拟南芥叶片RNA提取实验指导
提取植物组织RNA的准备工作和操作规范
提取RNA前的准备工作1、提取RNA操作全程及配制RNA提取试剂必须穿实验服，戴口罩和一次性手套，触摸皮肤（例如面部）、门把手及实验室其他未处理过RNase的普通物体表面后立即更换手套。
2、器具干烤：需要干烤的器具包括金属和玻璃制品，如研钵、钥匙、镊子、剪刀、试剂瓶（200mL、500mL、1L）、量筒（50mL、100mL）、烧杯，即所有在配制RNA提取试剂过程中需要用到的玻璃器皿均需要干烤处理。
所有干烤的器具均用锡箔纸包住，如研钵、钥匙、镊子、剪刀和匀浆器，容器用锡箔纸封口，如试剂瓶、量筒和烧杯。
180℃干烤6h后放入RNA专用柜中备用。
3、DEPC水的处理：用于处理枪头、试剂瓶盖和离心管等塑料制品的0.1%的DEPC水可以在烧杯中配制，磁力搅拌器上搅拌过夜，搅拌过程中用锡箔纸封口。
用于配制RNA提取试剂的DEPC水需要在干烤过的试剂瓶中配制，盖上瓶盖搅拌过夜后121℃灭菌20min。
4、枪头、离心管和试剂瓶盖用0.1%DEPC水过夜处理后用报纸包好高温灭菌，移液器必须是专用的，用之前用DEPC处理的水配制的75%酒精擦拭整个移液器，特别是枪杆。
超净台的处理：用DEPC处理的水配制的75%酒精擦拭干净后，用氯仿快速擦拭，再用75%酒精擦拭，将提取所需的物品放入超净台，并用75%酒精擦拭，另放置一个废物缸，表面喷酒精，上述完成后，超净工作台紫外灯照射15-20min。
试剂配制过程中所用的枪头也必须是DEPC水处理过并高温灭菌的。
5、提取过程中用新开封的氯仿和异丙醇，用DEPC水处理过的15mL离心管分装，每管分装10mL并于4℃保存，最后溶解RNA沉淀的DEPC处理过的水用处理过的1.5mL离心管分装并于-20℃保存。
6、用专用的电泳槽电泳RNA，用DEPC处理的水配制50×TAE缓冲液，每次电泳前用DEPC处理的水配制1×TAE缓冲液进行电泳，电泳前用去污剂将电泳槽、制胶板和梳子清洗干净，DEPC水配制的75%乙醇擦拭，最后用DEPC处理的水冲洗干净。
拟南芥总RNA的提取及RT―PCR扩增CBF1基因-2019年文档资料
拟南芥总RNA勺提取及RPPCR扩增CBF1基因拟南芥（Arabidopsis thaliana ）：十字花科，两年生草本，高7厘米〜40厘米，广泛用于植物遗传学、发育生物学等研究，已成为一种典型勺模式植物。
其原因主要基于该植物具有以下特点：植株个体小（1 平方厘米可种植好几棵）、生长周期快（从发芽到开花不超过6周）、种子多（每株每代可产生数千粒种子）生命力强（用普通培养基就可作人工培养），其基因组是目前已知植物基因组中最小勺；同时，拟南芥属于自花授粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能缺陷型勺植株。
因此，其被科学家誉为“植物中勺果蝇”。
1. CBF 基因功能及特性CBF转录激活因子是一类受低温特异诱导的反式作用因子，它们能与CRT/DRE( C-repeat/dehydration-responsive element）DNA调控元件特异结合，促进启动子中含有这一调控元件的多个冷诱导和脱水诱导基因的表达，从而激活植物体内的多种耐逆机制。
拟南芥CBF1转录激活因子能调控一组抗干旱、抗低温基因勺表达，更有效地提高植物抗干旱、抗低温勺能力。
对冷驯化过程中基因表达差异的认识，使抗冻基因（COR的克隆及其功能的分析成为研究冷驯化过程的主要目标，在拟南芥和其他抗冻植物中分离出许多COF基因，这些基因对植物抗冻有非常重要的作用。
在拟南芥CORM控的研究中发现CBF转录因子的基因家族，其中CBF1能调控一组COR基因的表达。
近年来，在冷敏植物如番茄和玉米中发现了CBF类似基因，拟南芥CBF1基因在转基因番茄和小麦中的过量表达提高了植株的抗寒和抗旱性。
这一研究结果展示了拟南芥CBF1类似基因的应用可能为冷敏植物抗寒和抗旱性的品种改良提供一条新的途径。
2. 材料与方法2.1 材料2.1.1 菌株、植物材料和载体拟南芥Columbia （At ）、E.coli JM109 为本实验室保存，PMD18-T Vector 购于TaKaRa公司。
实验二 植物总RNA提取
RNA提取的通用方法 RNA提取的通用方法
异硫氰酸胍/ 异硫氰酸胍/苯酚法
原理： 原理：
• 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解， 性，核酸释放； 核酸释放； • 释放出来的DNA和RNA由于在特定 下溶解度的不同而分别位于整 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整 由于在特定pH 个体系中的中间相和水相，从而得以分离； 个体系中的中间相和水相，从而得以分离； • 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。
所以，如果直接从真核生物的基因组DNA获取目的基 所以，如果直接从真核生物的基因组DNA获取目的基 克隆再表达， 因，克隆再表达，试图获取目的蛋白的思路是行不通 因为获取的DNA里面会含有非编码区 里面会含有非编码区。 的，因为获取的DNA里面会含有非编码区。要表达真 核生物的基因并表达出相应的蛋白， 核生物的基因并表达出相应的蛋白，只能通过提取其 mRNA并RT-PCR这条颇费周折的途径。 mRNA并RT-PCR这条颇费周折的途径。 这条颇费周折的途径
在做基因、获得RNA病毒 取能够编码真核生物蛋白的基因、获得RNA病毒 基因时，会用到RNA提取和 -PCR技术 提取和RT 基因时，会用到RNA提取和RT-PCR技术。
步骤: 步骤: • • • • •
材料准备：尽量新鲜。 材料准备：尽量新鲜。 裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇， 月桂肌氨酸等）。 裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。 使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。 使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。 纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。 纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。 洗涤：70％乙醇。 洗涤：70％乙醇。 沉淀：异丙醇、无水乙醇。 沉淀：异丙醇、无水乙醇。 乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。 ）：维持变性的细胞裂解液的 乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值 沉淀RNA。 此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。 此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。
植物DNA提取——拟南芥
【实验目的】1、采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体和琼脂糖凝胶电泳。
2、掌握CTAB法从植物叶片中提取DNA的原理和方法。
3、掌握应用PCR技术扩增目的基因的原理和方法。
4、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作和原理及分析方法。
【实验原理】DNA是分子生物学研究的基本材料，依不同实验目的采取相应的抽提DNA方法，获取数量、质量不等的DNA。
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，也称六癸基三甲基溴化铵)是一种非离子去污剂，用CTAB法抽提植物总DNA，操作简便、快速、产量高，但纯度稍次，适用于一般分子生物学操作。
在DNA提取过程中，第一步就是使组织细胞破裂后释放出DNA，第二步就是DNA与其他细胞组分如蛋白质、碳水化合物、膜和细胞壁相分离。
在这个方法中，植物细胞首先在液氮中冰冻，然后用研钵或植物粉碎机研磨，使组织细胞破裂后释放出D14A。
研磨好的组织置于预热的1．5×CTAB(高盐1．05mol/L NaCl)缓冲溶液中，加热至65℃。
此时CTAB可与核酸形成复合物，这种复合物在高盐(＞0．7mol/L)溶液中是可溶的，并且可以稳定存在，而细胞壁纤维和大部分变性蛋白质则沉淀，从而从DNA中去除污染物，而部分蛋白质及多糖(酶抑制剂)仍溶于溶液中。
β-琉基乙醇可抑制多酚氧化酶的氧化，防止植物组织发黄变褐。
经过初次保温后，氯仿／异戊醇抽提就可除去仍溶于溶液中的蛋白质、多糖，最后用乙醇沉淀DNA(CTAB-核酸复合物在低盐溶液中因溶解度降低而沉淀)，并洗去CTAB。
分离纯化核酸总的原则，一是要保证核酸一级结构的完整性；二是要排除其他分子的污染。
抽提的DNA中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子，且其他生物大分子的污染应降到最低程度。
Ti质粒和T-DNA：Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。
实验二-植物总RNA的提取
１. 琼脂糖电泳检测
六、操作环节
1、取植物嫩叶，液氮研磨，每1.5ml tube
分装0.1克样品； ２. 每管加入0.5ml Trizol液，迅速混匀， 注意样品总体积不能超出所用Trizol体积旳 10%。 ３、室温下静置5分钟以利于核酸蛋白质复 合体旳解离
４ 、加入0.5ml旳氯仿，盖紧离心管，用手剧烈 摇荡离心管15秒，室温静置3分钟
Trizol试剂配制
苯酚饱和液（38%）-380ml/L 硫氰酸胍盐（0.8M-118.16g） 硫氰酸铵（0.4M）-- 76.12g 醋酸钠pH 5（0.1M）- 33.4ml 甘油 – 50ml 加水至1L 。
三、材料 植物组织
四、设备 移液器，冷冻高速离心机，低
温冰箱，台式高速离心机，液氮罐， 陶瓷研钵，1.5ml离心管。
RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙 醇并保存于-70℃
七、检测 1、DNA旳紫外分光光度计检测
OD260/OD280>1.8 1OD260=40 μg/mL DNA
2、甲醛变性琼脂糖电泳检测
八、注意事项 （1）Trizol、DEPC等有毒，与皮肤接触会引起
伤害。操作过程带手套，在通风条件下操作。 （2）防止带入RNase进入样品
带手套，别用手碰任何与样品接触旳物品。 使用新旳已灭活RNase旳塑料器皿与用具。 （3）爱惜仪器设备,安全操作
作业：
1、RNA酶旳变性或失活剂有那些？其中 在总RNA旳抽提中主要可用哪几种？ 2、怎样从总RNA中进行mRNA旳分离和 纯化。
补充： ＤＮＡ检测措施
１. 另外分光光度计检测
ＯＤ２６０值＝１时，相当于含５０μg/mL DNA ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１.８～１.９时，DNA较纯
实验2 RT-PCR分析拟南芥叶片
表达的定量研究，是一种常用的具有很高灵敏度和特异性的基因表达检测方法。
RT-PCR方法有定量RT-PCR和半定量RT-PCR法，定量PCR法对实验仪器和 样本处理的要求较高，而半定量PCR法对试验条件的要求不高，它的主要特点 是选择一个比较标准(control)又称为内参基因，以消除试验误差，样本间用于 比较的值不是绝对值，而是相对值，因此称半定量RT-PCR法。
如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后将反 应管放到基因扩增仪(PCR仪)上 .
PCR参数设置
① ② 98℃预变性3分钟后开始以下循环 98℃ 30 sec
Tm
72℃
30 sec
1 min
26 循环（PPH） 24 循环（ACT2）
③ 72℃ 5 min ④ 4 ℃ 保温
PCR过程约1小时20分钟
取 5-10 µL 的 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据条 带亮度的不同来确定表达量的多少。 在一次半定量 PCR 分析中，每个样品至少设两个重复。
内参基因的设定为了保证实验结果的可靠与准确可在为了保证实验结果的可靠与准确可在pcrpcr扩增目的基因时加入一对扩增目的基因时加入一对内参照基因的特异性引物同时扩增内参内参照基因的特异性引物同时扩增内参dnadna作为对照
实验二 半定量RT-PCR分析拟南芥叶片PPH基因表达
田亚楠
实验目的
1、了解植物叶绿素酶基因的功能 2、掌握半定量RT-PCR操作方法
关于PPH基因
Step1 拟南芥叶片总RNA提取
提取质量较好的RNA：28 S和18 SRNA带型完整， 无明显拖尾现象，无明显的降解。
Step2 基因组DNA的去除 ★
RNA提取方法及原理PPT教学课件
选择新鲜组织，生长旺盛的组织
选择新鲜的幼嫩组织
2020/12/11
选择处于生长旺盛的时期收集细胞
5
RNA提取流程－－ 样品前处理中如何保存样本
可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞 然后加入一定量的TRNzol，-70℃保存较长时间
推荐使用专门的RNA样品 储存液进行储存
液氮或加入RNase抑制剂中保存， 避免反复冻融
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15
苯酚法提取酵母RNA
取1g 活性干酵母在研钵中研碎，加10mL SDS-缓冲液
使成匀浆，洗入各Eppendorf管（略少于管容积的一半）， 加溶菌酶0.1mL，混匀，室温静置10min，再加等体积饱 和酚液，室温下剧烈振荡5min。置冰浴中分层，在0-4℃ 低温环境下，10000r/min 离心10min。吸出上层清液，转 入新的Eppendorf 管，加等体积氯仿-异戊醇，室温下剧烈 振荡2.5min，然后10000r/min 离心5min。
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11
2.4 几种RNA提取方法
2.4.1 TRIzol法
TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试 剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯 仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层 中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来 还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以 沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机 层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标 准化RNA的产量十分有用。
7. 晾干，加入适量的 DEPC H 2 O 溶解（ 65 ℃ 促溶 10-15min ）。
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实验七、植物组织rna的提取
RNase酶
RNase酶非常稳定，耐高温，是导致RNA降解最主要的物质。用常 规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活， RNase广泛存在于人的皮肤上。
RNA提取的关键是控制RNase的污染，而手是污染的主要来源之一 DEPC（diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯）和RNA酶的活性基
问题分析
RNA提取量少：研磨不充分 RNA降解：排除RNase污染，使用新鲜电泳缓冲液 蛋白污染：可用氯仿抽提时多抽提一次，取上清勿将中间层吸入。 DNA污染：吸上清时将中间层吸入，或处理样品量太大 蛋白、多糖污染：材料中蛋白、多糖含量高，多抽提一次
引物的选择
Oligo dT 选择Oligo dT时，要求RNA必须有PolyA，所以真核生物的mRNA都适用。
适合长链甚至全长mRNA的RT，对RNA样品的质量要求较高，使用OligodT 引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。 随机引物
适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况。第一链cDNA合成 反应以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。 同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5μg总RNA的 随机引物的用量为50ng。 特异性引物
50ng-5μg
Oligo（dT) Primer 2×TS Reaction Mix
1 μL 10 μL
gDNA Remover
1μL
TransScript TM RT/RI Enzyme Mix 1μL
Rnase-Free H2O 42 ℃ 30 min
to 20 μL
85℃ 加热5min 失活TransScript TM RT/RI 与gDNA Remover 。
植物总RNA提取步骤
植物总RNA提取步骤1.实验前准备：-准备适当的植物材料，如叶片、茎等。
- 准备含有RNA酶抑制剂（RNase inhibitor）的提取缓冲液。
-将所有实验用具消毒。
-预先将磨杯、琼脂糖凝胶和RNA电泳仪等设备进行灭菌处理。
2.材料粉碎：-将植物组织用液氮快速冷冻并粉碎。
-将粉碎好的材料转移到预先冷却的磨杯中。
3.细胞破碎：-加入足量的提取缓冲液。
-使用磨杵快速研磨，以破碎细胞壁。
4.除去DNA和蛋白质：-将细胞破碎液转移到离心管中。
-加入等体积与细胞破碎液的冷背离心缓冲液。
-室温下离心10分钟，以去除碎屑和细胞核。
5.总RNA沉淀：-将上清液转移到新的离心管中。
-加入等体积的1:1异丙醇：丙酮的混合液，并轻轻颠倒混匀。
-室温下沉淀10分钟，使RNA沉淀到底部。
-以1万×g离心10分钟，以沉淀RNA。
6.RNA洗涤：-弃上清液，加入70%的乙醇进行洗涤。
-轻轻颠倒离心管，使沉淀的RNA与乙醇充分接触。
-以1万×g离心5分钟，将洗脱的RNA沉淀到底部。
-弃乙醇，将离心管倒置在纸巾上，使其自然风干。
7.RNA溶解：-加入适量的DEPC水（二甲基亚砜）或没食子酸钠进行RNA的溶解。
-使用微量离心把沉淀的RNA溶解均匀。
8.RNA质量检测：-使用紫外光谱仪检测RNA的浓度和纯度。
-使用琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性。
总结起来，植物总RNA提取的步骤包括材料粉碎、细胞破碎、除去DNA和蛋白质、总RNA沉淀、RNA洗涤、RNA溶解和RNA质量检测。
这些步骤需要仔细操作，以保证提取到高质量的总RNA样品。
提取到的总RNA 可用于后续的RT-PCR、实时荧光定量PCR、Northern blot等分子生物学实验。
RNA提取的实验步骤及结果剖析
RNA提取的实验步骤及结果剖析本文详细介绍RNA提取前的实验准备、RNA提取的详细实验步骤，以及对RNA提取结果的剖析。
希望可以大家在做克隆和荧光定量时有所帮助！注意:RNA提取也做到无菌操作的水平！ⅠTrizol法实验原理Trizol内含异硫氰酸胍能迅速破碎细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性并释放出核酸；由于释放出的DNA和RNA在特定pH值下的溶解度不同，且分别位于中间相和水相，从而使DNA和RNA得到分离；取出水相后，通过有机溶剂(氯仿)抽提及异丙醇沉淀，可得到纯净RNA。
预备实验1.DEPC简介DEPC是一种潜在的致癌物质，主要是能生成乙酯基衍生物和乙酯类衍生物，其中尿烷是一种已知的致癌物质。
DEPC有刺激性，对眼睛和气道粘膜有强刺激，在操作中应尽量在通风的条件下进行，DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴口罩，不小心占到手上注意立即冲洗。
由于DEPC是一种酯类，较难溶于水，故通过加热搅拌的方式来使其溶解。
2.1%的DEPC水的制备（1L）取1mlDEPC于999ml去离子水中，37℃在磁力搅拌器上搅拌4h 以上使其溶解。
此溶液即1%DEPC水。
注意：①DEPC与水反应后会产生大量的气体，可用塑料膜将瓶口扎紧，剧烈混匀后通过观察塑料膜是否胀气来判断反应是否充分②DEPC水的量可以根据需要配制即可，原则上确保所有的物品都能浸在DEPC水中。
③制备的1%DEPC水，应留下100ml左右并装入100ml左右的试剂瓶中，以备溶解RNA用。
注意：根据试剂瓶的大小调节所留的DEPC水的量，原则是确保DEPC水能够充满整个试剂瓶，并且盛有DEPC水的试剂瓶也要放置过夜，然后高温高压灭菌使DEPC分解后才能用于溶解RNA。
④配制DEPC处理水时用棕色瓶。
3.离心管、各种大小的枪头（1000ul、200/100ul、10ul）根据步骤及提取的量计算所需的个数，然后用制好的1%DEPC浸泡比计算数目略多的过夜处理。
实验一、RNA提取方法及原理
OD260 /OD280 比值偏低
蛋白质污染：
不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分 层的离心力和时间要足够。
减少起始样品量，确保裂解完全、彻底
ห้องสมุดไป่ตู้
解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。
苯酚残留：
不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分 层的离心力和时间要足够。 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。
复习核酸的提取方法
RNA的提取 苯酚水溶液提取 细胞破碎 → 匀浆等体积90％苯酚水溶液振 荡→RNA、Pro分开→RNA、多糖（水层）； DNA、Pro（苯酚层） 冷酚法、热酚法，注意苯酚除杂
复习核酸的提取方法
DNA提取 浓盐法：1mol/L氯化钠溶液提取，＋含少 量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质 或：先用稀盐除去RNA－Pro，再用浓盐提 取 也可用苯酚法，苯酚层得到 DNA、Pro
5g拟南芥叶片1mg0205g低丰度烟草叶片1mg00501g玉米叶片1mg二方法及原理1rna的提取流程1样本前处理2细胞裂解3rna的纯化及获得rna提取流程样品前处理注意点选择新鲜血液不得超过4小时选择新鲜组织选择新鲜组织生长旺盛的组织生长旺盛的组织选择新鲜的幼嫩组织选择处于生长旺盛的时期收集细胞可将新鲜血液先进行红细胞裂解得到的白细胞然后加入一定量的trnzol70保存较长时间推荐使用专门的rna样品推荐使用专门的rna样品储存液进行储存rna提取流程样品前处理中如何保存样本去掉培养基加入一定量trnzol70保存较长时间液氮或加入rnase抑制剂中保存避免反复冻融rna提取流程细胞裂解以释放rna异硫氰酸胍酚trnzol总rna提取试剂独特配方rnaplant植物rna提取试剂胍盐巯基乙醇rnaprep系列rna提取试剂盒rna提取流程rna的纯化及获得rna纯化要求1纯化后不应存在对酶如逆转录酶有抑制作用物质2排除有机溶剂和金属离子的污染3蛋白质多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度4排除dna分子的污染2
拟南芥总RNA提取流程图
实验一、拟南芥总RNA 的提取 植物组织匀浆处理: 将50-100mg 样品置于液氮中研磨成粉末，加入1ml TRIzol ，使之充分混匀，室温下静置5min加入220µl 氯仿，充分振荡混匀，静置3min（以下要格外小心，防止RNA 降解）6℃，11,800g ，离心15min ；再次抽提，取650µl 上清，加130µl 氯仿。
充分振荡，静置3min 6℃，11,800g ，离心15min离心期间可先加500µl 的异戊醇，离心完后吸取上清（约500µl ） 上下颠倒几次，混匀，室温下静置10min6℃，11800g ，离心10min弃上清，加入1ml 75%的乙醇，充分洗涤沉淀6℃，7000g ，离心5min弃上清。
离心30s ，将残余液体除去室温下干燥，加200µl DEPC ，20µl NaAC ，660 µl 无水乙醇，混匀后，-80静置1hr 以上6℃，11800g ，离心20min弃上清，离心30s ，将残余液体除去晾干，加10µl DEPC 水，冰上静置10 min ，弹匀溶解吸取0.5ul 的RNA 样品+1µl 10x loarding buffer+0.1µl EB+8.5µl DEPC 水用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的质量所用试剂：2、氯仿3、异丙醇4、乙醇200ml NaAC(3M,PH 5.0)配制：分子量82.03称取49.38 g NaAC，加100多ml DEPC水,加冰醋酸调PH值（约20ml左右）边定容边条PH值，加水会使PH值下降。
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RNA提取实验指导
一、实验材料及试剂：
1.仪器与耗材
冷冻离心机，20μL 、200μL枪头，1.5mL 离心管、20 μL、200μL、1mL 移液器，1L烧杯，研钵，研磨棒，研磨杵
2.试剂
DEPC 1000倍稀释液，液氮，TRNzol-A+总RNA提取试剂，：氯仿、异丙醇、RNase-Free ddH2O 、75%乙醇(用RNase-Free ddH2O配制)。
二、实验目的：
提取拟南芥阳性植株的总RNA，拟进行RT-PCR检测，确定目的基因在拟南芥中进行了表达。
三、实验步骤：
1. 样品处理
取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在TRNzol–A+中研磨，研磨要迅速，最好不要超过1 min。
大约100 mg 叶片使用1 ml TRNzol–A+。
2. 将匀浆样品在15-30℃放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
3. 可选步骤：4℃ 12,000 rpm(~13,400×g) 离心10 min，取上清。
注意：如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。
处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。
取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
4. 每使用1 ml TRNzol-A+加0.2 ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15 sec，室温放置3 min。
注意：如不能旋涡混匀，可手动快速颠倒混匀2 min。
5. 4℃ 12,000 rpm(~13,400×g)离心10-15 min。
样品会分成三层：黄色的有机相，
中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约500 μl）转移到新管中。
6. 在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20-30 min。
7. 4℃ 12,000 rpm(~13,400×g)离心10 min，去上清。
离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。
8. 加入1 ml 75%乙醇（用RNase-Free ddH2O配制）洗涤沉淀。
每使用1 ml
TRNzol-A+至少用1 ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤。
9. 4℃ 5,000 rpm(~2,300×g)离心3 min。
倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余的少
量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。
10. 室温放置晾干（不要晾的过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3 min左右即可），根据实验需要，加入30-100 μl RNase-Free ddH2O，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。
10．紫外分光光度计检测RNA 浓度，将1 μlRNA样液稀释至100 μl，在紫外分光光度计测A260、A280的OD值，再根据它们的比值确定浓度和纯度，而合格的DNA，其OD260/OD280值应在1.8～
2.0之间；
注意事项：
1．匀浆后，加氯仿前，样品可在-70℃放置一个月。
2．RNA沉淀可以保存在75%乙醇中，2-8℃一个星期以上或-20℃一年。
3．若提取细菌RNA，推荐应用RNAprep pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒（目录号：DP430）。
预防RNase污染，应注意以下几方面：
1．经常更换新手套。
因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
2．使用RNase-Free的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3．RNA在TRNzol–A+试剂中时不会被RNase降解。
但提取后继续处理过程中应使用RNase- Free的塑料和玻璃器皿。
玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10 min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4．配制溶液应使用RNase-Free ddH2O。
（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(V/V)，放置过夜，高压灭菌）。
5. RNA提取过程中所有器材都经过RNase灭活处理，所用水皆用0.1% DEPC处
理，所有溶液都用无RNase的水配置。
离心管和枪头经过0.1% DEPC水溶液浸泡12h，121 ℃高压灭菌30 min，玻璃器皿、研钵、杵、剪刀、镊子等在180 ℃烘烤8 h。