硝酸还原酶活性的测定

3.1%对氨基苯磺酸 对氨基苯磺酸1g，加浓盐酸25mL，用 蒸馏水定容至100mL；共配制2次， 200mL
4.0.2%α-萘胺 α-萘胺0.2g，加冰乙酸25mL，用蒸馏水 定容至100mL；共配制2次，200mL
5.30%三氯乙酸 三氯乙酸30g，用蒸馏水定容至100mL
五、操作步骤
1．酶反应和酶活性的测定
硝酸还原酶活性的测定
一、目的
❖ 硝酸还原酶（NR）是硝酸盐同化中第一个酶， 也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。 它与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量 和品质有重要影响，因而硝酸还原酶活性被 当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可 作为品种选育的指标之一。
❖ 通过本实验可以初步掌握测定硝酸还原酶活 性的原理和方法。
测吸光光度值
显色反应
取1mL
绘制亚硝酸钠 标准曲线
计算含量
六、结果与计算
❖ 把在标准曲线上查得的NaNO2含量代入下式， 计算硝酸还原酶活性：
NaNO2含量(µg) ×稀释倍数 NR活性[NaNO2(µg)/鲜重(g)·h]=
样品重(g)×时间(h)
七、思考题
❖ 1．为什么要将加有样品和试剂的三角瓶放入 真空干燥器抽气？
(按顺序加试剂)
试管号
123456
5µg/mL NaNO2 ，mL 0 0.2Байду номын сангаас0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水 ，mL
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
1%磺胺，mL
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
0.2%α-萘胺，mL
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
取样 称量、编号 加缓冲溶液 暗处保温 抽气
1．材料 小油菜
2．仪器 （1）天平 （2）注射器 （3）试管 （4）50mL三角瓶×3 （5）恒温箱 （6）分光光度计
四、试剂
1.亚硝酸钠标准溶液——5μg/mL NaNO2 0.1g定容至100mL，取其中2.5mL稀 释定容至500mL，即为5μg/mL浓度的NaNO2 标准液
2.硝酸钾标准溶液——0.2mol/L KNO3 2.02g用磷酸缓冲溶液稀释定容至 100mL，即为0.2mol/L的KNO3标准液
❖ 离体法需将材料磨成匀浆，经过滤或离心除 去残渣，以上清液为硝酸还原酶粗酶液进行 测定。由于研磨中NADH受损失，必需外加 NADH方可测定。
❖ 活体法直接用鲜活组织进行测定。环境中的 NO3-进入细胞后，被硝酸还原酶还原成NO2并扩散到细胞外在溶液中积累，测定溶液中 NO2-的含量即可得知硝酸还原酶活性的大小。
将实验材料使用打孔器打成圆片，混合均
匀后分别称取2份，每+ 份1g左右，编号后按 表2加入各种试剂：
三角瓶号 0.2mmol/L磷酸缓冲液（mL） 0.2mmol/LKNO3溶液（mL） 30%三氯乙酸（mL）
1
2
4.0 4.0
5.0 5.0
1.0 0
在针筒中进行反复抽气，直到放气后叶片变 软并沉入溶液；将针筒中混合溶液和叶片取 出放入编号三角瓶中，在30℃、暗条件下保 温30min；取出后立即向2号瓶加入1mL 30% 三氯乙酸以终止酶反应。
活性呈正相关。NO2-含量可用磺胺显色法测 定，即在酸性条件下与对-氨基苯磺酸胺发生 重氮反应，生成的重氮化合物又与N-萘基乙 二胺盐酸盐（或α-萘胺）生成红色偶氮化合 物，可在520nm下比色测定。
植物
对-氨基苯磺酸胺
NO3-
NO2-
重氮化合物
α-萘胺
比色
红色偶氮化合物 520nm
三、实验材料、仪器
❖ 然后分别吸取上清液1mL于另一试管中， 各加入2mL 1%对氨基苯磺酸和2mL 0.2% α萘胺（注意顺序），室温显色30min后测定 520nm波长下的光密度
❖ 用2号管溶液光密度平均值减去1号管溶液 的光密度，得到的值在标准曲线上查出相应 的NaNO2含量（μg）
2．标准曲线的制作
取6支干净试管，编号，按表1加入试剂：摇匀后 在室温下放置30min，然后在520nm波长下测定 光密度，以亚硝酸含量和光密度值绘制标准曲线
❖ 2．为什么1号三角瓶在加入样品之前就要先 加入1.0ml 30%三氯乙酸？
❖ 活体法不破坏细胞原有的酶反应系统，NADH 可由代谢反应不断生成，无需外加。活体法 简便、快速，不需要贵重仪器设备及低温条 件，但重复性欠佳，应作一定量的重复。
❖ 本实验采用活体法测定硝酸还原酶活性。
二、原理
❖ 硝酸还原酶可将NO3-还原成NO2-：
❖ NO3-+NADH+H+ NR NO2- +NAD + +H2O ❖ 在一定条件下，NO2-的生成量与硝酸还原酶