 g 离心5 min； 将上层 清液全部转移至新离心管中，加入 6 mL 酸化乙腈（ 0． 2% 甲酸，V / V） ，旋涡振荡 1 min，8000 g 离心5 min； 小心吸取 5 mL 上层清液至 15 mL 离心管； 浓缩至溶液体积小于 1 mL，全部转移到 1． 5 mL 离心管中继 续浓缩至近干； 加入 0． 3 mL 30% 乙腈溶液溶解提取物，经过 0． 22 "m 滤膜过滤，转移到装有内插管的样 品瓶中，分析前置于!20 ℃ 保存。
分子式 Formula
C19 H21 N3 O C16 H14 ClN3 O C18 H19 ClN4 C18 H13 ClFN3 C21 H23 ClFN3 O C21 H23 ClFNO2 C15 H11 N3 O3 C16 H12 FN3 O3
C17 H20 N2 S C16 H11 ClN4 C16 H14 N2 O C16 H16 F3 NO C15 H11 ClN2 O2 C17 H13 ClN4 C33 H40 N2 O9 C17 H12 Cl2 N4 C17 H19 ClN2 S C16 H13 ClN2 O2 C21 H26 N2 S2 C16 H13 ClN2 O
3 结果与讨论
3． 1 样品前处理条件优化 本研究采用乙腈和酸化乙腈沉淀蛋白质和脂肪，并结合高速离心，有效去除了乳制品中大量蛋白质
和脂肪，大多数镇静剂的提取率可达到 80% 以上。固相萃取柱常被用于进一步去除基质的干扰［2］，本 研究通过对比发现，对于这 20 种镇静剂，虽然在不经固相萃取柱净化的情况下存在一定的基质干扰，但 是高分辨飞行时间质谱完全可以实现待测物和干扰物的区分，而且采用基质匹配法拟合标准曲线也可 在一定程度上消除基质干扰。经过和不经过固相萃取柱净化的两种方法的定量准确度基本相当，并无 明显差异。 3． 2 超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱条件的优化
2 实验部分
2． 1 仪器与试剂 超高效液相色谱（ 美国 Waters 公司） ； 四极杆 / 飞行时间质谱（ 美国 Bruker 公司） ； Speedvac 离心浓
缩仪（ 美国 Thermo 公司） ； 高速离心机（ 德国 Hettich 公司） 。 氯丙嗪、氟哌啶醇、地西泮和艾司唑仑等 20 种镇静剂标准品（ 纯度 ＞ 98% ） ，购自美国 Cerilliant 公