第一章 基因工程的分子遗传学原理
分子生物学原理--基因工程PPT资料41页
限制性内切酶的应用
限制性 内切酶
切载体 切目的基因
要点：避免切断目的基因
相同粘性末端 两者相连
24.03.2020
分子生物学原理
载体和目的基因的连接
• 人工连接器：linker 人工合成的寡核苷酸，安置有限制性内 切酶的识别序列。
• DNA连接酶：可用于连接碱基互补的二 段核酸链。
• 连接方式： 粘端连接方式 尾接法
24.03.2020
分子生物学原理
限制性内切酶的应用
• Alu I 平端
….AGCT….. ….AG CT... …..TCGA….. ….TC GA...
•BamH I …GGATCC… ...G GATTC… 粘性 TAGG… …CCTAAG G… 末端
24.03.2020
分子生物学原理
24.03.2020
分子生物学原理
• 转化： 由外来 DNA引 起生物 类型改 变的过 程称为 转化。
24.03.2020
转化
细菌的转化
分子生物学原理
转化
• 病毒癌基因 感染宿主细 胞后，可整 合到宿主染 色体上，从 而使宿主细 胞癌变。
细胞的转化
转染：噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体
内的过程。 24.03.2020
24.03.2020
分子生物学原理
重组体的转化
• 转化：重组载体导入宿主后，利用宿主 的酶系统表达的过程。即改变宿主性状 的过程。
24.03.2020
分子生物学原理
基因工程的表达体系的发展
第一代 第二代 第三代 第四代
24.03.2020
载体
宿主
质粒、噬菌体 细菌
穿梭质粒
酵母
《基因工程的原理》 讲义
《基因工程的原理》讲义基因工程，这个听起来颇具科幻色彩的词汇，其实已经在我们的生活中扮演着越来越重要的角色。
从医疗领域的疾病治疗，到农业领域的作物改良，基因工程的应用无处不在。
那么，究竟什么是基因工程？它的原理又是什么呢？要理解基因工程，首先得知道基因是什么。
简单来说，基因是具有遗传效应的 DNA 片段，它就像是生命的密码，决定了生物的各种性状和特征。
基因工程的核心原理之一是基因重组。
这就好比是在一个巨大的基因库中，挑选出我们需要的基因片段，然后把它们重新组合在一起。
想象一下，我们有两个不同的生物体，一个具有某种优良性状，比如抗病虫害的能力；另一个具有其他我们想要的性状，比如高产。
通过基因工程的手段，我们可以把控制这两种性状的基因提取出来，然后整合到同一个生物体的基因组中，让它同时拥有这两种优良性状。
实现基因重组的第一步是获取目的基因。
这可不是一件容易的事情，科学家们需要运用各种技术和方法。
有时候，他们会直接从生物体的细胞中提取出含有目的基因的 DNA 片段。
但更多的时候，由于目的基因在整个基因组中所占的比例很小，直接提取就像大海捞针，所以需要先通过 PCR 技术（聚合酶链式反应）对目的基因进行大量扩增，使其数量达到可以操作的程度。
有了目的基因，接下来就要找一个“运输工具”把它送到受体细胞中去，这个“运输工具”就是载体。
常见的载体有质粒、噬菌体和病毒等。
这些载体就像是一辆辆小货车，它们能够携带目的基因进入受体细胞。
为了让目的基因能够顺利地装载到载体上，科学家们会使用限制酶对目的基因和载体进行切割，使它们产生相同的粘性末端，然后再通过DNA 连接酶将它们连接起来，形成重组 DNA 分子。
当重组 DNA 分子构建完成后，就可以将其导入受体细胞了。
导入的方法有很多种，比如对于植物细胞，可以使用农杆菌转化法、基因枪法等；对于动物细胞，可以使用显微注射法；对于微生物细胞，则可以用感受态细胞法。
受体细胞接受了重组 DNA 分子后，会将其整合到自己的基因组中，从而实现基因的表达。
基因工程PPT课件 第一章 绪论
Figure 1
This figure is purely diagrammatic. The two ribbons symbolize the two phophate-sugar chains, and the horizonal rods the pairs of bases holding the chains together. The vertical line marks the fibre axis.
❖基因表达调控研究
基因表达实质上就是遗传信息的转录和翻译。在个体生长发育 过程中生物遗传信息的表达按一定时序发生变化（时序调节） ，并随着内外环境的变化而不断加以修正（环境调控）。
原核生物的基因组和染色体结构都比较简单，转录和翻译在同 一时间和空间内发生，基因表达的调控主要发生在转录水平。
真核生物转录和翻译过程在时间和空间上都被分隔开，且在转 录和翻译后都有复杂的信息加工过程，其基因表达的调控可以 发生在各种不同的水平上。其基因表达调控主要表现在信号传 导研究、转录因子研究及RNA剪辑3个方面。
2021/7/23
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注：文档资料素材和资料部分来
广义上，分子生物学包括对蛋白质和核酸等生物大 分子结构与功能的研究，以及从分子水平上阐明生 命现象和生物规律，但目前主要研究基因的结构与 功能、复制、转录、表达和调控，确切地应称为分 子遗传学。
2021/7/23
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第一节 引 言
DNA
mRNA
16S rRNA
tRNA
生物 大分子
蜘蛛毒素 金属硫蛋白
第三节 分子生物学的研究内容 ❖分子生物学的研究内容：
DNA重组技术 基因表达调控研究 结构分子生物学 基因组、功能基因组与生物信息学研究
第一章基因工程的分子遗传学基础文稿演示
优选第一章基因工程的分子遗传学基础
等位基因（allele）：指一个基因突变而产生的多种形式之一。
在二倍体真核生物中，等位基因成对存在于一对同源染色体的 特定基因座上。 在原核生物中，等位基因单独存在于染色体上或染色体外（如 质粒上）。
重叠基因的存在表明原核基因的编码是可以重复的，可节省碱 基资源，以有限的核酸序列编码更多的信息。 断裂基因的证实显示真核基因多为不连续的编码。
一、原位分子杂交
分两种：玻片原位杂交和膜上原位杂交。 玻片原位杂交： 要先制片，如中期染色体片和组织切片等。片子制好后不 染色，放在缓冲液中慢慢变性，再加入探针让其复性，将 没有结合的探针充分洗脱。 若用同位素标记探针，须在片子涂一层乳胶或覆盖一张同 样大小的X光片进行放射自显影，再观察同位素的曝光点 在组织细胞或ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ色体上的相对位置。 若用荧光标记，可用荧光显微镜直接观察。 此方法用来进行染色体的基本定位或观察组织中不同的 RNA分布。
变性的方法：
（1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸 分子链间的氢键完全断裂。
（2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核 酸分子链 间的氢键断裂。
（3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。
变性后的理化性质变化：
粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加
DNA变性曲线 AT区先解链 GC区后解链 阶梯式曲线
对Tm的影响
碱基的成分 Tm值随G-C含量的增加而增加
序列的长度 离子浓度
Tm值随序列长度的增加而增加， 当>500bp时，Tm值不受影响 Tm值随Na+浓度的增加而增加
碱基错配比例 最理想的值随碱基错配比例（%）的增 加而下降
高中生物中的分子遗传学和基因工程
高中生物中的分子遗传学和基因工程随着科技的不断进步和发展，生物学这门学科也在不断地拓展和创新。
分子遗传学和基因工程是其中的两个热门领域，它们给生物学研究提供了新的视角和方法，也使得人类对自身的基因和生命有了更深入的认识。
而在高中生物教学中，分子遗传学和基因工程也成为了不可或缺的重要内容。
一、分子遗传学分子遗传学研究的是DNA分子结构、功能及其在遗传过程中的作用。
在生物学中，遗传信息的传递和表达是生物发展的基础，而DNA作为生物体内的遗传物质，对于生命的存续和发展有着不可替代的作用。
1、DNA的结构和功能DNA（Deoxyribonucleic Acid），也称为脱氧核糖核酸，是构成基因的重要物质。
DNA分子由四种不同的碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鳞状细胞鸟嘌呤）组成，并通过三个磷酸二酯键连接起来形成单元，构成DNA的双螺旋结构。
DNA的主要功能是作为遗传物质传递和储存遗传信息。
在细胞分裂时，DNA会被复制并传递给后代子细胞，实现遗传信息的传递。
同时，在细胞内，DNA指导蛋白质的合成，从而决定了生物体内各种功能的表达和维持。
2、基因和基因表达基因是DNA上一段具有特定功能的编码区域，它决定了生物的遗传特征和表现形式。
基因的表达是指基因指导的特定功能的表现。
基因在表达时会被转录成mRNA（messenger RNA），然后通过翻译过程转化成蛋白质，从而实现生物体内功能的表达和维持。
3、分子遗传学在遗传病和基因诊断中的应用分子遗传学在遗传病和基因诊断中有着重要的应用价值。
遗传病是由基因突变引起的一类疾病，通过分子遗传学的分析和检测可以确定病因和实现准确的基因诊断。
分子遗传学还可以在遗传咨询和生殖健康领域中发挥重要作用，对于遗传风险的评估和遗传不孕症的治疗都具有一定的指导意义。
二、基因工程基因工程是一种人工改造生物体基因信息和DNA序列的技术，通过对生物体基因的重组和改造，达到调控生物体性状和功能的目的。
基因工程复习资料()
基因工程复习资料第一章绪论1、基因工程：指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，又称DNA重组技术。
也称为分子克隆技术。
因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件2、基因工程的基本原理:A----提高外源基因的剂量——分子遗传学原理B----筛选修饰重组基因表达的转录调控元件，如：启动子——分子生物学原理C----修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件，如：SD序列、mRNA非编码区、密码子等——分子生物学原理D----基因工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定生产——生化工程学原理3、基因工程的历史：（1）遗传因子Gregor Mendel于1865年在“布隆自然历史学会”上宣读了他的《植物杂交实验》论文，并于1866年发表于该会的会议录上。
35年之后，即1900年才被荷兰的H．De Vries 、德国的C．Correns 和奥地利E．Tschermak 等植物学家重新发现。
1909,丹麦W.Johannsen(约翰逊)根据希腊文“给予生命”之义创造了基因（gene）1910, 美国T．H．Morgan(摩尔根)创立了遗传的染色体理论( 2）DNA是遗传物质a、肺炎双球菌转化实验1944年Avery，确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。
b、噬菌体转染实验1952年AlfredHershy和Marsha Chase进一步证明遗传物质是DNA。
（3 ）DNA的双螺旋结构（4）中心法则和遗传密码1957年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则”1964年Marshall Nirenberg和Gobind Khorana等终于破译了64个遗传密码4、基因文库的构建包括基因组文库的构建和cDNA文库的构建5、基因工程的基本步骤（操作程序）可概括为：A、目的基因的获得(基因克隆)B、目的基因与载体连接(DNA分子重组)C、重组DNA分子导入受体D、转化子的筛选、鉴定(切、接、转、增、检)第二章工具酶用于核酸操作的工具酶：限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶（一）限制性核酸内切酶1、限制性内切酶：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链，主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制与修饰作用与三个连锁基因有关hsd R：编码限制性核酸内切酶hsd M：编码限制性甲基化酶hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达2、限制性核酸内切酶的命名：属名种名株名H aemophilus in fluenzae d 嗜血流感杆菌d株即Hind（后面可加种类罗马数字和大写字母代表染色体遗传成分）3、II 型限制性核酸内切酶的基本特性A、EcoRI等产生的5‘粘性末端PstI等产生的‘粘性末端PvuII等产生的平头末端B、不具有甲基化功能C、多数切割双链，也可切割单链，但切割效率很低4、回文序列：识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列，大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧，识别切割序列呈典型的旋转对称型5、限制性核酸内切酶主要特性I 型II 型III 型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATP Mg2+ SAM Mg2+ ATP Mg2+ SAM识别序列TGAN8TGCT 旋转对称序列GAGCC AACN6GTGC CAGCAG切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游随机性切割特异性切割24-26bp处7、影响限制性核酸内切酶活性的因素A、DNA样品的纯度B、DNA样品的甲基化程度C、核酸内切酶的缓冲液性质D、DNA分子的构型E、酶的纯度和酶切反应的温度及时间8、星号活性：当消化条件改变时，限制性内切酶的的识别位点也会发生改变，可能切割一些与特异识别序列相类似的序列的现象（二）DNA连接酶1、DNA连接酶的基本性质:A、修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键B、修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键C、连接多个平头双链DNA分子2、DNA的反应条件：Tris-HCl 50 - 100 mM pH 7.5MgCl2 10 mM ATP 0.5 - 1 mMDTT 5 mM V olume 10 - 20 mlT T 4 - 15 ℃ 4 - 16 hr1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 ℃反应1 小时，完全连接1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量3、提高平头末端连接效率的方法包括：A、加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）B、加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会C、加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用D、加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM（三）DNA聚合酶1、依赖于DNA的DNA聚合酶：A、大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA pol I ）a：性质5‘→3‘的DNA聚合酶活性5‘→3‘的核酸外切酶活性3‘→5‘的核酸外切酶活性b：基本用途缺口前移标记法Nick translation（切口平移）制备32P标记的探针B、大肠杆菌DNA聚合酶I 大片段（Klenow ）a：性质5‘→3‘的DNA聚合酶活性3‘→5‘的核酸外切酶活性但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性b：基本用途补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端DNA片段的同位素末端标记cDN第二链的合成双脱氧末端终止法测定DNA序列C、T4-DNA聚合酶a：性质①5‘→3‘的DNA聚合酶活性②3‘→5‘的核酸外切酶活性③在无dNTP时，可以从任何3‘-OH端外切④在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止⑤在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位2、依赖于RNA的DNA聚合酶A、反转录酶a：性质①以RNA为模板聚合cDNA链②双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链③5‘→3‘聚合酶活性及RNA酶H活性（四）核酸酶1、核酸酶的分类：A、单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）（大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+）B、双链核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）（大肠杆菌的核酸外切酶III 特异性地从3‘端外切）C、双链核酸外切酶：λ核酸外切酶（λExo）（λ核酸外切酶特异性地从5‘端外切)D、单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶性质：a----降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍b----Zn2+必需c----最适pH范围为4.0 - 4.3d----需要NaCl 10 - 300 mMe----降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍f----降解反应的方式为内切和外切E、单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶性质：a---- 3‘外切酶活性b---- 5‘外切及较弱的内切活性（需要Mg2+和Ga2+）c----对于单链的DNA，具有特异的内切酶活性，3‘-OH末端迅速，5‘切割较慢；对于双链的DNA，具有5‘→3‘外切酶活性和3‘→5‘外切酶活性用途：诱发DNA突变（五）核酸修饰酶1、末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）（来自小牛胸腺）性质：不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs2、碱性磷酸单酯酶：来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP）来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP）二者的区别：a----CIP可在68℃10min内加热失活或通过酚抽提变性失活，而BAP不能b----CIP的活性比BAP高10-20倍，故实验一般选用CIP3、T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）性质：a----在DNA、RNA、dNR、NR的5‘-OH上加磷b----用于探针的末端同位素标记4、碱性磷酸酶用途：a----5‘标记前的处理，以得到较高的标记效率b----去除DNA片段的5‘磷酸基团，防止自身连接即自身环化第三章用于基因克隆的载体1、质粒载体A 性质：a----生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子b----常见于原核细菌和真菌中c----绝大多数的质粒是DNA型的d----绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNAe----分子量范围是1 - 300 kbB 基本特征：a----自主复制性两大复制类型：严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝stringentplasmid松弛型复制控制的质粒10 - 60 拷贝relaxed plasmid b----质粒的不亲和性（因为具有相似复制子结构）c-----质粒的可转移性（接合型质粒即严密：天然条件下自发转移；非接合型质粒即松弛：不可自发转移）d----携带特殊的遗传标记C种类：a----pBR322性质：松弛型复制氯霉素可扩增拷贝数50 - 100 / cell用于基因克隆b----pUC18 / 19性质：拷贝数2000 - 3000 / cell 装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’用于基因克隆和测序2、λ噬菌体载体A特性：a----是大肠杆菌的温和型噬菌体b----由外壳包装蛋白和l-DNA组成c----λ-DNA全长48502个核苷酸d----l-DNA上至少有61个基因B构建内容：a----缩短长度（插入型载体和取代型载体）b----删除重复的酶切位点c----加装选择标记（免疫功能类标记和颜色反应类标记）d----构建琥珀密码子的突变体3、粘性质粒的构建----1.8 kb的l-DNA片段+ pBR322片段，装载范围为31 - 45 kb4、人造染色体载体(装载范围有几百到上千个kb)A分类：细菌人造染色体50 - 300 kb（BAC）和酵母人造染色体350 - 400 kb （YAC）（YAC包括着丝粒、端粒和自主复制序列）第五章基因文库的构建1、基因文库的类别：基因组文库（genomic library) 含有全部基因cDNA文库（cDNA library）含有全部蛋白质编码的结构基因A：基因组文库(用鸟枪法构建,材料来自染色体DNA)构建流程：①载体的选择和制备②高纯度、大分子量基因组DNA 的提取③基因组DNA 的部分酶切与分级分离④载体与DNA片段的连接⑤转化或侵染宿主细胞B：cDNA文库（用cDNA法构建，材料来源于mRNA）构建流程：①细胞总RNA 的提取和mRNA 分离②第一链cDNA 合成③第二链cDNA 合成④双链cDNA 克隆到载体并导入宿主细胞中繁殖基因组文库和cDNA文库的比较基因组文库cDNA文库信息供体DNA mRNA载体噬菌体，黏粒，人工染色体质粒，噬菌体连接前部分酶切，分级分离反转录合成cDNA双链连接粘端连接，人工接头同聚物加尾，人工接头筛选核酸探针核酸探针，免疫探针2、基因文库的鉴定和筛选寡聚核苷酸探针：DNA合成仪抗体探针：检测cDNA编码的蛋白质第六章DNA体外重组与转化1、提高重组率的方法A、提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1 - 10 : 1B、载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团C、加装同聚尾末端2、转化原理A、Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化----Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态B、电穿孔转化----将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。
分子遗传学和基因工程技术
基因编辑技术的准确性和效率
基因工程生物的安全性和环境影响
基因诊断技术的灵敏度和特异性
基因治疗技术的安全性和有效性
生物安全：基因工程技术可能带来的生物安全和伦理问题
合成生物学：设计和构建新的生物系统和生物工程
基因治疗：针对遗传性疾病和癌症等疾病的基因治疗
基因编辑技术的发展：CRISPR-Cas9技术的广泛应用
基因工程环保：利用基因工程技术处理工业废水、废气等污染物
基因工程药物：通过基因工程技术生产药物，如胰岛素、生长激素等
基因工程食品：通过基因工程技术改良作物品种，提高产量和品质
基因工程能源：利用基因工程技术生产生物燃料，如乙醇、生物柴油等
基因编辑技术：CRISPR-Cas9系统，用于基因修饰和基因敲除
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基因转移：将外源基因导入生物体，使其在生物体内表达
基因转移方法：病毒介导、微粒弹射、电穿孔等
基因转移目的：改善生物性状、生产生物制品、治疗遗传疾病等
基因转移应用：转基因植物、转基因动物、基因治疗等
基因编辑技术的伦理问题：探讨基因编辑技术的伦理问题和挑战
基因编辑技术的应用：介绍基因编辑技术在疾病治疗、农业生产等方面的应用
基因工程技术需要严格的监管和伦理审查，以确保其安全性和伦理性
基因工程技术可能被用于非医疗目的，如增强运动员能力、设计“完美婴儿”等
基因工程技术的发展需要遵守相关法规和监管要求
法规和监管问题可能影响基因工程技术的发展和应用
需要加强法规和监管问题也可能为基因工程技术带来新的机遇和挑战
CRISPR/Cas9技术：详细介绍CRISPR/Cas9技术的原理和应用
基因编辑技术概述：介绍基因编辑技术的基本原理和分类
《基因工程的原理》 讲义
《基因工程的原理》讲义一、什么是基因工程基因工程，简单来说，就是一种在分子水平上对基因进行操作的技术。
它就像是一个极其精细的“基因手术”，通过一系列的技术手段，对生物体的基因进行剪切、拼接、重组和改造，从而实现对生物遗传特性的定向改变。
要理解基因工程，首先得知道基因是什么。
基因是具有遗传效应的DNA 片段，它就像一个神秘的密码本，决定了生物体的各种性状，比如我们的外貌、身高、性格，甚至是容易患上某些疾病的倾向。
而基因工程的出现，让我们有了主动去解读和改写这个“密码本”的能力。
不再是被动地接受自然的遗传安排，而是能够按照我们的意愿，去塑造和优化生物的特性。
二、基因工程的基本工具就像进行任何一项复杂的工程都需要特定的工具一样，基因工程也有它必不可少的“工具包”。
1、限制性内切酶限制性内切酶，也被形象地称为“分子剪刀”。
它能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点将 DNA 分子切断。
就好像一把精准的剪刀，能够在长长的 DNA 链条上找到我们想要的位置，然后干净利落地剪断。
不同的限制性内切酶识别的核苷酸序列是不一样的，这就为我们在基因操作中提供了多种选择，能够根据具体的需求来剪切 DNA。
2、 DNA 连接酶有了剪断的操作，自然还需要把断开的 DNA 片段重新连接起来。
这时候就轮到 DNA 连接酶登场了，它像是一个“基因胶水”，能够把两个具有相同末端的DNA 片段连接在一起，形成一个完整的DNA 分子。
3、运载体当我们把想要的基因片段剪切并连接好之后，还需要一个“运输工具”把它们送到目标细胞中去，这个“运输工具”就是运载体。
常见的运载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等。
运载体就像是一辆辆小货车，它们能够携带我们精心准备的基因片段，顺利地进入到受体细胞中，并且能够在受体细胞中稳定地存在和复制。
三、基因工程的基本操作步骤1、目的基因的获取这是基因工程的第一步，也是关键的一步。
目的基因就是我们想要的那段具有特定功能的基因。
基因工程原理第123章讲义详解
基因工程原理第一章绪论（基因与基因工程概论）第一节基因概念的发展1．基因学说基因工程或称基因操作，是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上、于本世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术学科。
它的创立与发展，直接地依赖于基因分子生物学的进步，两者之间有密切而不可分割的内在联系。
根据不同历史时期的水平和特点，基因研究大体上可分为三个不同的发展阶段：在上个世纪50年代以前，主要是细胞染色体水平上进行研究，属于基因的染色体遗传学阶段；50年代之后，则主要从DNA 大分子水平上进行研究，属于基因的分子生物学阶段；最近30多年，由于重组DNA技术的完善和应用，人们已经改变了从表型到基因型的传统研究基因的途径，而能够直接从克隆目的基因出发，研究基因的功能及其表型间的关系，使基因的研究进入反向生物学阶段。
基因最初是遗传学概念，随着生物学科的不断发展及生命科学理论与技术研究的不断深入与完善，人们对基因本质的认识及其定义也在不断深化。
很多先驱科学家及其开创性的科学研究为基因研究的发展建立了功不可没的丰功伟绩。
1866年，奥地利遗传学家G. Mendel(孟德尔)根据豌豆杂交试验，首次提示了遗传学的基本规律，如分离定律和自由组合定律。
阐明了遗传不是性状本身，而是决定性状的遗传因子。
1909年，丹麦生物学家W. Johannsen根据希腊文“给予生命”之义，创造了基因(gene)一词，这一术语却一直沿用至今，并发展为决定遗传性状的物质基础。
1910年，美国著名遗传学家T.H. Morgan(摩尔根)和他的助手们以国蝇为材料，确认遗传物质的基础存在于染色体中并提出基因连锁和互换定律。
第一次将代表某一特定性状的基因同某一特定的染色体联系起来，创立了遗传的染色体理论。
2．DNA是遗传信息的载体1928年，F. Griffith首先发现了肺炎双球菌的转化现象。
转化因子是什么？1944年，美国著名微生物学家O.T. Avery与他的合作者们重复了Griffith的转化实验，并进一步对无毒细菌变成有毒细菌的转化物质进行了分离和化学上的鉴定，证明使细菌性状发生转化的因子是DNA而不是蛋白质或RNA分子。
《基因工程的原理》PPT课件
是
。
⑸由于转基因表达产物存在于山羊的乳汁中，检测其体内是
否出现进药行用抗蛋原白—，抗在体分杂子交水如平果上出的现检杂测交方带法，及表结明果奶是牛什中出现了 么? 抗原蛋白；不出现杂交带，表明奶牛中未出现抗原蛋白
。 ⑹要确定目的让的害基虫因吞（食抗棉虫花基叶因，）观导察入害棉虫花是细否胞具后有，抗是虫否性能状
一、 目的基因的获得
1、目的基因：
在基因操作中使用的外源基因。它是编 码蛋白质的结构基因，如胰岛素基因、 干扰素基因。
2、获得目的基因的方法：
（1）直接分离法—— a.鸟枪法
（2）人工合成法 b.反转录法 c.化射击法）
①分离程序：用限制性内切酶将完 整的DNA分子切成适当长度的片段， 然后通过检测的方法挑选出所需要 的基因。
B、具有多个限制酶切点，以便于目的基 因的表达
C．具有某些标记基因，以便为目的基因 的表达提供条件
D、能够在宿主细胞中复制并稳定保存， 以便于进行筛选
4、质粒是基因工程最常见的载体，它的 主要特点是( )
①能自主复制 ②不能自主复制 ③结构很小 ④是蛋白质 ⑤是环状RNA ⑥是环状DNA ⑦能“友好”地“借居”
想一想需要哪些工具呢？
普通棉花
抗虫棉
探究1：基因工程的基本工具是什么？
一、 基因手术刀：限制性内切酶 二、基因缝纫针：DNA连接酶 三、基因运输车：载体
一、 基因手术刀：限制性内切酶
1、来源： 主要从原核生物中分离纯化 2、功能：（1）识别特定的脱氧核苷酸序列（回文
序列）；（2）并在特异性位点把双链 DNA分子“切割”开。
第一节 基因工程的原理
乳汁中含有人生长激素的 转基因牛(阿根廷)
基因工程DNA的重组概技术念或基因拼接技术
高中生物 第一单元第一节 基因工程的原理课件 中图版选修3
提取质粒并用 限制酶切割
用连接酶将目的 基因和质粒连接
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目的基因与质粒的连接
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重组载体的转化和筛选
• 转化方法： 基因枪法、显微注射法和花 粉管通道法。 受体是动物细胞时最常用 的是显微注射法，是植物细 胞时常用基因枪法。
• 筛选： 利用载体上的标记基因， 借助选择培养基进行筛选。
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㈠运载工具——载体
• 条件：
①能在受体细胞中复制
②具适宜的限制酶切割位点，供外源DNA片段 插入
③具有标记基因，便于选择含有载体的细胞
④对受体细胞无害
• 类型
质粒、噬菌体或其它一些病毒，最常用的 是质粒
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重组载体的构建
• 用与提取目的基因相 同的限制酶切割质粒 使之出现一个切口， 将目的基因插入切口 处，让目的基因的黏 性末端与切口上的黏 性末端互补配对后， 在DNA连接酶的作用下 连接形成重组DNA分子。
第一节 基因工程的原理
普通玫瑰 思考：蓝色妖姬如何培育的？
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蓝色妖姬
1
• “蓝色妖姬”最早来自荷兰是一种加工花卉。它是用一种 对人体无害的染色剂和助染剂调合成着色剂，等白玫瑰 （或白月季）快到花期时，开始用染料浇灌花卉，让花像 吸水一样，将色剂吸入进行染色。
• 据花卉专家介绍，目前世界上极少有自然生长的蓝色玫瑰 花，现在市场上出售的“蓝色妖姬”都是人工染色后的产 物。比较正规的“蓝色妖姬”是在花卉的成长期开始染色， 颜色能均匀地附着在花瓣上，看上去比较自然；部分商贩 直接将普通的白玫瑰花采摘后染成蓝色，颜色不自然，也 容易掉色。
《基因工程的原理》 讲义
《基因工程的原理》讲义一、什么是基因工程在我们深入探讨基因工程的原理之前，让我们先来了解一下基因工程到底是什么。
简单来说，基因工程就是一种对生物基因进行改造和重组的技术。
它就像是一个超级精细的“基因编辑工具包”，让我们能够有目的地改变生物体的遗传特征。
想象一下，我们可以像拼积木一样，把不同生物的基因片段拼接在一起，创造出具有新特性的生物。
或者，我们可以对某个生物自身的基因进行修改，去除不好的部分，增强优良的部分。
基因工程的出现，彻底改变了我们对生命的认知和操控能力。
它不仅仅在农业、医学等领域带来了巨大的变革，甚至对整个生物界的发展都产生了深远的影响。
二、基因工程的基本工具要实现基因工程，就需要一些特别的“工具”。
首先是限制性内切酶。
这就像是一把极其精准的“分子剪刀”，能够在特定的位置剪开 DNA 分子。
每一种限制性内切酶都识别并切割特定的 DNA 序列，这保证了切割的准确性和特异性。
然后是 DNA 连接酶。
当我们把剪开的基因片段重新组合时，就需要 DNA 连接酶来把它们“缝合”起来，形成一个完整的 DNA 分子。
还有载体。
载体就像是一辆“运输小车”，负责把我们想要的基因片段运送到目标细胞中。
常见的载体有质粒、噬菌体和病毒等。
这些载体能够在细胞中自主复制，确保所携带的基因能够得到表达。
三、基因工程的操作步骤基因工程的操作大致可以分为以下几个步骤：第一步，获取目的基因。
这就像是在一个巨大的基因宝库中找到我们想要的那颗“珍珠”。
我们可以从生物体的基因组中直接分离，也可以通过人工合成的方法来获得。
第二步，构建基因表达载体。
把获取到的目的基因与载体连接起来，形成一个能够在受体细胞中稳定存在和表达的重组 DNA 分子。
第三步，将重组 DNA 分子导入受体细胞。
这就像是把“货物”送到“目的地”。
导入的方法有很多种，比如转化法、转染法、显微注射法等。
第四步，筛选含有目的基因的受体细胞。
不是所有导入了重组DNA 分子的细胞都能成功表达目的基因，所以我们需要通过一定的方法筛选出那些成功的细胞。
基因工程原理第123章讲义详解
基因工程原理第一章绪论（基因与基因工程概论）第一节基因概念的发展1．基因学说基因工程或称基因操作，是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上、于本世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术学科。
它的创立与发展，直接地依赖于基因分子生物学的进步，两者之间有密切而不可分割的内在联系。
根据不同历史时期的水平和特点，基因研究大体上可分为三个不同的发展阶段：在上个世纪50年代以前，主要是细胞染色体水平上进行研究，属于基因的染色体遗传学阶段；50年代之后，则主要从DNA 大分子水平上进行研究，属于基因的分子生物学阶段；最近30多年，由于重组DNA技术的完善和应用，人们已经改变了从表型到基因型的传统研究基因的途径，而能够直接从克隆目的基因出发，研究基因的功能及其表型间的关系，使基因的研究进入反向生物学阶段。
基因最初是遗传学概念，随着生物学科的不断发展及生命科学理论与技术研究的不断深入与完善，人们对基因本质的认识及其定义也在不断深化。
很多先驱科学家及其开创性的科学研究为基因研究的发展建立了功不可没的丰功伟绩。
1866年，奥地利遗传学家G. Mendel(孟德尔)根据豌豆杂交试验，首次提示了遗传学的基本规律，如分离定律和自由组合定律。
阐明了遗传不是性状本身，而是决定性状的遗传因子。
1909年，丹麦生物学家W. Johannsen根据希腊文“给予生命”之义，创造了基因(gene)一词，这一术语却一直沿用至今，并发展为决定遗传性状的物质基础。
1910年，美国著名遗传学家T.H. Morgan(摩尔根)和他的助手们以国蝇为材料，确认遗传物质的基础存在于染色体中并提出基因连锁和互换定律。
第一次将代表某一特定性状的基因同某一特定的染色体联系起来，创立了遗传的染色体理论。
2．DNA是遗传信息的载体1928年，F. Griffith首先发现了肺炎双球菌的转化现象。
转化因子是什么？1944年，美国著名微生物学家O.T. Avery与他的合作者们重复了Griffith的转化实验，并进一步对无毒细菌变成有毒细菌的转化物质进行了分离和化学上的鉴定，证明使细菌性状发生转化的因子是DNA而不是蛋白质或RNA分子。
第一章 基因工程的分子遗传学原理
三、DNA测序
（一）、加-减法的原理 1977年 Sanger 建立此法，并测ΦΧ174为 5386bp。 1.原理： (1)加法系统：Englund发现T4聚合酶所具有的外切 酶特性(3'---5'),其降解将停止在外加的那种dNTP上。 (2)减法系统：Wu和 Kaiser发现若让DNA pol在仅 有三种dNTP存在下进行合成，那么合成反应将停 止在缺少的那种dNTP应掺入的位置。
三、印迹杂交
（一）DNA印迹（Southern blotting）
（二）斑点杂交（dot blotting）
将某种生物的总DNA直接点在 尼龙膜上，后将膜变性处理，预 杂交后，经中和、洗脱、干燥。 再将其和探针放入复性缓冲溶液 中缓缓复性，洗涤干燥后进行放 射自显影，观察结果。
(三) RNA印迹 （Northern blotting hybridization）
α-互补（alpha complementation）
X-gal还可以应用于β-半乳糖苷酶的α-互补作用。 噬菌体载体的基因间隔区插入E.coli的一段调节基 因及lac Z的N端146个氨基酸残基编码基因，其编
码产物为 β-半乳糖苷酶的α片段。突变型lac- E.coli 可表达该酶的ω片段（酶的C端）。单独存在的α及 ω片段均无β半乳糖苷酶活性，只有宿 主细胞与克隆载体同时共表达两片段时，宿主细胞 内才有β半乳糖苷酶活性，使X-gal变为蓝色化合 物，这就是所谓的 α- 互补。
二、 遗传的中心法则
（一）、DNA合成
细胞分裂依赖于DNA的复制从而使染色体复制。 关于DNA复制的两个主要的概念是： ①两条互补的反向平行的DNA单链之间由众多 氢键的连接（G-C碱基配对，A-T碱基配对） 形成稳定的DNA双链分子；
基因工程原理第一章绪论
基本原理：
高温变性 低温退火 中温延伸
1.4 基因克隆需要特殊的工具和技术
• 运输工具： 细菌质粒 病毒染色体
• DNA操作技术 纯化DNA 剪切DNA分子 分析DNA片段大小连接DNA分子 将DNA转入受体细胞重组子的鉴定
基因工程原理 Principle of Gene Engineering
第一章 第一节
第一章
基因工程
基因研究的发展阶段：
染色体水平
DNA水平
DNA重组
染色体遗传学
分子生物学
反向生物学
50s
70s
1857－1864：孟德尔碗豆杂交试验（遗传因子的 独立分配规律） 1910年：摩尔根果蝇遗传学研究 （遗传的染色体理论）
（3）细菌的转化（Transformation）
——一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传性改变的生 命过程。
（4）DNA核苷酸序列分析
• 双脱氧链终止法（Sanger法）：英国生物化学家Frederick Sanger于1977年发明
反应组成
模板 标记的引物 DNA聚合酶 dNTP 双脱氧链终止物ddNTP
1.1.4基因工程发展史 （1）理论上的三大发现：
• 1944, Avery的肺炎双球菌实验,确定了遗传的物质基础是DNA。 • DNA的分子结构及复制机理：50年代，Watson和Crick提出DNA的双螺旋结构模型和半保留复
制的机理。 • 1958，Crick提出“中心法则”；1961年，Jacob和Monod “操纵子学说”
基因工程：在体外将核酸分子插入病毒、质粒或 其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使其 掺入到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能持 续稳定繁殖。
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第四节 基因工程中 常采用的酶类
一、 序列特异的 DNA限制性酶
限制性内切酶的类型
Ⅱ型酶的命名,书写与剪切方式：
限制酶
来源
剪切方式
Eco RⅠ Escherichia coli RY 13 G↓AATTC
大肠杆菌
Pst Ⅰ Providencia stuartii 16 CTGCA↓G
斯氏普罗威登斯菌
剪切方式
5' G AATTC 3' 3' CTTAA G 5'
5' CTGCA G3' 3' G ACGTC 5'
5' GTT AAC 3' 3' CAA TTG 5'
同裂酶(isoschizomers): 切割同一靶序列而来源不同的酶。
Mbo I :↓ GATC
CTAG ↑ ↓ Bam HI : GGATCC CCTAGG
第二节 核酸的生物化学
一、核酸大分子的结构 ①同一条链中相邻的核苷之间以磷酸二酯键 连接； ② DNA-RNA异源双链核酸分子呈的反向平行极性。 5'到3'的DNA链与3' 到5'的RNA 链进行碱基配对。 ③ 通过T-A, G-C, 和 A-U之间形成氢键，DNA链和 RNA链进行互补连接。
二、DNA双螺旋的变性与复性
2.方法步骤
(1)制备标记“ 引物”：
ATGCTG
DNA pol 4种[32P] dNTP
ATGCTG TACGAC TACGA TACG TAC TA T
不同步合成，得到 长度不同的片段， 作为继续合成的引 物
继续合成 (减法,－A) 降解反应(加法,＋A)
DNA pol 保温
加入的dNTP中 缺少dATP
二、电泳 1．凝胶电泳
2、双向电泳 （two-dimensional electrophoresis）
(a)
(b)
(c)
3、毛细管电泳 (capillary electrophoresis, CE)
4、脉冲电场凝胶电泳 （pulsed- field gel electrophoresis,PFGE）
解链温度（melting temperature）或熔点温度，以 “Tm”来表示。
双链DNA的Tm 受到3种因素的影响： ①碱基的成分；②双链的长短；③溶液 Nhomakorabea离子的浓度。
当互补的短寡核苷酸链（10～20bp）在Na+ 为1M 时，用下面的经验公式能计算出Tm 近似值。 Tm ( ℃ ) = 2 (A + T) + 4 (G + C)
Bam HⅠBacilus amyloliquefaciens H G↓GATCC
解淀粉芽孢杆菌
细菌的限制性酶3种不同剪切方式
限制酶 识别位点
Eco R I 5' GAATTC 3' 3' CTTAAG 5'
Pst I 5' CTGCAG 3' 3' GACGTC 5'
BseⅡ 5' GTTAAC 3' 3' CAATTG 5'
α-片段
X
X-gai 白色
X
X-gai 蓝色
α-片段
lacZ 启动子
MCS
RNA
OP
聚合酶
X
α-互补 水解X-gai
载体质粒
lacZ
ω-片段 ori
E.cili基因组或F '质粒
表达的β-半乳糖苷酶的活性可以作为基因功能的指示剂质 粒表达β-半乳糖苷酶N-端的的α片段可和E. coli 特殊菌株 （或 F'质粒上）糖苷酶C-端的的ω片段进行α-互补作用。
（三）双脱氧法和M13克隆系统结合
1.原理： 测序需纯化待测DNA，此工作十分困难，为解决此 问题，1982和1983年Messing将待测片段克隆到M13 上，为双脱氧法提供单链模板。
2.优点： (1)重组质粒易选择； (2)纯的待测DNA易获得； (3)有共同引物。
用此法二年完成了Epstein-Barr病毒(173 282bp)和
第三节 分子杂交
一、原位 分子杂交 （in situ hybridizati杂交探针
荧光原位杂交 （fluorescent in site hybridization，FISH）
二、 芯片技术
基因芯片 （gene chip） 也称DNA芯 片（chip）或 微列阵 (microarray)
α-互补（alpha complementation）
X-gal还可以应用于β-半乳糖苷酶的α-互补作用。 噬菌体载体的基因间隔区插入E.coli的一段调节基 因及lac Z的N端146个氨基酸残基编码基因，其编
码产物为 β-半乳糖苷酶的α片段。突变型lac- E.coli 可表达该酶的ω片段（酶的C端）。单独存在的α及 ω片段均无β半乳糖苷酶活性，只有宿 主细胞与克隆载体同时共表达两片段时，宿主细胞 内才有β半乳糖苷酶活性，使X-gal变为蓝色化合 物，这就是所谓的 α- 互补。
继续合成
TACG
TAC
加 dTTP
TA
dGTP
T
dCTP
ddATP
C A G C A T
电泳
ATGCTG TACGAC TACGAG TACGA TACCA TACCA TA
DNA sequence of original strand
The dideoxy sequencing method. (a) A labeled primer (designed from the flanking vector sequence) is used to initiate DNA synthesis. The addition of four different dideoxy nucleotides (ddATP is shown here) randomly arrests synthesis. (b) The resulting fragments are separated elec-trophoretically and subjected to autoradiography.
Atkinson发现用 DNA pol 合成DNA时如在反应物 中加入一定量的 2',3' ddTTP 时，因ddT的3'碳原子 不含-OH,故DNA不能延伸。
1982年Sanger 利用此原理建立了双脱氧测序法。 原理和加减法相似，但不再是加一种dNTP或减一 种dNTP,而是加入某一种双脱氧核苷，来终止聚合 反应。用此法测得G4噬菌体含5577bp。.
（三）、蛋白质合成
三、基因表达的调节—操纵子模型
(a)
LacUV5 启动子
OP
质粒 C
mRNA ori
阻遏蛋白 E.cili基因组
lacIq
(b) 加IPTG
mRNA
LacUV5 启动子
O P
RNA聚合酶
质粒
C cAMP-CAP 复合体
ori
失活的 阻遏蛋白
lacIq E.cili基因组
用lac操纵子成分建立了IPTG诱导表达系统。用含有lacUVS的启动子可以 控制克隆基因的表达。作为宿主菌的E, coli含有超表达突变的laclq受体。
第一章 基因工程的分子遗传学基础
第一节 基因和信息流
一、基因的概念 基因（gene）是一段可编码有特定功能蛋白质或 RNA的DNA序列。 其中基因包括含有编码序列，即外显子（exon）、 和非编码区（non-coding region）[包括含内含子 （intron），5'端的前导序列（leader sequence）、 3'端的尾随序列（trailer sequence）以及一些调控 元件]。
T4 pol 在3'-5'反应中 保温 加dATP
ATGCTG
C
ATGCTG
TACGAC
A
TACGA
TACGAC
G
TACGA
TACG
C
TA
TACG
A
TA
TACG
T
TA
T
聚丙烯酰胺凝胶电泳
（二）双脱氧法(dudeoxy sequence analyses)
双脱氧法又称末端终止法, 用于单链测序
1.原理：
三、DNA测序
（一）、加-减法的原理 1977年 Sanger 建立此法，并测ΦΧ174为 5386bp。 1.原理： (1)加法系统：Englund发现T4聚合酶所具有的外切 酶特性(3'---5'),其降解将停止在外加的那种dNTP上。 (2)减法系统：Wu和 Kaiser发现若让DNA pol在仅 有三种dNTP存在下进行合成，那么合成反应将停 止在缺少的那种dNTP应掺入的位置。
远西方印迹（Far-western blotting，Far WB）：用能与 目标蛋白结合的被标记的非抗体蛋白质为探针来 探检测蛋白质与蛋白质之间、受体与配体之间的 作用。
四、异源双链定位法和R-环定位法
异源双链 定位法
（heferoduplex mapping）
R-环定位法（Rloop mapping）
(48 502bp)的测序。
EcoRI +
外源 DNA
加人工接头
EcoRI lacZ
PO
P(引物区)
M13mpZ
T4 连接酶
-
转染 E.coli K12 lac Xgal
The structure of 2' , 3' -dideoxy nucleotides, which are employed in the Sanger DNA sequencing method.