体外分析技术

5.标准曲线的工作范围 IRMA的工作范围较宽， 在一般情况下，待测物含量低者不必浓缩，高者不 必稀释，同样也就避免了由此带来的误差。 6.缺点 IRMA对蛋白质和多肽抗原检测是优越的， 但需要的抗原至少具备两个抗原决定簇，这就限定 了它对短肽及其它半抗原活性物的测定。

第三节 其他体外放射分析法
第一节放射免疫分析 (二) 标记抗原

1.放射性核素标记的抗原（radionuclide labeled antigen，*Ag） 要求高纯度的抗原，其纯度直接影 响方法的特异性、准确度及灵敏度。因此尽可能的 提纯和纯化。 2.标记抗原的放射性核素 主要用125I和3H标记。临 床多用125I标记多肽类激素及蛋白质。3H则标记小 分子化合物。

五、 质量控制
质量控制(quality control,QC)是对分析工作中的误 差进行经常性的检查,遇有质量异常则及时采取对 策,以保证分析误差控制在可接受的范围。 质量控制包括：实验室内部质控和实验室间质控。 实验室内部质控分为批内质控及批间质控。

第二节免疫放射分析法 （Immunoradiometric assay, IRMA）





免疫动物产生的抗血清不一定都适合放射免疫分析，需选 择亲合力（affinity）大、滴度(titer)高、特异性（specificity） 强者使用。 1.亲和力（affinity） 是免疫反应中抗体和抗原之间相互作 用的一种结合能力和强度。亲和力大则免疫结合速度快、 牢固。亲和力大小以亲和常数Ka值来判断，一般要求在 1010～1012L/M之间。 2.抗体的特异性（specificity） 是指抗体分别与相应抗原和 抗原结构类似物的结合能力的比较。抗体与抗原结构类似 物的结合称为交叉反应（cross reaction），抗体的特异性由 此来判断，交叉反应越小越好。 3.抗血清滴度(antiserum titer) 是以免疫反应中所需抗血清 （antiserum）稀释度的倒数来表示。稀释倍数越高，滴度 也就越高，表示抗体的效价越高。
发展

免疫结合反应由竞争性免疫结合反应

非竞争性免疫结合反应

放射性核素标记配体的免疫分析

非放射性核素标记配体的免疫分析
体外分析技术的特点为

1、灵敏度高 可测水平10-9～10-20 。 一般化学分 析法检出极限为10-3～10-6

2、特异性强 具有良好的特异结合试剂，能识 别化学结构上非常相似的物质，甚至能识别立体异 构体，例：能识别T3、T4、RT3（T4脱去外环上第5 位上的碘---T3，脱去内环上第5位上的碘---RT3）； 能准确测定生物活性物质的亚单位浓度。
3、精密度高 反映出来的是随机误差小（统计及 实验误差）。 4、应用广泛 以放射免疫分析法为例目前至少有 300多种生物活性物质的


第一节放射免疫分析 （一）基本原理
竞争性结合反应的经 典标记抗原（Ag*）和 非标记抗原（Ag）与限 量抗体(Ab)竞争性结合 Ag*和Ag具有等同的 与Ab结合能力

（五） 测量仪器
1. γ射线探测器（γ免疫计数器） 2.液体闪烁计数器(liquid scintillation counter)

第一节放射免疫分析 三、 测定方法

放射免疫分析的测定方法(determination)Baidu Nhomakorabea般包括 加样、孵育、分离、测量、数据处理五个步骤。
第一节放射免疫分析 四、 主要技术指标


第一节放射免疫分析 （一）必备条件
RIA的必备条件包括由国家批准的生产单位提供的 试剂、分离技术、测量仪器。 主要试剂的组成是：特异性抗体(specificantibody)、 标记抗原（radionuclide labeled antigen）、标准品 （standard）（非标记抗原）。

3.对标记抗原的要求




（1）比活度（specific activity）高而适当 比活度是指每微 克抗原上标记的放射性核素的千贝克数（kBg/ug）,其直接 影响方法的灵敏度。 （2）免疫活性（immune activity） 在标记或是蓄存过程 中，可能由于外界条件的变化而造成标记抗原的损伤并使 其活性下降,造成与抗体反应的能力减弱甚至丧失。蛋白质 分子上标记过多的碘原子也会引起免疫活性的改变， （3）放化纯度(radiochemical purity) 是指具有免疫活性的 标记抗原总放射性的百分数，放化纯度应大于95%。若放 射性杂质多，会影响测量的精确度。 （4）便于放射性测量（radionuclide counter） 多采用 发射低能γ光子的125I标记抗原便于进行测量。3H标记抗原则 需用液体闪烁计数器测定。

免疫放射分析法（Immunoradiometric assay, IRMA） 是1968年由Miles 和Hiles应用125I标记牛血清胰岛 素获得成功而建立的，到70年代中期单克隆抗体 (McAb)的制备技术问世以来，免疫放射分析法的分 析技术得到突破性的发展，使体外放射分析的灵敏 度和精确度不断提高，应用迅速推广。

四、 免疫放射分析法的特点

1.反应动力学 在抗原与抗体的反应中,反应速度与 反应物浓度呈正比, IRMA标记的单克隆抗体是过量 的, 且反应是非竞争性的全量免疫结合反应,故比 RIA反应速度快,一般2～3小时即达到平衡。 2.灵敏度 与零剂量的计数误差有关。IRMA的零剂 量的反应值是非特异性结合，如果有接近零水平的 抗原与固相结合，标记抗体就应与其结合形成复合 物，只要标记复合物的放射性测量值超过非特异性 反应，就应被检测出。因此，只要将非特异性反应 控制在最小值，IRMA的灵敏度就会明显比RIA的高。
体外分析技术
昆明医学院第二临床学院 杨青 副教授
第四章 体外分析技术

本课内容

概 论 第一节放射免疫分析 第二节免疫放射分析法 第三节 其他体外放射分析法 第四节 非放射性标记免疫分析技术
概念
体外分析技术（in vitro assay）是指在体外，即在 反应管中对生物活性物质进行超微量分析的技术。 体外放射分析（in vitiro radioassay）是指在体外条 件下，以放射性核素(radionuclide)标记的配体 （ligand）为示踪剂，以竞争或非竞争性免疫结合 反应为基础，以放射性测量为定量手段，对各种微 量生物活性物质进行检测的一类核医学检测方法。



（四） 分离技术
分离技术（separation technique）是用于放射免疫 分析中，当抗原、抗体反应达平衡后，必须将游离 抗原及结合抗原进行分离，然后分别测定其放射性 的方法。 1.双抗体法（double antibody method） 2.沉淀法(precipitation method) 也称PEG法 3.双抗体法＋沉淀法（double antibody method＋ precipitation method） 4.吸附法(adsorptive method) 5.固相法(solid phase method)

(二) 测定方法 (三) 临床应用 1．受体病的机理研究和治疗预后判断。 举例：对糖尿病患者的研究：胰岛素正常，血糖高 者在受体研究中发现体内缺乏受体结合点而胰岛素 无法发挥作用。 2．为治疗提供依据。如癌组织内有相应受体者， 术后可采取相应激素治疗。


3.特异性 IRMA法所用的固相抗体和标记抗体是分 别针对抗原不同的抗原决定簇的单克隆抗体，不易 发生一般的交叉反应，所以特异性较强。

4.稳定性 在免疫反应中有些抗原抗体间的亲和常数 K值有明显的温度依赖性，降低温度有利于K值的提 高，从而增加灵敏度。但当有过量抗体时，由温度 带来的K值的变化对实验的影响较小。另外，IRMA 法中待测物先与固相抗体结合，洗涤后再加标记抗 体，这样已除去了样品中大部分杂质对反应系统的 干扰，所以稳定性好。
一、 放射性受体分析方法 放射性受体分析法（Radioreceptor assay，RRA）是 放射性核素标记的配体(ligand)与相应的受体进行 特异性结合的方法。用细胞受体蛋白作为结合剂， 根据受体可与配体（如激素、介质、药物）进行特 异性结合的特点，测定的是结合的配体复合物的放 射性计数，而达到对受体进行定量的分析 RRA是代表配体与受体之间的生物活性，不是免疫 活性
Ab限量，Ag*定量, Ag*和Ag的量大于 Ab结合位点，二者 通过竞争方式与Ab 结合；随着Ag增加，Ag* 与Ab结合形成Ag*Ab复合 物的放 射量降低,二者变化 成函数关系。
抗原抗体反应
Ag*
反应条件 体积 温度 时间 pH Ab 平衡 非平衡 一步法 二步法
Ag
(标准Ag/样品Ag)

Berson & Yalow

History review
1960年美国的Berson和 Yalow 将核技术与免疫学 技术结合建立了放射免疫 分析法。 首先用于测定血浆胰岛素 浓度，由于该法对医学的 巨大贡献，1977年Yalow 获得了Nobel Prize。

Yalow
Berson
Radioimmunoassay
以未结合的Ag* 为 F，Ag*Ab复合物 为B，则B/F或 B/(B＋F)与Ag的 量变存在着函数 关系－剂量反应 曲线
注：T即是B与F的总和
(二) 标准曲线 (standard carve)制作方法：

1. 配制一系列已知浓度的标准抗原Ag的反应管，并标明浓度； 2.分别向反应管中加入固定量的*Ag、Ab；
（三） 标准品

标准品（standard）即标准抗原(standard antigen)， 用于制作标准曲线，是放射免疫分析（RIA）的定 量基础，其质和量的变化会直接影响样品的测定值。 对标准品的要求是： 1.应选用高纯度的不含杂质的抗原做标准； 2.采用化学结构、免疫活性都与被测抗原一致的抗 原做标准； 3. 标准定量一定要精确。

(一) 特异性抗体(specific antibody)
以被测物质为抗原注入动物体内，一定时间后在动 物血清中即可获得能与该抗原特异性结合的抗体， 即为特异性抗体，而含有该抗体的血清称为抗血清 （anriserum）。 在免疫过程中分子量＞5,000的多肽和蛋白质才能 产生抗体， 分子量＜5,000的肽类物质，需要与载 体蛋白结合才能产生抗体。
又称为试剂盒质量和方法学评价（质量保证），包 括合格的试剂盒和操作方法。 （一） 精密度（precision） 又叫重复性，是对 已知的同一样品重复测定结果的一致程度。 (二) 准确度(accuray) 指测定值接近“真值”的程 度。用测定样品中外加标准品的回收率来判定。 （三） 灵敏度(sensitivity) 指最小可测出量（可 检出的最小浓度）。 （四） 特异性(specificity) 取决于抗体的特异性， 用交叉反应来判断。交叉反应（cross reaction）越 小，特异性越好。 （五） 可靠性 又称健全性(perfecty)，评价被测 物与标准品的免疫活性是否相同的指标。
一、 原理
二、 试剂
IRMA与RIA的主要区别表
异点 别 类
IRMA 核素标记抗体 过量的 非竞争性结合反应 Ag与Ag-*Ab呈正相关
RIA 核素标记抗原 限量的 竞争性结合反应 Ag与*Ag-Ab呈负相关
标记配体 特异性抗 体 结合反应 测定结果
三、

测定方法）
1.直接法（direct method） Ag+*Ab → Ag-*Ab + *Ab 2.夹心法 (sandwich method) 一般为固相法 Ab1(固相) +Ag +*Ab2 → Ab1-Ag-*Ab2 + *Ab2


3.经过一定时间的温育竞争结合反应；
4.待竞争结合反应平衡后，分离结合B（Bond）部分和游离F(Free)部分；


5.用放射性探测器测得*Ag-Ab放射性为B或游离*Ag的放射性为F；
6.计算出结合率B%[B/（B+F）×100]，或B/B0%；B0为不含Ag的结合率，因Ag为“0”， 故B0 *Ag-Ab的结合率为最大结合率； 7.以B%或B/B0为纵坐标，标准抗原浓度为横坐标，绘制出B%或B/B0随Ag量变化的曲线即 为标准曲线（图4-2）。