PEG-EPO中游离PEG的示差折光率检测

摘要：目的摇 建立完善折光率检测 孕耘郧 原 耘孕韵 中游离 孕耘郧。方法摇 色谱柱为 栽燥泽燥澡葬葬泽 栽杂运 杂孕 原 缘孕宰（苑郾 缘 皂皂 伊 苑缘 皂皂，员园 μ皂）和 栽杂运 郧猿园园园 杂宰曾（造 苑郾 愿 皂皂 伊 猿园园 皂皂，缘 μ皂），流动相为 园郾 园员 皂燥造·蕴 原员 柠檬酸，责匀 猿郾 园，流速 员 皂蕴 ·皂蚤灶 原 员 ，柱温 猿缘 益 ，应用 宰葬贼藻则泽 圆源员源 示差折光率检测器检测。结果摇 游离 孕耘郧 溶液在 缘郾 园 耀 愿园 μ早·皂蕴 原 员 范围 内有良好的线性关系，则 越 员；重复性试验峰面积的 砸杂阅 值为 园郾 源远豫 ，主峰保留时间的 砸杂阅 值为 园郾 圆猿豫 ；平均回收率 为 员园员郾 远豫（ 灶 越 怨，砸杂阅 为 员郾 怨圆豫 ）。结论摇 该方法操作简便，快速准确，可以很好地用于 孕耘郧 原 耘孕韵 中游离 孕耘郧 的检测，经过适当调整，同样可用于其它其他 孕耘郧 化蛋白药物中游离 孕耘郧 的检测。
表 圆摇 重复性试验结果
样品上样次数
主峰面积
主峰保留时间（ 皂蚤灶）
员 圆 猿 源 缘 砸杂阅（ 豫 ）
圆园 缘远愿 圆园 源员猿 圆园 缘缘怨 圆园 远苑员 圆园 远园缘 园郾 源远
怨郾 圆园缘 怨郾 圆圆园 怨郾 圆源员 怨郾 圆源怨 怨郾 圆缘缘 园郾 圆猿
猿郾 猿摇 回收率试验摇 取已知游离 孕耘郧 原 杂孕粤 浓度的
氢氧化钠溶液调节 责匀 至 苑郾 缘，并用纯化水定容至
缘园园 皂蕴。
将 孕耘郧 原 杂孕粤 试剂（ 于 原 圆园 益 贮藏）热平衡至
室温 猿园 皂蚤灶。精 确 称 量 缘园郾 园 皂早 孕耘郧 试 剂 溶 于 缘
皂蕴 稀释缓冲液中，混匀，分装后冻存。用前稀释至
一定浓度做为作为 孕耘郧 原 杂孕粤 标准溶液。
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药学研究·Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３ Ｖｏｌ． ３２，Ｎｏ． １１
孕耘郧 原 耘孕韵 中游离 孕耘郧 的示差折光率检测
庞甲佩员，圆 ，解福生员，圆 ，胥国立员 ，赵婷婷员 ，马立平员
（员郾 山东阿华生物药业有限公司，山东 东阿 圆缘圆圆园员；圆郾 山东东阿阿胶股份有限公司，山东 东阿 圆缘圆圆园员）
摇 基金项目：国家重大新药创制（ 晕燥援 圆园员圆在载园怨圆园圆 原 园猿员 原 园园源）
摇 作者简介：万庞方甲佩数，据男，工程师，研究方向：生物制药，耘 原 皂葬蚤造：责葬灶早躁蚤葬责藻蚤岳 员远猿援 糟燥皂
药学研究·Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３ Ｖｏｌ． ３２，Ｎｏ． １１
越 缘苑猿郾 缘悦 原 圆 缘圆苑郾 源，则 越 员。结果表明 孕耘郧 原 杂孕粤 溶
液在 缘郾 园 耀 愿园 μ早·皂蕴 原 员 范围内有良好的线性关系。 猿郾 圆摇 重 复万性方数试据验 摇 取 孕耘郧 原 杂孕粤 样 品（ 源园 μ早 ·
皂蕴 原 员 ）重复进样 缘 次，每次进样 员园园 μ蕴，结果见表 圆。峰 面 积 的 砸杂阅 值 为 园郾 源远豫 ，主 峰 保 留 时 间 的 砸杂阅 值为 园郾 圆猿豫 ，符 合《 中 国 药 典》圆园员园 年 版（ 三 部）附录高效液相色谱法 砸杂阅 值小于 圆豫 的要求，表 明方法的重复性良好。
关键词：高效液相色谱法；孕耘郧 原 耘孕韵；游离 孕耘郧；示差折光率检测器 中图分类号：砸怨圆苑援 员摇 文献标识码：粤摇 文章编号：圆园怨缘 原 缘猿苑缘（圆园员猿）员员 原 园远源远 原 园园猿
粤 凿蚤枣枣藻则藻灶贼蚤葬造 则藻枣则葬糟贼蚤增藻 蚤灶凿藻曾 凿藻贼藻糟贼蚤灶早 皂藻贼澡燥凿 燥枣 枣则藻藻 孕耘郧 蚤灶 孕耘郧 原 耘孕韵 孕粤晕郧 允蚤葬鄄责藻蚤员，圆 ，载陨耘 云怎鄄泽澡藻灶早员，圆 ，载哉 郧怎燥鄄造蚤员 ，在匀粤韵 栽蚤灶早鄄贼蚤灶早员 ，酝粤 蕴蚤鄄责蚤灶早员
按上述 色 谱 条 件 分 别 进 行 测 定，进 样 量 均 为 员园园
μ蕴，记录色谱图，结果见表 员。
表 员摇 线性考察结果
孕耘郧 原 杂孕粤 浓度（ μ早·皂蕴 原 员 ） 缘郾 园 员园 圆园
源园
愿园
峰面积
源源缘 猿 员远园 愿 苑怨缘 圆园 缘圆员 源猿 猿猿缘
摇 摇 以 孕耘郧 原 杂孕粤 浓度（ 悦）为横坐标，测得的峰面 积响应值（ 粤）为纵坐标做标准曲线，得回归方程：粤

平均回收 砸杂阅 率（豫 ） （豫 ）
员园员郾 员
员园园郾 怨
员郾 怨圆
员园圆郾 愿
猿郾 源摇 原液游离 孕耘郧 检测结果摇 按照上述方法，分
别对 猿 批 孕耘郧 原 耘孕韵 原液中游离 孕耘郧 进行检测，并
根据确定的浓度 原 峰面积线性方程计算，得到原液
中游离 孕耘郧 的含量，均符合规定的小于 缘园 μ早 孕耘郧
型的重组人促红素，临床效果有明显的提高。 为控制 药 物 质 量，必 须 对 孕耘郧 原 耘孕韵 中 游 离
孕耘郧 含量进行检测和控制。我们经过理论分析和 实验摸索，应用串联的离子交换和凝胶分析柱将游 离 孕耘郧 与 孕耘郧 原 耘孕韵 分离，再应用示差折光率检测 器检测游离 孕耘郧 吸收峰，通过与标准曲线比较，计 算出 孕耘郧 原 耘孕韵 中游离 孕耘郧 的含量，从而建立了 孕耘郧 原 耘孕韵 样品中游离 孕耘郧 含量的检测方法。 员摇 仪器与试药 员郾 员摇 仪器 摇 宰葬贼藻则泽 圆远怨缘 高效液相色谱仪，宰葬贼藻则泽
样量：员园园 μ蕴。 圆郾 圆摇 孕耘郧 原 杂孕粤 标准溶液（员园 皂早·皂蕴 原员）的制备摇 配 制稀释缓冲液（员园 皂皂燥造·蕴 原员 磷酸钾，员园 皂皂燥造·蕴 原员 氯
化钠，责匀 苑郾 缘，缘园园 皂蕴）。称取 园郾 远愿 早 磷酸二氢钾和 圆郾 怨圆 早 氯化钠溶于 源园园 皂蕴 纯化水中，用 员 皂燥造·蕴 原 员
原 杂孕粤 辕 皂早 蛋白的质量标准，结果见表 源。
表 源摇 游离 孕耘郧 检测结果
游离 孕耘郧 浓度 原液浓度 游离 孕耘郧 含量 原液批号 主峰面积 （μ早·皂蕴 原员） （皂早·皂蕴 原员）（μ早·皂早 原员蛋白）
孕耘圆园员圆园猿园员 猿 怨员园
员员郾 圆圆
员郾 员源
怨郾 愿缘
加入量 （ μ早） 园郾 缘园园
园郾 苑缘园
员郾 园园园
测定含量 （ μ早） 员郾 员园愿 员郾 员员源 员郾 员园园 员郾 猿苑猿 员郾 猿远园 员郾 猿圆愿 员郾 远源员 员郾 远猿园 员郾 远圆苑
回收率 （豫） 员园员郾 圆 员园圆郾 源
怨怨郾 远 员园猿郾 缘 员园员郾 苑 怨苑郾 缘 员园猿郾 远 员园圆郾 缘 员园圆郾 圆
圆郾 猿摇 试验方法摇 将 杂孕 原 缘孕宰 柱进液端接入液相系
统泵后，将 郧猿园园园 杂宰曾造 柱与 杂孕 原 缘孕宰 柱顺序连接，
郧猿园园园 杂宰曾造 柱出液端接入示差折光检测器。用流
动相 粤 平衡分析柱与检 测 器，直 到 获 得 稳 定 的 基
线。上样，用流动相 粤 继续平衡 圆园 皂蚤灶，检测吸收
峰；用流动相 月 再生系统 缘 皂蚤灶；再用流动相 粤 平衡
猿园 皂蚤灶，下次备用，色谱图见图 员，图 圆。
猿摇 结果
猿郾 员摇 线 性 考 察 摇 取 配 制 的 孕耘郧 原 杂孕粤 标 准 溶 液 （员园 皂早·皂蕴 原 员 ），用稀释缓冲液精密稀释，最终配制
浓度分别为 缘郾 园、员园、圆园、源园、愿园 μ早 · 皂蕴 原 员 的 溶 液。
孕耘郧 原 耘孕韵 样品，分别加入等体积 员园、员缘、圆园 μ早 · 皂蕴 原 员 的低、中、高 猿 个浓度的样品，做为作为供试品
溶液，每个样品测定 猿 次，计算加样回收率，砸杂阅 值
为 员郾 怨圆豫 ，结果见表 猿。
表 猿摇 回收率试验结果
样品含量 （ μ早） 园郾 远园圆
园郾 缘怨苑
园郾 远园缘
（员郾 杂澡葬灶凿燥灶早 耘鄄澡怎葬 月蚤燥责澡葬则皂葬糟赠 悦燥郾 ，蕴贼凿郾 ，阅燥灶早藻 圆缘圆圆园员，悦澡蚤灶葬；圆郾 杂澡葬灶凿燥灶早 阅燥灶早鄄藻 耘鄄躁蚤葬燥 悦燥郾 ，蕴贼凿郾 ，阅燥灶早藻 圆缘圆圆园员，悦澡蚤灶葬）
粤遭泽贼则葬糟贼：韵遭躁藻糟贼蚤增藻 摇 栽燥 藻泽贼葬遭造蚤泽澡 葬 凿蚤枣枣藻则藻灶贼蚤葬造 则藻枣则葬糟贼蚤增藻 蚤灶凿藻曾 凿藻贼藻糟贼蚤灶早 皂藻贼澡燥凿 燥枣 枣则藻藻 孕耘郧 蚤灶 孕耘郧 原 耘孕韵郾 酝藻贼澡燥凿泽摇 栽澡藻 栽燥泽燥澡葬葬泽 栽杂运 杂孕 原 缘孕宰（苑郾 缘 皂皂 伊 苑缘 皂皂，员园 μ皂）葬灶凿 栽杂运 郧猿园园园 杂宰曾（造 苑郾 愿 皂皂 伊 猿园园 皂皂，缘 μ皂）糟澡则燥皂葬贼燥早则葬责澡蚤糟 糟燥造怎皂灶泽 憎藻则藻 怎泽藻凿郾 栽澡藻 皂燥遭蚤造藻 责澡葬泽藻 憎葬泽 园郾 园员 皂燥造·蕴 原员 糟蚤贼则蚤糟 葬糟蚤凿（ 责匀 猿郾 园）憎蚤贼澡 枣造燥憎 则葬贼藻 燥枣 员郾 园 皂蕴·皂蚤灶 原员郾 栽澡藻 糟燥造怎皂灶 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 憎葬泽 猿缘 益郾 栽澡藻 凿蚤枣枣藻则藻灶贼蚤葬造 则藻枣则葬糟贼蚤增藻 蚤灶凿藻曾 凿藻贼藻糟贼燥则 燥枣 宰葬贼藻则泽 圆源员源 憎葬泽 怎泽藻凿郾 砸藻泽怎造贼泽 摇 栽澡藻 造蚤灶藻葬则 则葬灶早藻 燥枣 枣则藻藻 孕耘郧 憎葬泽 早燥燥凿 蚤灶 缘郾 园 耀 愿园 μ早·皂蕴 原（员 则 越 员）郾 栽澡藻 砸杂阅 燥枣 责藻葬噪 葬则藻葬 燥枣 则藻责藻葬贼藻凿 泽葬皂责造蚤灶早 憎葬泽 园郾 源远豫 ，葬灶凿 贼澡藻 砸杂阅 燥枣 则藻贼藻灶贼蚤燥灶 贼蚤皂藻 燥枣 则藻责藻葬贼藻凿 泽葬皂责造蚤灶早 憎葬泽 园郾 圆猿豫 郾 栽澡藻 葬增藻则葬早藻 则藻糟燥增藻则赠 憎葬泽 员园员郾 远豫（ 灶 越 怨，砸杂阅 憎葬泽 员郾 怨圆豫 ）郾 悦燥灶糟造怎泽蚤燥灶摇 栽澡藻 藻泽贼葬遭造蚤泽澡藻凿 皂藻贼澡燥凿 憎葬泽 泽蚤皂责造藻，泽藻灶泽蚤贼蚤增藻 葬灶凿 葬糟糟怎则葬贼藻，葬灶凿 糟葬灶 遭藻 怎泽藻凿 枣燥则 贼澡藻 凿藻贼藻则皂蚤灶葬鄄 贼蚤燥灶 燥枣 枣则藻藻 孕耘郧 蚤灶 孕耘郧 原 耘孕韵郾 月藻蚤灶早 责则燥责藻则造赠 葬凿躁怎泽贼藻凿，贼澡蚤泽 皂藻贼澡燥凿 糟葬灶 葬造泽燥 遭藻 怎泽藻凿 枣燥则 贼澡藻 凿藻贼藻则皂蚤灶葬贼蚤燥灶 燥枣 枣则藻藻 孕耘郧 蚤灶 燥贼澡藻则 责则燥贼藻蚤灶 凿则怎早 贼澡葬贼 憎葬泽 皂燥凿蚤枣蚤藻凿 遭赠 孕耘郧郾