体外分析技术
体外分析技术

Ag
25
50
100
200
400
800
*Ag
Ab
分离B、F
B1%
B2%
B3%
B4%
B5%
B6%
1
2
3
4
5
6
B%
?
B%
F%
B/F
Calibration Curve
优缺点比较
1、放射免疫分析技术
放射免疫技术是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性与抗原抗体反应的特异性相结合的一类免疫测定技术。 放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)——以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。 免疫放射分析(immunoradiometric assay,IRMA)——以过量标记抗体与抗原非竞争结合,采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。
不同的肿瘤标记物可能出现在相同的粘蛋白上 在肿瘤细胞株中CA199,CA50和CA242共同表达于 MUC-1和诞腺蛋白中。(Baeckstrom et al, 1992)
肿瘤的发展及诊断期
肿瘤标志物在全球的应用情况
肿瘤标志物的分类(化学特性)
癌胚抗原类标志物 糖类抗原标记物 酶类标志物 激素类标志物 癌基因 其他
肿瘤与肿瘤标记物
相同的肿瘤可能检测出多种不同的肿瘤标记物 相同的肿瘤标记物可能出现在不同的粘蛋白上 CA19-9和CA50已经在不同的粘蛋白核心上得到鉴定: MUC-1,MUC-3。(Baeckstrom et al, 1992和1995) 涎腺蛋白。(Baeckstrom et al,1995) 颌下腺粘蛋白 支气管肺泡粘蛋白
1、放射免疫分析技术
优点:超微量分析技术,具有很高的精密度、灵敏度和准确度 缺点:反应条件要求一般,但该技术所用试剂具有放射性,对人体有一定的危害,实验人员应加强防护。同时试剂存在半衰期,试剂必须在半衰期内用完,否则试剂会作废,这需要科学地做好试剂计划。另外反应过程中抗原的含量低到一定程度时会出现不确定因素,使灵敏度受到限制。
核医学课件第五章体外分析技术课件

固相分离法(测量B):
将抗体或抗原通过特殊技术联结在固相载体上,免疫反 应在固相载体上完成,达到平衡后形成固相的Ag-Ab 复合 物,可与游离部分分离。 优点:操作简便,迅速,分离效果好,非特异性结合低。
(五)放射性测量仪器
γ井型计数器:测γ射线,125I标记 液体闪烁计数器:测β射线,3H、14C等标记 配计算机系统,自动测量、数据处理、打印结果。
双抗体+沉淀法(测量B): 将双抗体和沉淀法两者结合进行分离。 本法具有两种方法的优点,并克服了双抗体分离时间长 和沉淀法非特异性结合高的缺点。
活性炭吸附法(测量F): 活性炭吸附小分子游离抗原,离心分离后,复合物留 在上清液中,游离抗原在沉淀物中,测量沉淀物中的放射 性 F。 优点:本法操作简便,分离速度快,价格低廉。 缺点:易于解离,分离效果时间和温度的影响较大,非特 异性结合较高。
一、基本原理:
放射性标记的抗原和非标记抗原(标准抗原或被测抗原) 同时与限量的特异性抗体进行竞争性免疫结合反应,这种竞 争关系可用以下反应来表示:
*Ag:标记抗原 Ab:特异性抗体 Ag-Ab:非标记抗原抗体复合物
Ag:非标记抗原 *Ag-Ab:标记抗原抗体复合物
*Ag与Ag的免疫活性完全相同,对Ab具有同样的亲和力;
(3)分离方法主要是使大分子和小分子物质分离。
双抗体法(测量B): 用抗原免疫动物而产生的抗体称为第一抗体,用第一抗 体再免疫另一种动物所产生的抗体称为第二抗体。
当RIA反应完成后,于反应液中加入第二抗体,第二抗 体则与含有第一抗体的免疫复合物B相结合形成第二抗体复 合物,其分子量比第一抗体复合物大,可用离心方法分离 出来,称为双抗体法(double antibody method)。
体外诊断技术在临床上的应用

体外诊断技术在临床上的应用体外诊断技术是一种重要的医疗技术,对临床医学具有重大意义。
它可以通过对人体外部的检测和分析,确定或排除一系列疾病的发生和发展过程,并为临床医生提供重要的参考意见。
体外诊断技术的种类非常多样,包括常见的血液、尿液、粪便、皮肤、呼吸、泌尿系统等检测,以及更为高级的孕前、遗传、肿瘤标志物等体液检测。
它们可以为医生提供有效的诊断依据,辅助治疗计划的制定和调整。
其中,血液检测是目前临床应用最广泛和最常见的检测方法之一。
它可以通过采集患者的血液样本,对其中的血细胞、血小板、蛋白质、激素、病原体等进行分析和筛查。
其中常见的血液检测项目包括:血常规、血红蛋白、白细胞计数、血小板计数、C反应蛋白等指标的检测。
这些指标可以全面反映身体的免疫状态、炎症水平、溶血状况等等。
通过对血液检测数据的分析,医生可以更加准确地判断患者的病情和治疗方案的有效性。
此外,尿液检查也是临床检查中比较重要的一种体外检查方法。
尿液检测可以通过简单的实验室检查,确定患者体内的正常代谢水平以及体内是否存在感染、结石、癌症等问题。
通常尿液检查提供的信息包括:尿蛋白、白细胞、红细胞、细菌、PH值等。
此外,还包括尿液的虫卵和寄生虫。
通过对尿液检查数据的分析,可以为患者提供有效且快速的疾病诊断和治疗方案建议。
近年来,体外诊断技术在临床上的应用已经越来越广泛。
一方面体外诊断技术的数据处理方式越来越便捷和快速,另一方面,许多新的检测技术和检测方法的出现都为诊断提供了新的可能和突破口。
比如,流式细胞术技术的发展,可以对某些血液学疾病进行精准检测;基因检测技术的出现,可以对遗传性疾病和某些肿瘤进行早期筛查和诊断;化学发光分析技术提高了质谱分析的准确性和敏感性,使肿瘤标志物的检测效果大为改善。
总之,体外诊断技术在临床上的应用已经成为实现精准诊疗的最有效方式之一。
它需要科学家、医疗机构、政府监管部门等多个方面的努力,才能为患者提供更加全面、更加准确、更加快速的诊疗服务。
核医学体外放射分析技术课件

二、结合反应动力学规律
• 遵守质量作用定律 • [L]+[B] 适当的实验条件 [LB]
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合(competitive binding) • 过量的配体与有限量的结合剂发生竞争性
结合反应。 • 2、非竞争结合(non-competitive binding) • 过量的结合剂与有限量的配体,在非竞争
的条件下发生结合反应。
衍生设计出两种方法学
• 1、竞争结合(主要应用:放射免疫分析)
• [L]+ [L*]+[B] [LB] +[L*B]
• 2、非竞争结合
•结合在试管 或包被珠上
• Sp.Ab1+Ag Sp.Ab1.Ag
• Sp.Ab1.Ag +Ab2* Sp.Ab1.Ag.Ab2*+Ab2*
优点
• 慢性淋巴细胞性甲状腺炎: • 早期:T3,T4升高,然后降低,
TSH,TGAB,TPOAB升高。 • 甲状腺肿瘤:TG升高。 • 全身性疾病:心血管疾病、肿瘤等: • T3下降,rT3、TSH升高。
(二)肾上腺疾病
• 皮质醇增多症: • ACTH\COR正常情况下有节律分泌,检测
可以与单纯性肥胖区分。 • 原发性醛固酮增多症:尿游离皮质醇
• 反应误差关系 • 精密度图
• 2、准确度:测的值与其标称值之间的 相符程度。
• 3、灵敏度(sensitivity): • 4、特异性(specificity) • 5、稳定性(stability)
(三)质量评价
• 内部质量控制 • 外部质量控制
三、以配体与受体间结合反应 为基础的分析系统
体外诊断与检测技术的原理与发展

体外诊断与检测技术的原理与发展概述体外诊断与检测技术(In vitro diagnostics, IVD)是医学领域中非常重要的一项技术,它通过收集和分析来自人体外部的样本,如血液、尿液和唾液等,以获取关于疾病状态和生理功能的信息。
随着生物科学、工程技术和信息技术的迅速发展,体外诊断与检测技术在临床医学、流行病学研究、药物试验等方面起着至关重要的作用。
一、体外诊断与检测技术的原理1. 样本采集体外诊断与检测技术需要从人体外部收集样本,例如静脉血或毛细血管血液、尿液、唾液或组织等。
正确的样本采集对准确诊断至关重要。
2. 样本预处理得到样本后,需要对其进行预处理以去除干扰物质,并提取目标分子或细胞。
例如,在某些血液样本中,红细胞可以通过离心或过滤来分离。
3. 分子分析为了获得具体的诊断信息,体外诊断与检测技术需要对目标分子进行分析。
这包括了多种不同的方法,如聚合酶链反应(PCR)、DNA测序、荧光染料标记等。
通过这些方法,可以进行病原体检测、基因突变筛查、药物代谢分析等。
4. 细胞分析除了分子分析外,体外诊断与检测技术还可用于细胞学研究和临床细胞诊断。
常用的方法包括流式细胞术、显微镜观察和细胞培养等。
这些技术能够帮助医生判断肿瘤是否为恶性,评估免疫功能以及检测某些特定蛋白质的表达水平。
二、体外诊断与检测技术的发展1. 生物传感器生物传感器是一类将生物材料或生化成份转变为可读取信号的装置。
它结合了微电子器件和生物化学反应技术,使其能够实现快速而准确的检测结果。
生物传感器在血液中监测血糖水平、尿液中检测验孕或疾病诊断等方面被广泛应用。
2. 快速诊断试剂盒随着临床应用的需求增加,快速诊断试剂盒的发展得到了迅速推动。
这些试剂盒包含了一系列特定的生物标志物检测方法,可以在短时间内提供快速而准确的结果。
常见的例子包括流感试剂盒、乳腺癌指示物(CA15-3)检测试剂盒等。
3. 基因组学与蛋白质组学近年来,基因组学和蛋白质组学的发展为体外诊断与检测技术带来了新的突破。
实验核医学-体外分析技术

Experimental nuclear medicine
体外分析技术
In Vitro Radioassay
主讲人/制作人:
体外分析技术
In Vitro Radioassay
一、体外放射分析技术 二、非放射免疫分析技术 三、临床应用
结束
体外放射分析
一、体外放射分析的概念和分类
二、放射免疫分析(RIA) 1、基本原理 2、必备条件 3、质量控制
放射免疫分析Radioimmunoassay(RIA)
一、基本原理:
放射免疫分析是竞争性体外放射分析原理的代表。 在体外,以放射性核素标记抗原和非标记抗原,同时 与适量的特异性抗体发生的竞争性免疫结合抑制反应。
*Ag + Ab + Ag
*Ag-Ab + *Ag
Ag-Ab十Ag
RIA操作步骤:
1、加样 2、温浴反应 3、分离B/F 4、放射性测量 5、绘制标准曲 线,查找待测物 浓度
b值稳定,r>0.99。
4.ED25、ED50及ED75 指标准曲线的结合率在25%、50%及75%时对应的抗原浓度值,
它反映标准曲线的稳定性,有助于批间结果的比较。
5.反应误差关系(RER) 是评价RIA整批误差的综合指标,RER应<0.04。
6.质控图
WHO要求在一次实验中,有下列情 况之一者,其结果应予舍弃:
质量控制包括监测各重要环节的质量、测定误差和结果的 可靠性。
(一)、质量控制
1.最高结合率(B0%) 指不加非标记抗原时标记抗原与抗体的结合率,一般要求在30~50%。
2.非特异性结合率(NSB%) 指不加抗体时标记抗原与非特异性物质的结合率,一般要求<5~10%。
核医学课件:体外分析技术

标准曲线
目前已普遍采用计算机进行数据处 理,自动绘制标准曲线,自动换算 样品中被测物质的浓度
实验操作基本步骤
1.加样:加样总体积要保持一致,所处的介质环境 也要一致。
2.孵育:根据不同的分析对象孵育的温度和时间 不同,一般是37℃。
3.分离:选择好的分离方法分离游离抗原和 抗原-抗体复合物。 4.测量:测量游离或结合物部分的放射性。 5.数据处理:绘制标准曲线和待测物浓度的计算
* Ag
基本反应式
Ag-Ab
*Ag:标记抗原,Ag 非标记抗原 Ab:抗体 *Ag- Ab 标记抗原抗体复合物 Ag- Ab 非标记抗原抗体复合物
Ag-Ab+Ag
条件:1.*Ag与Ag 免疫活性相同
2. *Ag与Ab 恒量
*Ag-Ab+*Ag
理
*Ag与Ag由于免疫化学性质一致,共同竞争 性与Ab结合,当*Ag和Ab的量保持恒定, *Ag与Ag之和大于Ab时,则*Ag-Ab复合物的 形成受Ag含量的制约,二者之间存在函数关 系 , 即 Ag 量 越 大 , *Ag-Ab 量 越 小 ; Ag 量 越 小,*Ag-Ab量越大;测定*Ag-Ab或*Ag量即 可推算出被测Ag量
量B、F的cpm
*Ag
B%=B/(B+F)
Ag 1
2
3
4
5 6?
25 50 100 200 400 800
B%
B% 标准曲线
常 用 的 反 应 参 数 有 B%,B/F,F/B、 F%等这些反应变量都可以用作纵坐标来对 应标准抗原的浓度作标准曲线,选用的反应 变量不同,标准曲线的形状也不同。但是这 些标准曲线都是反映的反应变量对应标准抗 原浓度变化而变化的函数关系。
体外分析技术

Dr. Yalow
算出Ag 量的一种超微量分析技术。
6
放射免疫分析法的创立
开创了医学生物学超微量分析方法
使人体内微量生物活性物质的测量成为可能
对现代医学的发展起到推动作用 集中了放射性核素示踪技术的高灵敏度和免疫发应的高特 异性,具有灵敏度高、特异性强、精密度好、应用面广、 方法简便等优点。
7
• R:放射性核素标记抗原
体结合以外,还要和一些杂质蛋白或容器的管壁等结
合,对我们的分析结果产生影响。NSB管是用蒸馏水 代替特异性抗体,在相同条件下反应后测得的放射性。
19
3. 总放射性管(T) 反应后不分离就直接测得的放射性 就是总放射性。表示标记抗原抗体复合物和游离的标 记抗原的总放射性。
4. 标准管(B1~Bn) 放有不同浓度的标准抗原,再加入 相同量的标记抗原和特异抗体。一般在反应后分离出 沉淀,测定沉淀的放射性作为B。 5. 样品管(Bx) 用同剂量的样品代替标准管中的标准 抗原,在相同条件下反应和分离,同样取沉淀测得其 放射性,就可以在绘制的标准曲线上找到样品的浓度。
• 她的发明为我们检测体内微量物质提供了新的手段。
• 但当Yalow教授将稿件投向《科学》杂志时,惨遭拒绝。然后她将文 章改投JCI,暂被拒绝,审稿者要求她把“发现了胰岛素抗体”的词句
改成“发现了结合球蛋白”,因为当时认为抗体是抗细菌的。
• 事实证明Yalow的发现是正确的,是有重大价值的。她于1977年获 得诺贝尔医学奖。在获奖演讲中,她特地向全世界展示了那封拒绝信。
体外分析技术
彭志平 重庆医科大学
1
生物活性物质
• 生物活性物质是指来自生物体内,能作用于生物体、组织、
细胞、生物大分子并产生某种效应的物质。
第五章体外分析技术

的疗效判断,评价胰岛素产品质量.
骨钙素解甲状
腺\甲状旁腺功能
肝脏
急性黄疸型肝炎\慢性活动性肝炎\肝硬化
胆酸 放免<300μg/dl 肝癌\胆汁淤积时明显升高,慢性迁延性肝
炎及胆囊炎轻度升高。妊娠胆淤明显升高。
透明质酸 放免 <120μg/l 肝硬化\肝纤维化\慢性肝炎时升高,肝硬
同上
甲状腺球 放免〈30%
甲状腺自身免疫疾病特异指
蛋白抗体
标,桥本氏甲状腺炎
甲状腺微 放免〈20%
甲状腺自身免疫疾病特异指
粒体抗体
标,桥本氏甲状腺炎
TSH 免放 0.4-3.1μIU/ml 鉴别原发与继发甲低,评价下
丘脑-垂体-甲状腺轴功能,垂体瘤,库欣综合征
甲状腺 放免4-14.5μg/ml 诊断甲癌\慢性淋巴细胞性
三、质量控制
Quality Control , QC
(一)定义:质量控制 就是控制误差, 即对分析工作中的误差进行经常性的 检查,遇有质量异常则及时采取对策, 以保证分析误差控制在可接受的范围 内。
放射免疫分析是一类高灵敏度的超微 量分析技术,极易受各种因素的影响 而使检测结果失真,因此必须有严格 的质量控制体系。
CA-153 放免<30U/ml 乳癌诊断特异,乳癌肝及骨转移\卵巢癌\
子宫内膜癌一定程度增高
肾上腺及肾脏
尿免疫球蛋白 放免<8mg/l 早期诊断肾脏受损\受损部位及程度判断
尿白蛋白 放免<10mg/l
同上
尿β2微球蛋白 放免<230mg/l
同上
上午8时: 50~280μg/l 综合征,肾上腺肿瘤、肿瘤、应激
糖类抗原 放免<20mg/l 肿瘤诊断\预后, 放化疗及手术后的疗
核医学体外分析技术

资料仅供参考,不当之处,请联系改正。
抗CGMP抗体的交叉反应图
资料仅供参考,不当之处,请联系改正。
(3)高滴度的抗体:
抗体滴度(Titer)指抗体实际应用时的稀释倍数。
稀释倍数越大,抗体的滴度越高,滴度一般要求在1/1000以 上为好。
滴度曲线的目的:确定抗体稀释度;找出抗原和抗体 的最适比例(B/T为50%时的抗体稀释度)。
1Bq=1/S
1Ci=3.7
10¹ºBq
2)保持标记抗原的免疫活性:
每个蛋白质分子上标记1-2个碘原子。
资料仅供参考,不当之处,请联系改正。
3)便于放射性测量:
125I标记的抗原有r射线能直接测量
4)放射化学纯度高: 放射化学纯度: 是指具有免疫活性的标记抗原占总 放射性的百分数。 放化纯度要求大于90%以上
❖ 诺贝尔医学奖获得者- Yalow博士。
❖ 1959年 Yalow和 Berson两位博士在研究胰岛素的抗 体时发展起来的。最早建立的是INS的RIA法。
❖ RIA法是一种高特异性、
❖ 高灵敏度的微量检测技术。
American physicist and medical researcher Rosalyn Yalow, corecipient of the 1977 Nobel Prize in physiology or medicine, "for the development of radioimmunoassays of peptide hormones."
❖ 目的:利用标准曲线来推算出病人样品(Ag)的含量。
❖ 配制一系列的标准品浓度:(0、20、40、80、160和320ng/L)
1B。 2
请简述体外分析技术的发展和现状

请简述体外分析技术的发展和现状
这几年体外分析技术迅猛发展,从基因水平的基因测序、SNP筛查、点突变基因诊断,到蛋白水平的各种生物标志物(biomarker)检测,到细胞水平的循环肿瘤细胞检测(CTC)、薄层液基细胞学检测(TCT),再到组织水平上的PET/CT 等.还有最近比较热的是一滴血可检测多个疾病指标的报道。
总的来说体外分析向更简便,更快捷,非侵入性,多信息化的方向发展。
虽说体外分析产业在中国起步较晚,近年来却发展迅速,深受资本追捧。
中国体外分析市场快速发展,预计将在未来的10~15年内超过美国,成为世界上最大的体外诊断市场。
根据EvaluateMedTech的预测我们可以看到,体外分析产业拥有巨大的潜力。
近年来,国家也从政策层面大力支持和整顿体外诊断行业的发展,从行业整体看,受益于医保覆盖面的提升及医院诊断技术的升级,国内体外分析断产业近年来整体快速成,近年来,随着中国医疗不断的改革,人们对自身健康愈加关注都驱动了体外分析试剂市场的需求,加上国家政策的大力扶持,体外诊断试剂未来将成为并购高发的产业地带。
体外分析技术

体外分析技术体外分析技术是指在试管内进行反应从而测定某生物活性物质的超微量分析技术。
该类技术的特点是高灵敏度和高特异性,广泛用于临床和科学研究的很多领域。
应用最多的是:放射免疫分析、免疫放射分析、受体的放射配基结合分析及非放射性免疫分析。
第一节放射免疫分析一、原理放射免疫分析法 (radioimmunoassay,RIA) 的基本原理是,限量标记抗原[*Ag]和可变量的非标记待测抗原[Ag]与定量的特异抗体[Ab]发生竞争结合反应,通过测定复合物的放射性来计算出待测非标记抗原的量。
这一过程可用下式表示:*Ag + Ag + Ab [AgAb]* + [AgAb]上述式中,Ab的分子数少于*Ag,因此即使系统中没有Ag,仅有*Ag,当反应达到平衡时,绝大部分 (因为是可逆反应,不会是100%) Ab将形成*AgAb复合物。
如果系统中加入Ag,则Ag与*Ag竞争结合Ab,形成AgAb,*AgAb将减少。
Ag越多则*AgAb越少。
实践和理论推导都证明,*AgAb和Ag呈二次方程的函数关系,如以Ag为横坐标,*AgAb (B)或*AgAb 占加入总*Ag的% (B%)为纵坐标,是一条斜率逐步由大变小的下降曲线。
如以游离的*Ag (F)或游离*Ag占加入总*Ag的% (F%)为纵坐标,则是一条斜率逐步由大变小的上升曲线。
也可以*AgAb/*Ag的比值 (R)为纵坐标,也是一条斜率逐步由大变小的上升曲线。
分析中,首先以不同量的已知标准品Ag和定量*Ag及限量Ab进行竞争结合反应,得到以B或B%、F或F%、或R为纵坐标的剂量效应曲线 (也称标准曲线),然后以未知样品测得的B或B%、F或F%、或R从曲线上查出相应的剂量。
二、试剂盒基本试剂试剂盒由国家批准的生产单位提供,提供RIA的主要试剂、操作方法、保存条件及保存期限。
使用者应按说明书的要求合理使用。
如果临床工作需要,使用者可以对试剂稀释度、操作步骤等进行适当修改,但应当对改变了的方案进行精密度、准确度、灵敏度等考核,并作详细记录。
核医学体外分析技术(68页).doc

核医学--体外分析技术
(四)分离方法的5个种类要熟记 分离的目的是放射免疫反应达到平衡 后,使抗原抗体复合物和游离抗体抗原分 开,分别测量其放射性。分离技术直接影 响分析结果的准确性,理想的分离技术应 具备既安全又迅速,不受其他因素干扰, 操作简便,重复性好等优点。
核医学--体外分析技术
1.双抗体法 是用抗原免疫动物产生相应的抗体作为第一 抗体,再以第一抗体为抗原免疫另一种动物,所 产生的抗体为第二抗体。第二抗体与第一抗体形 成的抗原抗体复合物结合后形成第二抗体复合物, 其分子量比第一抗体复合物大,可离心分离出来, 这种方法称为双抗体法(double antibody method)。 优点是:易分离、特异性强、使用方便。 不 足:易受其他因素干扰、成本高、操作时 间长。
核医学--体外分析技术
二、基 本 试 剂 放射免疫分析的反应中主要包括3种剂; 1、抗体( Ab) 2、标记抗原(*Ag) 3、标准抗原(标准品)及试剂盒提 供分离试剂或材料,缓冲液及质量控制 (高、中、低值)用品等。
核医学--体外分析技术
(一) 抗体有3个条件必须满足 需要选择亲和力大、特异性强、滴度高的抗体。 1、抗原和抗体之间的结合能力和其牢固性称亲和力 (affinity),亲和力大者反应结合速度快,解离度小。 2、指抗体分别与相应抗原和抗原结构类似物结合能力 的比较,交叉反应越小,特异性(specificity)越强。 3、稀释倍数简称滴度,滴度(titer)越高,所需的抗 血清量越少,杂质干扰也越少。
90年代时间分辨技术 70年代酶(荧光)免疫技术 (EIA...FEIA)
50年代放免分析技术 (RIA)
(TRFIA)
核医学--体外分析技术
放射免疫分析技术(ra d ioimmunoassay,RIA)
第五章 体外分析技术

1968年Miles和Hales建立了免疫放射分析方法,利用标 记抗体作示踪剂,在反应系统中加入过量的抗体,故其 灵敏度比放射免疫分析法明显提高,而且标准曲线的测 量范围也明显扩大。
放射免疫分析
RADIOIMMUNOASSAY,RIA
Definition
是以抗原抗体的免疫反应 为基础,利用待测抗原与 定量的标记抗原同有限量 的特异性抗体竞争性结合, 以放射性测量为微量定量 手段,获得待测生物样品 中抗原浓度的技术。
Main methods
Ag + Ab + * Ag AgAb + Ag
*Ag + *AgAb
Main methods
放射性标记抗原与非标记抗原(包括标准抗原或待测抗原) 与有限量的特异性抗体发生可逆性竞争结合,形成抗原抗 体复合物。 反应体系中同时存在*Ag、Ag和Ab,而*Ag的量一定、Ab的 量固定,而且Ag+*Ag>>Ab时,随着Ag的增加,*AgAb的 量相应减少,即与Ag(包括标准抗原或待测抗原)的量呈 负相关。当反应达到平衡后,将反应体系中的标记抗原抗体复合物与游离的标记抗原分离,测定其放射性。以标 准抗原的浓度为横坐标,以标记抗原-抗体复合物的结合 率(B/T、B/F、或F/T)为纵坐标,绘制剂量反应曲线, 也称剂量效应曲线(calibration curve)。
Radiolabeled compounds
标记物
合适的核素标记(半衰期、射线类型、能量 等),常用核素有125I和3H 标记物的用量要小,应等于或低于待测物的 最小量 足够的比活度 放化纯度高 免疫活性 稳定性好,贮存不易脱标
Specific binding reagent
体外分析

特异性(specificity):不受交叉反应的程 度 亲和力 (affinity):配体与抗体相互结合 的程度,用亲和力常数表示 滴度 (titer):在 RIA 时,结合 50% 的标记 配体的抗体稀释度;IRMA分析要求较高滴 度(过量)
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分离技术
固相法:将抗体吸附在某种固体支持物 (球、管)上,如塑料、纤维素等材料 双抗法 Ag+Ab AgAb+Ab2 AgAbAb2 Ab2(第二抗体):羊抗兔抗体,也称通用 抗体
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log-logit法
log-logit坐标系及线性回归法: 是目前公认比较好的拟合方法,它是以 结合率的logit值为纵坐标,以标准品浓 度的对数值为横坐标,制成散点图,然 后用最小二乘法对各散点进行直线回归, 得出回归方程,获得标准曲线,可用计 算机或计算器完成
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RIA原理
为了定量地测定待测样品中抗原的含量, 如在这个体系中加入放射性核素标记的 同类抗原,体系中同时存在两个平衡
Ag+Ab + Ag* Ag.Ab Ag*.Ab
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Ag+Ab
------- Ag.Ab
+ Ag* -------- Ag*.Ab
Ag*Ag* 和 Ab 的量保持恒定, Ag* 与 Ag 之和大 于 Ab 时,则 Ag*.Ab 复合物的形成受 Ag 含量 的制约,二者之间存在函数关系,即随着 Ag 浓度的增加, Ag*.Ab 复合物也减少,因
RIA分析误差
系统误差:向一个方向偏离,但可纠正 如标准品不标准、加样器不准等 随机误差:不可避免,但可控制在一定范 围 如加样、分离、放射性测量等
体外诊断技术的创新与应用

体外诊断技术是指通过采集人体样本(如血液、尿液、唾液等)在实验室中进行分析和检测,以获取有关健康状况和疾病诊断的信息。
近年来,体外诊断技术在创新和应用方面取得了许多进展,主要包括以下几个方面:
1. 快速诊断技术:传统的体外诊断技术需要时间和设备支持,而快速诊断技术的出现大大缩短了诊断时间。
例如,基于免疫学原理的快速试纸、快速核酸检测技术等,使得临床医生可以在短时间内得到可靠的诊断结果,有助于迅速制定治疗方案。
2. 微流控芯片技术:微流控芯片技术利用微小通道和微型反应器,可以高效地进行细胞分析、基因检测和蛋白质筛查等。
这种技术不仅具有高灵敏度和高通量的特点,还能够实现样本和试剂的极小消耗,为个性化诊断和治疗提供了可能。
3. 基因测序技术的应用:随着高通量基因测序技术的不断发展,体外诊断领域也开始应用基因测序技术。
通过对个体基因组的深入分析,可以更准确地进行遗传性疾病的诊断和风险评估,为个体化治疗提供依据。
4. 微型化和便携化设备的发展:体外诊断技术逐渐向微型化和便携化方向发展,使得诊断设备更加小巧轻便,可以在实验室以外的场所进行检测,如医疗机构、社区卫生中心甚至家庭。
这种趋势能够提高诊断的便利性和普及性,减少患者就医的成本和时间。
5. 综合信息分析与人工智能技术的应用:体外诊断技术产生的数据越来越庞大,传统方法往往无法充分利用这些信息。
而人工智能技术的发展使得大规模数据的挖掘和分析变得更加可行,能够从海量数据中提取有价值的信息,辅助医生进行诊断和决策。
综上所述,体外诊断技术在创新和应用方面取得了许多进展,包括快速诊断技术、微流控芯片技术、基因测序技术的应用、微型化和便携化设备的发展,以及综合信息分析与人工智能技。
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Berson & Yalow
History review
1960年美国的Berson和 Yalow 将核技术与免疫学 技术结合建立了放射免疫 分析法。 首先用于测定血浆胰岛素 浓度,由于该法对医学的 巨大贡献,1977年Yalow 获得了Nobel Prize。
Yalow
Berson
Radioimmunoassay
3.经过一定时间的温竞争结合反应;4.待竞争结合反应平衡后,分离结合B(Bond)部分和游离F(Free)部分;
5.用放射性探测器测得*Ag-Ab放射性为B或游离*Ag的放射性为F;
6.计算出结合率B%[B/(B+F)×100],或B/B0%;B0为不含Ag的结合率,因Ag为“0”, 故B0 *Ag-Ab的结合率为最大结合率; 7.以B%或B/B0为纵坐标,标准抗原浓度为横坐标,绘制出B%或B/B0随Ag量变化的曲线即 为标准曲线(图4-2)。
免疫放射分析法(Immunoradiometric assay, IRMA) 是1968年由Miles 和Hiles应用125I标记牛血清胰岛 素获得成功而建立的,到70年代中期单克隆抗体 (McAb)的制备技术问世以来,免疫放射分析法的分 析技术得到突破性的发展,使体外放射分析的灵敏 度和精确度不断提高,应用迅速推广。
Ab限量,Ag*定量, Ag*和Ag的量大于 Ab结合位点,二者 通过竞争方式与Ab 结合;随着Ag增加,Ag* 与Ab结合形成Ag*Ab复合 物的放 射量降低,二者变化 成函数关系。
抗原抗体反应
Ag*
反应条件 体积 温度 时间 pH Ab 平衡 非平衡 一步法 二步法
Ag
(标准Ag/样品Ag)
发展
免疫结合反应由竞争性免疫结合反应
非竞争性免疫结合反应
放射性核素标记配体的免疫分析
非放射性核素标记配体的免疫分析
体外分析技术的特点为
1、灵敏度高 可测水平10-9~10-20 。 一般化学分 析法检出极限为10-3~10-6
2、特异性强 具有良好的特异结合试剂,能识 别化学结构上非常相似的物质,甚至能识别立体异 构体,例:能识别T3、T4、RT3(T4脱去外环上第5 位上的碘---T3,脱去内环上第5位上的碘---RT3); 能准确测定生物活性物质的亚单位浓度。
(一) 特异性抗体(specific antibody)
以被测物质为抗原注入动物体内,一定时间后在动 物血清中即可获得能与该抗原特异性结合的抗体, 即为特异性抗体,而含有该抗体的血清称为抗血清 (anriserum)。 在免疫过程中分子量>5,000的多肽和蛋白质才能 产生抗体, 分子量<5,000的肽类物质,需要与载 体蛋白结合才能产生抗体。
体外分析技术
昆明医学院第二临床学院 杨青 副教授
第四章 体外分析技术
本课内容
概 论 第一节放射免疫分析 第二节免疫放射分析法 第三节 其他体外放射分析法 第四节 非放射性标记免疫分析技术
概念
体外分析技术(in vitro assay)是指在体外,即在 反应管中对生物活性物质进行超微量分析的技术。 体外放射分析(in vitiro radioassay)是指在体外条 件下,以放射性核素(radionuclide)标记的配体 (ligand)为示踪剂,以竞争或非竞争性免疫结合 反应为基础,以放射性测量为定量手段,对各种微 量生物活性物质进行检测的一类核医学检测方法。
3.对标记抗原的要求
(1)比活度(specific activity)高而适当 比活度是指每微 克抗原上标记的放射性核素的千贝克数(kBg/ug),其直接 影响方法的灵敏度。 (2)免疫活性(immune activity) 在标记或是蓄存过程 中,可能由于外界条件的变化而造成标记抗原的损伤并使 其活性下降,造成与抗体反应的能力减弱甚至丧失。蛋白质 分子上标记过多的碘原子也会引起免疫活性的改变, (3)放化纯度(radiochemical purity) 是指具有免疫活性的 标记抗原总放射性的百分数,放化纯度应大于95%。若放 射性杂质多,会影响测量的精确度。 (4)便于放射性测量(radionuclide counter) 多采用 发射低能γ光子的125I标记抗原便于进行测量。3H标记抗原则 需用液体闪烁计数器测定。
第一节放射免疫分析 (二) 标记抗原
1.放射性核素标记的抗原(radionuclide labeled antigen,*Ag) 要求高纯度的抗原,其纯度直接影 响方法的特异性、准确度及灵敏度。因此尽可能的 提纯和纯化。 2.标记抗原的放射性核素 主要用125I和3H标记。临 床多用125I标记多肽类激素及蛋白质。3H则标记小 分子化合物。
五、 质量控制
质量控制(quality control,QC)是对分析工作中的误 差进行经常性的检查,遇有质量异常则及时采取对 策,以保证分析误差控制在可接受的范围。 质量控制包括:实验室内部质控和实验室间质控。 实验室内部质控分为批内质控及批间质控。
第二节免疫放射分析法 (Immunoradiometric assay, IRMA)
第一节放射免疫分析 (一)必备条件
RIA的必备条件包括由国家批准的生产单位提供的 试剂、分离技术、测量仪器。 主要试剂的组成是:特异性抗体(specificantibody)、 标记抗原(radionuclide labeled antigen)、标准品 (standard)(非标记抗原)。
四、 免疫放射分析法的特点
1.反应动力学 在抗原与抗体的反应中,反应速度与 反应物浓度呈正比, IRMA标记的单克隆抗体是过量 的, 且反应是非竞争性的全量免疫结合反应,故比 RIA反应速度快,一般2~3小时即达到平衡。 2.灵敏度 与零剂量的计数误差有关。IRMA的零剂 量的反应值是非特异性结合,如果有接近零水平的 抗原与固相结合,标记抗体就应与其结合形成复合 物,只要标记复合物的放射性测量值超过非特异性 反应,就应被检测出。因此,只要将非特异性反应 控制在最小值,IRMA的灵敏度就会明显比RIA的高。
(三) 标准品
标准品(standard)即标准抗原(standard antigen), 用于制作标准曲线,是放射免疫分析(RIA)的定 量基础,其质和量的变化会直接影响样品的测定值。 对标准品的要求是: 1.应选用高纯度的不含杂质的抗原做标准; 2.采用化学结构、免疫活性都与被测抗原一致的抗 原做标准; 3. 标准定量一定要精确。
3、精密度高 反映出来的是随机误差小(统计及 实验误差)。 4、应用广泛 以放射免疫分析法为例目前至少有 300多种生物活性物质的
第一节放射免疫分析 (一)基本原理
竞争性结合反应的经 典标记抗原(Ag*)和 非标记抗原(Ag)与限 量抗体(Ab)竞争性结合 Ag*和Ag具有等同的 与Ab结合能力
一、 原理
二、 试剂
IRMA与RIA的主要区别表
异点 别 类
IRMA 核素标记抗体 过量的 非竞争性结合反应 Ag与Ag-*Ab呈正相关
RIA 核素标记抗原 限量的 竞争性结合反应 Ag与*Ag-Ab呈负相关
标记配体 特异性抗 体 结合反应 测定结果
三、
测定方法)
1.直接法(direct method) Ag+*Ab → Ag-*Ab + *Ab 2.夹心法 (sandwich method) 一般为固相法 Ab1(固相) +Ag +*Ab2 → Ab1-Ag-*Ab2 + *Ab2
(五) 测量仪器
1. γ射线探测器(γ免疫计数器) 2.液体闪烁计数器(liquid scintillation counter)
第一节放射免疫分析 三、 测定方法
放射免疫分析的测定方法(determination)一般包括 加样、孵育、分离、测量、数据处理五个步骤。
第一节放射免疫分析 四、 主要技术指标
以未结合的Ag* 为 F,Ag*Ab复合物 为B,则B/F或 B/(B+F)与Ag的 量变存在着函数 关系-剂量反应 曲线
注:T即是B与F的总和
(二) 标准曲线 (standard carve)制作方法:
1. 配制一系列已知浓度的标准抗原Ag的反应管,并标明浓度; 2.分别向反应管中加入固定量的*Ag、Ab;
(二) 测定方法 (三) 临床应用 1.受体病的机理研究和治疗预后判断。 举例:对糖尿病患者的研究:胰岛素正常,血糖高 者在受体研究中发现体内缺乏受体结合点而胰岛素 无法发挥作用。 2.为治疗提供依据。如癌组织内有相应受体者, 术后可采取相应激素治疗。
3.特异性 IRMA法所用的固相抗体和标记抗体是分 别针对抗原不同的抗原决定簇的单克隆抗体,不易 发生一般的交叉反应,所以特异性较强。
4.稳定性 在免疫反应中有些抗原抗体间的亲和常数 K值有明显的温度依赖性,降低温度有利于K值的提 高,从而增加灵敏度。但当有过量抗体时,由温度 带来的K值的变化对实验的影响较小。另外,IRMA 法中待测物先与固相抗体结合,洗涤后再加标记抗 体,这样已除去了样品中大部分杂质对反应系统的 干扰,所以稳定性好。
又称为试剂盒质量和方法学评价(质量保证),包 括合格的试剂盒和操作方法。 (一) 精密度(precision) 又叫重复性,是对 已知的同一样品重复测定结果的一致程度。 (二) 准确度(accuray) 指测定值接近“真值”的程 度。用测定样品中外加标准品的回收率来判定。 (三) 灵敏度(sensitivity) 指最小可测出量(可 检出的最小浓度)。 (四) 特异性(specificity) 取决于抗体的特异性, 用交叉反应来判断。交叉反应(cross reaction)越 小,特异性越好。 (五) 可靠性 又称健全性(perfecty),评价被测 物与标准品的免疫活性是否相同的指标。