10 限制性片段长度多态性实验(RFLP)
RFLP限制性片段长度多态性
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RFLP中应用的限制性内切酶
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限制性内切酶（restriction endonuclease）是一类具有 特殊功能的核酸切割酶，丌同的内切酶可辨认并作用亍特 异的DNA序列，并将 DNA切断。
常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ ,EcoRⅠ, EcoRV,XbaⅠ,而分子 记则有几个甚至上千个。分子 记 越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP 研究的主要目标之一。
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RPLF技术的原理
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利用特定的限制性内切酶识别并切割丌同生物个体的基因 组DNA，得到大小丌等的DNA片段，所产生的DNA数目 和各个片段的长度反映了DNA分子上丌同酶切位点的分布 情冴。 通过凝胶电泳分析这些片段，就形成丌同带，然后不兊隆 DNA探针迚行Southern杂交和放射显影，即获得反映个 体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制 性内切酶消化后产生片段在长度上差异。 由亍丌同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等 变化导致限制内切酶识别和酶切収生改变从而造成基因型 间限制性片段长度的差异。
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数据分析
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（一）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。 （二）在暗室内，将2张X光底片放入曝光暗盒，并用透明 胶代固定，合上暗盒。 （三）将暗盒置-70℃低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光 （根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。 （四）从冰箱中叏出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至 室温，然后冲洗X光底片（洗片时先洗一张，若感光偏弱， 则在多加两天曝光时间，再洗第二张片子）。（注：注意 同位素的安全使用）
限制性片段长度多态性
限制性片段长度多态性(Restriction Fragment of Length Polymorphism,RFLP)一基本原理各种限制性酶能识别特定的碱基序列，并将其切开。
碱基的变异可能导致切点的消失或新切点的出现，从而引起DNA片段长度和数量的差异。
用特定的限制性内切酶消化目标DNA并通过电泳将长度不同的片断分开，并印记于硝酸纤维滤膜上，再与相应的探针杂交，就可以检测限制性片段长度多态性(RFLP).二主要材料DNA抽提用试剂，限制性内切酶，dNTP及Taq聚合酶电泳用琼脂糖或聚丙烯酰胺配制试剂，PCR扩增仪，水浴锅，电泳仪和电泳槽，硝酸纤维素滤膜或尼龙膜，探针标记物等。
三方法步骤(图1)图1(一) 样本DNA制备采用常规DNA抽提的方法或DNA抽提试剂盒提取样本DNA，置低温下保存。
对大多数样本而言，用于分析的样本DNA片段须先从总DNA中分离获取，并制备足够的量。
为此，RFLP分析常先用PCR方法扩增目标片段。
无论怎么做，必须保证DNA样本的纯度，这一点是非常重要的。
(二) 限制性内切酶降解样本DNA根据不同的目标DAN，选择合适的限制性内切酶。
目前常用的限制性内切酶有EcoRⅠ和HindⅢ等。
该步骤必须保证酶解完全。
如果有必要，可以用琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭分析酶解结果。
酶解的时间根据实际情况而定。
(三) 电泳电泳的主要目的是把DNA片段按大小(长短)分离开来，得到一个根据分子量排列的连续带谱。
电泳可采用琼脂糖凝胶电泳，也可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。
时间由几小时到24小时不等。
(四) 转印所谓转印，就是将已经电泳的DNA片段通过一定的方法转到固相支持物上。
常用的固相支持物有硝酸纤维素滤膜或尼龙膜。
转印前需经过碱变性溶液处理，将双链DNA变性为单链DNA。
转印的方法一般有三种。
根据DNA分子的复杂度转移2―12小时。
1 盐桥法；也叫毛细管转移法。
先把硝酸纤维素滤膜放在20×SSC 溶液中浸透，然后把滤膜平铺在凝胶上，再在滤膜上放上浸过20×SSC溶液的滤纸3张，再在该滤纸层上铺上干燥的滤纸3张，由于滤纸的吸附作用，胶下的缓冲液透过凝胶被吸附上来，同时胶中的DNA 分子就转移到滤膜上。
基因工程习题
基因工程习题及参考答案02工具酶部分——限制性内切核酸酶一、填空题1．严格地说限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)是指已被证明是的酶。
基因工程中把那些具有识别的内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶。
2．年Luria 和Human 在T 偶数噬菌体对大肠杆菌感染实验中首次发现了细菌的现象。
3．1970 年，Smith 和Wilcox 从流感嗜血杆菌中分离到一种限制酶，能够特异性的切割DNA，这个酶后来被命名为，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。
4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的。
5．Ⅱ类限制性内切核酸酶分子量较小．一般在20~40kDa，通常由亚基所组成。
它们的作用底物为双链DNA，极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA，或DNA／RNA 杂合双链。
这类酶的专一性强，它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求，而且对更远的碱基也有要求，因此，Ⅱ类酶既具有专一性，也具有专一性，一般在识别序列内切割。
切割的方式有，产生末端的DNA 片段或的DNA片段。
作用时需要作辅助因子，但不需要和。
6．完全的回文序列具有两个基本的特点，就是：(1)(2) 。
7．Ⅱ类限制性内切核酸酶一般识别个碱基，也有识别多序列的限制性内切核酸酶。
根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析，限制性内切核酸酶识别序列具有倾向，即它们在识别序列中含量较高。
8．EcoK 是I 类限制性内切核酸酶，分子组成是α2 β2 γ，分子量300kDa。
在这些亚基中，α亚基具有作用；β亚基具有的活性；γ亚基的作用则是。
9．个体之间DNA 限制性片段长度的差异叫。
10．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自，第二、第三两个字母取自，第四个字母则用表示。
11．限制性内切核酸酶Acy I 识别的序列是5’—GRCGYG-3’，其中R ，Y 。
RFLP
限制性片段长度多态性（RFLP，Restriction Fragment Length Polymorphism）RFLP技术于1980年由人类遗传学家Bostein提出。
它是第一代DNA分子标记技术。
Donis—Keller利用此技术于1987年构建成第一张人的遗传图谱。
DNA 分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。
RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。
RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。
所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。
当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。
分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。
分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。
不同限制性内切酶切割基因组DNA后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。
常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子标记则有几个甚至上千个。
分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。
构建饱和图谱是 RFLP 研究的主要目标之一。
1 原理该技术是利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生限制性片段的特性，对于不同种群的生物个体而言，他们的DNA序列存在差别。
如果这种差别刚好发生在内切酶的酶切位点，并使内切酶识别序列变成了不能识别序列或是这种差别使本来不是内切酶识别位点的DNA序列变成了内切酶识别位点。
(整理)限制性内切核酸酶
第三章限制性内切核酸酶一、填空题1. 严格地说限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)是指已被证明是的酶。
基因工程中把那些具有识别的内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶。
2.年Luria和Human在T偶数噬菌体对大肠杆菌感染实验中首次发现了细菌的现象。
3.1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制酶，能够特异性的切割DNA，这个酶后来被命名为，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。
4.通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的。
5.Ⅱ类限制性内切核酸酶分子量较小．一般在20~40kDa，通常由——亚基所组成。
它们的作用底物为双链DNA，极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA，或DNA／RNA杂合双链；这类酶的专一性强，它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求，而且对更远的碱基也有要求，因此，Ⅱ类酶既具有专一性，也具有专一性，一般在识别序列内切割。
切割的方式有，产生末端的DNA片段或的DNA片段。
作用时需要——作辅助因子，但不需要和6.完全的回文序列具有两个基本的特点，就是：和7.Ⅱ类限制性内切核酸酶一般识别个碱基，也有识别多序列的限制性内切核酸酶；根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析，限制性内切核酸酶识别序列具有倾向，即它们在识别序列中含量较高。
8.EcoK是I类限制性内切核酸酶，分子组成是_______ 分子量是300kDa.在这些亚基中，α亚基具有作用；β亚基具有的活性;γ亚基的作用则是，9.个体之间DNA限制性片段长度的差异叫10.限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自，第二、三两个字母取自，第四个字母则用表示。
11.限制性内切核酸酶AcyI识别的序列是5’-GRCGYG-3’，，其中R，Y12.在酶切反应管加完各种反应物后，需要离心2秒钟，其目的是和13.部分酶切可采取的措施有：(1)(2)(3)等。
DNA鉴定方法
DNA鉴定方法DNA鉴定方法DNA鉴定是一种通过对DNA序列的比较分析，确定个体之间的亲缘关系或确认身份的方法。
DNA鉴定在刑侦、亲子鉴定、遗传病诊断等领域有广泛应用。
本文将介绍DNA鉴定的基本原理和常用方法。
DNA鉴定的原理在于人类DNA的独特性和遗传性。
DNA是一种包含遗传信息的分子，由四种碱基（腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶）组成，它们按照一定的规则排列成两条螺旋状的链。
每个人的DNA序列都是独一无二的，除了一些双胞胎之外。
鉴定方法主要利用DNA的这种独特性，通过比较个体的DNA序列，确定是否具有亲缘关系或是否为同一人。
常用的DNA鉴定方法包括：1. RFLP（限制性片段长度多态性）分析：RFLP分析是DNA鉴定的经典方法之一。
它通过利用限制性内切酶将DNA切割成多个不同长度的片段，然后使用凝胶电泳将这些片段进行分离，并利用射入探针的杂交方法进行检测。
不同个体之间的DNA序列差异会导致不同的片段长度，从而可以通过比较片段长度来确定个体之间的亲缘关系。
2. PCR（聚合酶链式反应）分析：PCR是一种快速有效的DNA复制技术，可以从微量DNA中扩增出足够数量的DNA片段用于分析。
PCR分析常用于亲子鉴定、法医学和遗传病诊断。
PCR分析通常配合其他技术如序列分析、飞行时间质谱和DNA芯片等来进行。
3. STR（短串联重复）分析：STR分析是目前最常用的DNA 鉴定方法之一。
STR序列是由2-6个碱基重复单元组成的，不同个体之间的STR序列重复单元数目存在差异。
STR分析通过PCR扩增DNA片段，然后利用凝胶电泳分离，并通过比较STR重复单元数目来鉴定个体之间的亲缘关系或身份。
DNA鉴定的过程包括取样、提取DNA、扩增DNA片段、分离和检测。
取样可以采用血液、口腔拭子、毛发等样品。
提取DNA需要将样品中的DNA从细胞核和细胞器中分离出来。
DNA扩增通过PCR技术，可以在短时间内从微量DNA样品中复制出大量DNA片段。
RFLP名词解释
RFLP名词解释RFLP是限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism）的缩写，是一种分子生物学技术，常用于分析DNA样本中的基因型。
下面对RFLP进行详细解释，包括其原理、应用和优缺点。
RFLP技术是基于DNA序列的差异来检测个体间的基因型差异。
它利用了DNA序列中的限制性内切酶剪切位点的多态性，通过对DNA样本进行酶切和凝胶电泳，分析得到的DNA片段长度的差异来判断个体的基因型。
RFLP技术的原理如下：1. 获取DNA样本：从个体的细胞中提取DNA样本，可以通过多种方法如血液、唾液、组织样本等获得。
2. DNA酶切：用特定的限制性内切酶对DNA样本进行酶切。
限制性内切酶是一种具有特异性的酶，它会识别和切割特定的DNA序列。
如果个体的DNA序列中存在特定的切割位点，则酶切会产生不同长度的DNA片段。
3. 凝胶电泳：将经过酶切的DNA样本加载到凝胶电泳槽中，经过电场离子迁移，分离出不同长度的DNA片段。
4. 可视化和分析：通过染色或探针杂交等方法，对电泳结果进行可视化，并进行分析确定DNA片段的长度。
RFLP技术得以应用于诸多领域，具有以下几个主要的应用方面：1. 遗传病分析：RFLP技术可以用于检测导致遗传病的基因突变。
通过分析DNA序列中的限制性内切酶位点是否发生改变，可以确定个体是否携带突变基因，并判断其患病风险。
2. 亲子鉴定：利用RFLP技术可以对个体的DNA样本进行比对，确定亲子关系。
通过对父母和子女DNA样本的酶切和电泳分析，可以判断是否存在一致的DNA片段长度，从而确定亲子关系。
3. 种群遗传学研究：通过对不同个体的DNA样本进行RFLP 分析，可以判断不同个体之间的基因型差异，从而对种群内的遗传多样性进行研究，了解不同种群的遗传背景及遗传演化。
4. 进化与系统发生关系研究：RFLP技术可以用于研究不同物种或亚种之间的进化关系。
限制性内切核酸酶习题及答案
6.通过限制性片段分析，可以对等位基因进行精确的分析比较，其原因是：( ) (a)限制性内切核酸酶只切割两个变异等位基因中的—个 (b)它利用限制性位点作为遗传标记 (c)一个特定细胞中等位基因的核苷酸序列不会是相同的 (d)它不依赖于变异等位基因产物的功能。 (e)限制性内切核酸酶的切点被限制在 DNA 的编码区域内
(a)S1 单链核酸酶 (b)末端转移酶 (c)碱性磷酸酶 (d)Bal31 核酸酶
16 限制性内切核酸酶可以特异性地识别： ( )
(a)双链 DNA 的特定碱基对 (b)双链 DNA 的特定碱基序列
(c)特定的三联密码
(d)以上都正确
17 在下列酶中，催化反应不需要 ATP 的是( )
(a)EcoK (b)EcoB (c)T4DNA 连接酶 (d)BamHI
7.限制性片段长度多态性(RFLP)是：( ) (a)用于遗传的“指纹结构”模式分析的技术 (b)二倍体细胞中的两个等位基因限制性图谱的差别 (c)物种中的两个个体限制性图谱间的差别 (d)两种物种个体间的限制性图谱差别 (e)两种酶在单个染色体上限制性图谱的差别
8.为了正确地构建一个真核基因组的物理图谱：( )。 (a)必须有可能清晰地分离各个染色体(通过脉冲场凝胶电泳)
18 下列关于限制性内切核酸酶的表示方法中，正确一项的是(
(a)Sau 3A I (b)E．coR I (c)hindⅢ (d)Sau 3A 1
19 限制性内切核酸酶的星号活性是指：( )
(a)在非常规条件下，识别和切割序列发生变化的活性
(b)活性大大提高
(c)切割速度大大加快
rflp的基本原理
rflp的基本原理RFLP是指限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism），是一种基于DNA序列的分子生物学技术。
它可以检测DNA序列中存在的多态性，即不同个体之间的DNA序列差异。
RFLP技术被广泛应用于基因组学、遗传学、医学等领域。
一、RFLP的基本概念1.1 限制性酶限制性酶又称为切割酶，是一种能够识别特定DNA序列并将其切割成特定长度片段的酶。
1.2 片段长度多态性片段长度多态性指的是同一基因在不同个体中由于存在不同位点上的限制性酶切割位点而产生不同大小的DNA片段。
二、RFLP技术流程2.1 DNA提取和纯化首先需要从样品中提取出DNA，并进行纯化处理，以保证后续实验中得到高质量的DNA样品。
2.2 限制性酶切割将提取出来的DNA与特定的限制性酶进行反应，使其在特定位点上进行切割形成DNA片段。
2.3 凝胶电泳分离将反应后得到的DNA片段通过凝胶电泳进行分离，根据片段长度的不同，在凝胶中形成不同大小的DNA条带。
2.4 转膜将凝胶上的DNA条带转移到膜上，以便进行进一步的检测和分析。
2.5 探针杂交使用特定的DNA探针与转移后的DNA片段进行杂交反应，通过探针与DNA片段之间的互补配对来检测目标基因是否存在多态性。
2.6 检测和分析通过显色、放射自显影等方法来检测和分析DNA条带，确定目标基因在不同个体中是否存在多态性。
三、RFLP技术优缺点3.1 优点（1）可以检测到基因组中存在的多态性，有助于研究遗传疾病、物种起源等问题；（2）技术成熟，操作简单易行；（3）对样品来源没有特殊要求，可以从各种生物体中提取DNA样品进行检测。
3.2 缺点（1）需要使用大量限制性酶，并且每个限制性酶只能识别特定的DNA序列，对于大规模筛查较为困难；（2）需要使用放射性标记的探针进行检测，存在一定的危险性；（3）需要较长时间进行实验操作，不适用于快速筛查。
限制性片段长度多态性课件
在法医学中的应用
限制性片段长度多态性在法医学中发挥了重要作用，它可以帮助解决犯罪案件和 身份识别问题。
通过分析犯罪现场留下的DNA样本，限制性片段长度多态性分析可以提供有关嫌 疑人的遗传信息，有助于缩小嫌疑人范围或确认身份。此外，它还可以用于失踪 人员身份的鉴定和遗产纠纷等问题的解决。
限制性片段长度多态性的实验
限制性片段长度多态 性课件
目录
• 限制性片段长度多态性概述 • 限制性片段长度多态性的应用 • 限制性片段长度多态性的实验技术 • 限制性片段长度多态性与疾病关联
研究 • 限制性片段长度多态性的研究展望
01 限制性片段长度多态性概述
定义与特点
定义
限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）是一种基于限制性酶切和电泳技术检测DNA片段长度变异的方法。
环境因素与疾病关联研究
环境因素对疾病的发生和发展起着重 要作用。
RFLP技术可以用于研究环境因素与特 定RFLP位点的关联，有助于揭示环境 因素对疾病的影响和作用机制。
限制性片段长度多态性的研究
05
展望
新技术的应用
基因组学技术
随着基因组学技术的不断发展， 如全基因组关联分析、基因组测 序等，将有助于更深入地研究限 制性片段长度多态性的遗传机制
03
技术
酶切技术
01
限制性酶切
使用限制性酶对DNA进行切割，产生特定长度的DNA 片段。
02
酶切位点
限制性酶具有特定的识别和切割序列，从而产生具有特 定末端的DNA片段。
03
酶切效率
限制性酶的切割效率受多种因素影响，如DNA序列、酶 浓度和反应温度等。
rflp的具体流程
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几种常用的分子标记.
RAPD标记的特点： 1.RAPD标记引物扩增产物所扩增的DNA区段是事
先未知的，具有随机性和任意性，因此随机引物PCR标 记技术可用于对任何未知基因组的研究。
2.RAPD标记的不足之处是，一般表现为显性遗传， 不能区分显性纯合和杂合的基因型，因而提供的信息 量不完整。
0.2kb 0.5kb
0.2kb 0.5kb
0.3kb
0.3kb ×
品系1 品系2
0.5kb 0.3kb 0.2kb
S451对DH962×冀棉5号F2群体扩增图
RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可 用于构建基因组指纹图谱。
1.品种鉴定、系谱分析：用于识别种群、家族、 种内或 种间的遗传变异，为生物血缘关系或分类提供依据，还可以 分析混合基因组样品等。
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头 （c）寡核苷酸接头与限制片段连接 （d）用选择性引物进行PCR扩 增
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四、简单序列重复（SSR）标记
又称微卫星，是一类由几个（一般2-6个）核苷酸为 重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。如 (CA)n、(AT)n、(GGC)n等。
微卫星DNA的简单序列的重复次数在同一物种的不同 品种或不同个体中存在较大的差异，即微卫星座位上存在 丰富的等位基因。如在水稻中，RFLP座位的等位基因数 为2-4个，而SSR的等位基因数为2-25个。
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三、扩增片段长度多态性（AFLP）标记
AFLP标记，是结合RFLP和PCR的优点发明的一种 DNA指纹技术。通过对基因组DNA酶切片段的选择性扩 增来检测DNA酶切片段长度的多态性 。
生物分子检测名词解释
Affinity：亲和力，抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原决定簇之间相适应而存在着的引力，是抗原抗体间固有的结合力。
Agglutination：凝集反应，细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物的过程。
Avidity：亲和力，抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原决定簇之间相适应而存在着的引力，是抗原抗体间固有的结合力。
Blocking：封闭，是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。
Blotting：印迹，就是将电泳分离后的琼脂糖凝胶中核酸片段转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上的过程，转移后核酸片段保持相对位置不变。
Coating：包被，即将抗原或抗体连接到固相载体上的过程。
ELISA：酶联免疫吸附测定是一种抗原（或抗体）固相化后，与待测抗体（或抗原）及酶标记抗体形成复合物，底物被酶催化成有色物质，产物的量与样本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析的免疫测定法。
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay：酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种抗原（或抗体）固相化后，与待测抗体（或抗原）及酶标记抗体形成复合物，底物被酶催化成有色物质，产物的量与样本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析的免疫测定法。
Gene Chip：基因芯片又称DNA 芯片、生物芯片，在一张固相支持介质上同时固定成百上千个核酸片段，再将扩增的核酸样品与之杂交，反应结果用同位素法、化学荧光法、化学发光法或酶标法显示，然后用精密的扫描仪或CCD摄像技术记录，通过计算机软件分析，综合成可读的总信息，是集成化的核酸分子杂交技术。
HA：血凝素，是由3 条糖基化多肽分子以非共价形式聚合而成的三聚体，其C 末端有一疏水区插入病毒囊膜的双层脂质膜中，是与病毒囊膜的结合部位。
HI：血凝抑制，先将可溶性抗原与特异性抑制血球凝集的血清(抗体) 混合，隔一定时间后加入“致敏红细胞红”(细胞表面吸附可溶性抗原)，则不再与相应抗体发生凝集现象的过程。
限制性片段长度多态性实验(RFLP)
实验限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) 一、实验目的学习和掌握限制性片段长度多态性（RFLP）遗传标记的基本原理和检测方法。
二、实验原理第一代分子遗传标记RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失、重排等，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过PCR，酶切及琼脂糖凝胶电泳进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），RFLP已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类、遗传多样性等研究。
三、仪器、材料与试剂（一）仪器：电热恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳及检测系统（二）材料与试剂：Hind Ⅲ限制性内切酶，10×M Buffer，待分析的PCR产物，DL2000 DNA Marker，6×Loading Buffer（上样缓冲液）,灭菌双蒸水,1.5%琼脂糖凝胶（注意：含溴化乙锭EB，致癌，请带手套操作），0.5%TBE（电泳缓冲液）。
四、实验步骤1、Hind Ⅲ限制性内切酶酶切反应体积（10μl），在0.2ml Eppendorf管中依次加样：10xM buffer 1 μLddH2O 5.5 μLHind Ⅲ0.5 μLPCR产物 3 μL37℃水浴消化2h ，消化产物全部用于琼脂糖检测。
2、琼脂糖凝胶电泳配置1.5%琼脂糖凝胶，取10μl 酶切产物+1μl 上样缓冲液,180V 恒压电泳。
DNA 带负电荷，电泳时DNA 从负极向正极泳动。
待泳动至凝胶的1/2~2/3位置时，停止电泳，紫外检测仪下观察。
五、作业写出本实验的具体操作过程并描述你所观察到的结果。
（画图）M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Hind Ⅲ内切酶识别位点：A ↓AGCTTTTCGA ↑A ABAA BB 2000 7505002501000100。
rflp标记的名词解释
rflp标记的名词解释RFLP是"Restriction Fragment Length Polymorphism"（限制性片段长度多态性）的缩写，是一种基因分型技术，用于研究DNA序列的差异性。
通过观察DNA片段的长度变化，RFLP可以帮助人们了解基因座在个体之间的多态性，从而提供了一种分子遗传分析的方法。
一、RFLP的原理RFLP技术基于DNA序列的变异，而DNA的变异表现为序列中的一处或多处核苷酸序列发生突变。
这些变异会导致限制性内切酶切割DNA序列时产生不同的片段长度。
通过将DNA进行限制性内切酶消化，再通过凝胶电泳技术分离DNA片段，并通过特定的探针杂交以检测特定的片段，就可以确定个体之间的差异。
二、RFLP技术的应用1. 生物学研究：RFLP技术被广泛应用于生物学研究中，特别是用于研究种群遗传学、亲子关系以及进化等方面。
通过分析特定基因座的RFLP分型，可以推测个体或群体之间的亲缘关系、种群的遗传多样性以及基因座的分布情况，为生物学研究提供了宝贵的遗传数据。
2. 遗传疾病检测：RFLP技术在遗传疾病的检测与诊断中也有重要的应用。
许多遗传疾病与特定的基因突变有关，通过分析这些突变引起的RFLP变异，可以确定某些疾病的患病风险。
例如，围绝经期乳腺癌与BRCA1基因的RFLP分型相关，通过进行RFLP分析，可以预测遗传性乳腺癌的风险。
三、RFLP的优缺点1. 优点：RFLP技术在技术成熟的同时，具有高度可靠性和准确性。
通过分析特定基因座的RFLP分型，可以得出有关个体间遗传关系、多态性以及基因特征等信息。
此外，RFLP技术还具有较高的灵敏度，能够检测到充分稀释的DNA样本。
2. 缺点：然而，RFLP技术也存在一些局限性。
首先，该技术要求大量的DNA 样本，通常需要提取和纯化大量高质量的DNA，这在某些情况下可能是困难的。
此外，从样本收集到结果分析需要较长的时间，限制了该技术应用于实时或紧急情况的能力。
生物化学实验中RFLP技术及其应用
生物化学实验中RFLP技术及其应用一．概述RFLP是英文Restriction Fregrmeat Length Polymorphisms的缩写，意思是“限制性片段长度多态性”。
它是随着生物技术若干领域的发展而产生的一种分子标记技术，用该技术可作出植物的RFLP图谱，这对于植物遗传和育种研究都有重要的意义［1］。
分子标记，从本质上说，是以染色体DNA上特定的核苷酸序列作为标记。
染色体DNA 由四种核昔酸组成；而这四种核苷酸的不同主要是由于组成核苷酸的碱基不同。
所以，如果将染色体的DNA纤丝比喻成一条马路，那么这四种核苷酸(或其对应的四种碱基）就是铺成这条马路的四种花色的石头。
一般而言，在马路的任一路段这些石头的排列顺序都会完全一样，故此这种特异的排列顺序就成了这条马路天然的里程碑，一旦我们将某个性状与该特异的顺序联系起来，那么控制该性状的基因就自然被定位于染色体上的这一区段。
那么植物基因组的尽RFLP分析是如何进行的呢？先说一下限制性片段的获得及其长度分析。
限制性内切酶是一类具有特殊功能的核酸切割酶，不同的内切酶可辨认并作用于特异的DNA序列，并在此将DNA切断，而该序列在染色体DNA上不只一次地出现，所以，一条完整的DNA 链被酶切后会断成长度不同的多种片段，统称限制性片段。
这些片段本身都带有一定的电荷，当它们的混合液被点到凝胶板上并在胶片两例加有电压时，这些片段就会在电场的作用下穿过凝胶的孔隙面移动，我们称之为电泳。
DNA片段越短越容易穿过这些孔隙，运动速度越快，一段时间之后这些混合液就会沿电场方向分成了数个小的集团，最短的片段在最前面，最长的片段自然留在最后面。
在这种情况不对胶板上的DHA进行染色，便可显示出数条带，与对照样品的带纹相比，也就知道了各条带处DNA片段的长度，应该指出的是，大多数作物的基因组都很大，酶切后可形成多种长度的DNA片段，电泳后不同长度的片段连成—片，难以区分，这时就需要在这些片段中再做标记，并通过探针将其显示出来。
RFLP限制性片段长度多态性
❖ 第二代分子标记技术
RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，随机
扩增多态性DNA ）
AFLP （Amplified Fragment Length Polymorphism，
扩增片断长度多态性）
❖ 事实上，还有很多分子标记技术像SSR、ISSR、SRAP （相关序列扩增多态性）另外，还有现在号称为第三代分 子标记的SNP（ 单核苷酸多态性)
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数据分析
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❖ （一）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。
❖ （二）在暗室内，将2张X光底片放入曝光暗盒，并用透明 胶代固定，合上暗盒。
❖ （三）将暗盒置-70℃低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光 （根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。
❖ （四）从冰箱中取出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至 室温，然后冲洗X光底片（洗片时先洗一张，若感光偏弱， 则在多加两天曝光时间，再洗第二张片子）。（注：注意 同位素的安全使用）
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RFLP的类型
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❖ 1.点的多态性
表现为DNA链中发生单个碱基的突变，且突变导致一个原有
酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点。Southern杂交
即可诊断。
❖ 2.序列多态性
①由于DNA 顺序上发生突变如缺失、重复、插入所致。
②由于高变区（highly variable region ）内串联重复顺序 的拷贝数不同所产生的，其突出特征是限制性内切酶识别 位点本身的碱基没有发生改变，改变的只是它在基因组中 的相对位置。
❖ DNA是沿与凝胶平面垂直的方向移出并转移到膜上，因此， 凝胶中的DNA片段虽然在碱变性过程已经变性成单链并已 断裂，转移后各个DNA片段在膜上的相对位置与在凝胶中 的相对位置仍然一样，故而称为印迹（blotting）。
RFLP,RAPD,ALFP,SSR的原理及示意图
1.RFLP限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP) 技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。
因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。
技术路线：缺点：RFLP分析对样品纯度要求较高，样品用量大，且RFLP多态信息含量低，多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量，加之RFLP分析技术步骤繁琐、工作量大、成本较高，所以其应用受到了一定的限制RFLP原理图示：2.RAPD原理：RAPD技术的全称是随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA)，此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物，对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。
由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR。
单一引物与反向重复序列结合。
使重复序列之间的区域得以扩增。
引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。
原理示意图：若位点2处碱基发生改变，则技术路线：RAPD的缺点：RADP图谱中某些弱带重复性较差，而且目前该法在引物长度和序列及应用的引物数目、扩增反应条件等实验技术方面未标准化，影响了不同条件下结果的可比性；每个标记含有的信息量小；有假阳性或假阴性结果；显性标记，无法区分从一个位点扩增的DNA片段是纯合的还是杂合的，无法进行等位基因分析。
用在种以上类群间的比较时无法得到可靠的遗传距离3.AFLP原理：AFLP的全称是扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism）,此技术是建立在基因组限制性片段基础上的PCR 扩增。
RFLP,EST,RAPD,AFLP,微卫星SSR,线粒体DNA标记
1.RFLP限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP) 技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。
因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。
技术路线：不同个体DNA的提取PCR扩增目的片断酶切凝胶电泳分开DNA片段转膜Southern杂交数据分析缺点：RFLP分析对样品纯度要求较高，样品用量大，且RFLP多态信息含量低，多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量，加之RFLP分析技术步骤繁琐、工作量大、成本较高，所以其应用受到了一定的限制RFLP原理图示：2.RAPD原理：RAPD技术的全称是随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA)，此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物，对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。
由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR。
单一引物与反向重复序列结合。
使重复序列之间的区域得以扩增。
引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。
原理示意图：若位点2处碱基发生改变，则技术路线：选择随机引物DNA的提取PCR反应凝胶电泳图谱分析RAPD的缺点：RADP图谱中某些弱带重复性较差，而且目前该法在引物长度和序列及应用的引物数目、扩增反应条件等实验技术方面未标准化，影响了不同条件下结果的可比性；每个标记含有的信息量小；有假阳性或假阴性结果；显性标记，无法区分从一个位点扩增的DNA片段是纯合的还是杂合的，无法进行等位基因分析。
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实验六、限制性片段长度多态性
(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)
一、实验目的
学习和掌握限制性片段长度多态性（RFLP）遗传标记的基本原理和检测方法。
二、实验原理
第一代分子遗传标记RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失、重排等，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过PCR，酶切及琼脂糖凝胶电泳进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），RFLP已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类、遗传多样性等研究。
三、仪器、材料与试剂
（一）仪器：电热恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳及检测系统
（二）材料与试剂：Hind Ⅲ限制性内切酶，10×M Buffer，待分析的PCR产物，DL2000 DNA Marker，6×Loading Buffer（上样缓冲液）,灭菌双蒸水,1.5%琼脂糖凝胶（注意：含溴化乙锭EB，致癌，请带手套操作），0.5%TBE（电泳缓冲液）。
四、实验步骤
1、Hind Ⅲ限制性内切酶酶切
反应体积（10μl），在0.2ml Eppendorf管中依次加样：
10xM buffer 1 μL
ddH2O 5.5 μL
Hind Ⅲ0.5 μL
PCR产物 3 μL
37℃水浴消化2h，消化产物全部用于琼脂糖检测。
2、琼脂糖凝胶电泳
配置1.5%琼脂糖凝胶，取10μl 酶切产物+1μl 上样缓冲液,180V 恒压电泳。
DNA 带负电荷，电泳时DNA 从负极向正极泳动。
待泳动至凝胶的1/2~2/3位置时，停止电泳，紫外检测仪下观察。
五、作业
写出本实验的具体操作过程并描述你所观察到的结果。
（画图）
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Hind Ⅲ内切酶识别位点：A ↓AGCTT
TTCGA ↑A AB
AA BB 2000 750
500
250
1000
100。