第一章 基因工程的分子遗传学原理

第四节 基因工程中 常采用的酶类
一、 序列特异的 DNA限制性酶
限制性内切酶的类型
Ⅱ型酶的命名,书写与剪切方式：
限制酶
来源
剪切方式
Eco RⅠ Escherichia coli RY 13 G↓AATTC
大肠杆菌
Pst Ⅰ Providencia stuartii 16 CTGCA↓G
斯氏普罗威登斯菌
Atkinson发现用 DNA pol 合成DNA时如在反应物 中加入一定量的 2',3' ddTTP 时，因ddT的3'碳原子 不含-OH,故DNA不能延伸。
1982年Sanger 利用此原理建立了双脱氧测序法。 原理和加减法相似，但不再是加一种dNTP或减一 种dNTP,而是加入某一种双脱氧核苷，来终止聚合 反应。用此法测得G4噬菌体含5577bp。.
二、电泳 1．凝胶电泳
2、双向电泳 （two-dimensional electrophoresis）
(a)
(b)
(c)
3、毛细管电泳 (capillary electrophoresis, CE)
4、脉冲电场凝胶电泳 （pulsed- field gel electrophoresis,PFGE）
（四）蛋白质印迹 （ Western blotting,WB）
（五）、其他的一些印迹技术
东方印迹（Eastern Blotting）：用来检测这种蛋白质翻 译后修饰的技术，其检测目标是蛋白质上特定的 修饰基团或部位，如脂肪酸链、糖基、磷酸化的 氨基酸等等。
西南方印迹（Southwestern blotting）：一种检测序列特 异性DNA和蛋白结合的方法称为“西南印迹”
第三节 分子杂交
一、原位 分子杂交 （in situ hybridization）
通过菌落杂 交筛选 DNA文库。 放射性同位 素标记的 cDNA用作 杂交探针
荧光原位杂交 （fluorescent in site hybridization，FISH）
二、 芯片技术
基因芯片 （gene chip） 也称DNA芯 片（chip）或 微列阵 (microarray)
（二）、 RNA合成
转录需要 RNA聚合酶 的催化。
合成是从5' 到3'方向进行。
RNA的合成和DNA合成的主要差别： ①转录时只有一条DNA链为模板，而复制时两条链 都作为模板； ②DNA-RNA杂合双链不稳定，RNA合成后释放，而 DNA复制叉形成后一直打开，新链和母链结合在一 起，形成链； ③RNA合成不需引物，而DNA复制需引物； ④ 转录的底物是rNTP，复制的底物是dNTP； ⑤所用的聚合酶系不同。
（三）双脱氧法和M13克隆系统结合
1.原理： 测序需纯化待测DNA，此工作十分困难，为解决此 问题，1982和1983年Messing将待测片段克隆到M13 上，为双脱氧法提供单链模板。
2.优点： (1)重组质粒易选择； (2)纯的待测DNA易获得； (3)有共同引物。
用此法二年完成了Epstein-Barr病毒(173 282bp)和
解链温度（melting temperature）或熔点温度，以 “Tm”来表示。
双链DNA的Tm 受到3种因素的影响： ①碱基的成分；
②双链的长短；
③溶液中离子的浓度。
当互补的短寡核苷酸链（10～20bp）在Na+ 为1M 时，用下面的经验公式能计算出Tm 近似值。 Tm ( ℃ ) = 2 (A + T) + 4 (G + C)
T4 pol 在3'-5'反应中 保温 加dATP
ATGCTG
C
ATGCTG
TACGAC
A
TACGA
TACGAC
G
TACGA
TACG
C
TA
TACG
A
TA
TACG
T
TA
T
聚丙烯酰胺凝胶电泳
（二）双脱氧法(dudeoxy sequence analyses)
双脱氧法又称末端终止法, 用于单链测序
1.原理：
↑
GATC CTAG
G
GATCC
CCTAG
G
二、 连接酶和激酶
连接酶（ligases） 和激酶（kinases） 是另一类酶，在 DNA体外重组中 起到重要的作用。
激酶和碱性磷酸酯酶
T4噬菌体多核苷酸激酶（T4 palynucleotide kinase） 是磷酸化DNA或RNA5'羟基的酶。
T4噬菌体多核苷酸激酶常用于用[γ- 32P] ATP标记 DNA5'末端，也用于对缺乏5'-磷酸的DNA或人工接 头进行磷化。
剪切方式
5' G AATTC 3' 3' CTTAA G 5'
5' CTGCA G3' 3' G ACGTC 5'
5' GTT AAC 3' 3' CAA TTG 5'
同裂酶(isoschizomers): 切割同一靶序列而来源不同的酶。
Mbo I :↓ GATC
CTAG ↑ ↓ Bam HI : GGATCC CCTAGG
继续合成
TACG
TAC
加 dTTP
TA
dGTP
T
dCTP
ddATP
C A G C A T
电泳
ATGCTG TACGAC TACGAG TACGA TACCA TACCA TA
DNA sequence of original strand
The dideoxy sequencing method. (a) A labeled primer (designed from the flanking vector sequence) is used to initiate DNA synthesis. The addition of four different dideoxy nucleotides (ddATP is shown here) randomly arrests synthesis. (b) The resulting fragments are separated elec-trophoretically and subjected to autoradiography.
Bam HⅠBacilus amyloliquefaciens H G↓GATCC
解淀粉芽孢杆菌
细菌的限制性酶3种不同剪切方式
限制酶 识别位点
Eco R I 5' GAATTC 3' 3' CTTAAG 5'
Pst I 5' CTGCAG 3' 3' GACGTC 5'
BseⅡ 5' GTTAAC 3' 3' CAATTG 5'
2.方法步骤
(1)制备标记“ 引物”：
ATGCTG
DNA pol 4种[32P] dNTP
ATGCTG TACGAC TACGA TACG TAC TA T
不同步合成，得到 长度不同的片段， 作为继续合成的引 物
继续合成 (减法,－A) 降解反应(加法,＋A)
DNA pol 保温
加入的dNTP中 缺少dATP
α-片段
X
X-gai 白色
X
X-gai 蓝色
α-片段
lacZ 启动子
MCS
RNA
OP
聚合酶
X
α-互补 水解X-gai
载体质粒
lacZ
ω-片段 ori
E.cili基因组或F '质粒
表达的β-半乳糖苷酶的活性可以作为基因功能的指示剂质 粒表达β-半乳糖苷酶N-端的的α片段可和E. coli 特殊菌株 （或 F'质粒上）糖苷酶C-端的的ω片段进行α-互补作用。
三、印迹杂交
（一）DNA印迹（Southern blotting）
（二）斑点杂交（dot blotting）
将某种生物的总DNA直接点在 尼龙膜上，后将膜变性处理，预 杂交后，经中和、洗脱、干燥。 再将其和探针放入复性缓冲溶液 中缓缓复性，洗涤干燥后进行放 射自显影，观察结果。
(三) RNA印迹 （Northern blotting hybridization）
第二节 核酸的生物化学
一、核酸大分子的结构 ①同一条链中相邻的核苷之间以磷酸二酯键 连接； ② DNA-RNA异源双链核酸分子呈的反向平行极性。 5'到3'的DNA链与3' 到5'的RNA 链进行碱基配对。 ③ 通过T-A, G-C, 和 A-U之间形成氢键，DNA链和 RNA链进行互补连接。
二、DNA双螺旋的变性与复性
（三）、蛋白质合成
三、基因表达的调节—操纵子模型
(a)
LacUV5 启动子
OP
质粒 C
mRNA ori
Байду номын сангаас
阻遏蛋白 E.cili基因组
lacIq
(b) 加IPTG
mRNA
LacUV5 启动子
O P
RNA聚合酶
质粒
C cAMP-CAP 复合体
ori
失活的 阻遏蛋白
lacIq E.cili基因组
用lac操纵子成分建立了IPTG诱导表达系统。用含有lacUVS的启动子可以 控制克隆基因的表达。作为宿主菌的E, coli含有超表达突变的laclq受体。
E.coli lac 操纵子的第二项应用是用β-半乳糖 苷酶的活性来作为基因活性的指标。 β-半乳糖苷酶可使发色底 物5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D半乳糖苷（X-gal)产生蓝 色产物。用此反应可用来 检测细胞中β-半乳糖苷酶 的活性。在野生型E. coli 细胞中 X-gal被水解，在琼 脂平板上会产生蓝色菌落。
第一章 基因工程的分子遗传学基础
第一节 基因和信息流
一、基因的概念 基因（gene）是一段可编码有特定功能蛋白质或 RNA的DNA序列。 其中基因包括含有编码序列，即外显子（exon）、 和非编码区（non-coding region）[包括含内含子 （intron），5'端的前导序列（leader sequence）、 3'端的尾随序列（trailer sequence）以及一些调控 元件]。
细菌的碱性磷酸酯酶（alkaline phosphatase, AP） 是一种除去DNA5‘ -磷酸的酶，在用T4噬菌体多核 苷酸激酶进行末端标记前，AP用来除去5' -磷酸， 或用来处理经限制性酶切过的载体DNA，以防止其 重新环化而降低转化效率。
三、DNA聚合酶和RNA聚合酶
RNA聚合酶
第五节 研究DNA和RNA的方法 一、核酸的分离纯化
远西方印迹（Far-western blotting，Far WB）：用能与 目标蛋白结合的被标记的非抗体蛋白质为探针来 探检测蛋白质与蛋白质之间、受体与配体之间的 作用。
四、异源双链定位法和R-环定位法
异源双链 定位法
（heferoduplex mapping）
R-环定位法（Rloop mapping）
α-互补（alpha complementation）
X-gal还可以应用于β-半乳糖苷酶的α-互补作用。 噬菌体载体的基因间隔区插入E.coli的一段调节基 因及lac Z的N端146个氨基酸残基编码基因，其编
码产物为 β-半乳糖苷酶的α片段。突变型lac- E.coli 可表达该酶的ω片段（酶的C端）。单独存在的α及 ω片段均无β半乳糖苷酶活性，只有宿 主细胞与克隆载体同时共表达两片段时，宿主细胞 内才有β半乳糖苷酶活性，使X-gal变为蓝色化合 物，这就是所谓的 α- 互补。
(48 502bp)的测序。
EcoRI +
外源 DNA
加人工接头
EcoRI lacZ
PO
P(引物区)
M13mpZ
T4 连接酶
-
转染 E.coli K12 lac Xgal
The structure of 2' , 3' -dideoxy nucleotides, which are employed in the Sanger DNA sequencing method.
2.方法步骤
ATGCTG
DNA pol
4种[32P] dNTP
ATGCTG
TACGAC
TACGA
三、DNA测序
（一）、加-减法的原理 1977年 Sanger 建立此法，并测ΦΧ174为 5386bp。 1.原理： (1)加法系统：Englund发现T4聚合酶所具有的外切 酶特性(3'---5'),其降解将停止在外加的那种dNTP上。 (2)减法系统：Wu和 Kaiser发现若让DNA pol在仅 有三种dNTP存在下进行合成，那么合成反应将停 止在缺少的那种dNTP应掺入的位置。
二、 遗传的中心法则
（一）、DNA合成
细胞分裂依赖于DNA的复制从而使染色体复制。 关于DNA复制的两个主要的概念是： ①两条互补的反向平行的DNA单链之间由众多 氢键的连接（G-C碱基配对，A-T碱基配对） 形成稳定的DNA双链分子；
②DNA合成的 起始需要引物 提供3' 羟基， DNA聚合酶按 照5' →3'方向合 成DNA。