大肠埃希菌检查法
药品的微生物限度检查
24～48h
紫红胆盐葡 萄糖平板
10-1
无菌落
18～24h
有菌落
报告未检出
10g/10ml/ 100cm2供试品
3.耐胆盐革兰阴性菌定量检查操作示意图
以TSB为稀释液制供试液
一定量 肠道增菌肉汤
20～25℃, 2h预增菌
1ml
24～48h
紫红胆盐 葡萄糖平板
报告结果
10-1
18～24h
（六）梭菌的检查
梭菌 增菌 培养 基
供试液的制备
书写检 验记录
哥伦比亚琼脂培养基分离
1.梭菌检查程序
无菌落生长
过氧化氢 酶试验
配培养基和稀释液
最终结果判断
有 菌 落
确证 试验
10g/10ml/ 100cm2供试品
2.供试品梭菌检查操作示意图
各10ml
分别接种
一份80℃保温10min后迅速冷却
10-2
10-31ml10-110-210-3
各管加1ml
查可能菌数表
9ml 稀 释 液
有/无菌落
（二）大肠埃希菌检查
大肠埃希菌作为检验供试品是否受粪便污染的指示菌。
2015年版《中国药典》规定经口及呼吸道服给药的制剂，每1g、1ml或10cm2不得检出大肠埃希菌。
TSB 增菌 培养
30℃～35℃
3～5d
1.平皿法
（1）基本程序：
数据 处理
结果观察与计数
书写检 验记录
平板 接种
需氧菌 的培养
供试液 的制备
配培养基和稀释液
倒置 培养 3～5d
30～35℃
TSA
不少于 0.1ml
大肠埃希菌
一、分类 二、细菌特性 三、临床意义 四、微生物学检验
返回
细菌特性
• 形态特征
• 培养特性
• 生化反应
• 抗原结构
大肠埃希菌革兰染色
大肠埃希菌电镜图
大肠埃希菌菌落特征（血平板）
大肠埃希菌菌落特征（MAC）
大肠埃希菌KIA（AA＋－）MIU（＋＋－）
大肠埃希菌IMViC试验（＋＋－－）
微生物学检验
（一）检验程序 （二）标本采集 （三）检验方法 （四）耐药性 （五）结果分析与报告
பைடு நூலகம்
大肠埃希菌检验程序
检验方法
1.显微镜检查 2.分离培养 3.鉴定 – ETEC – EPEC – EIEC – EHEC – EaggEC
ST检测（乳鼠灌胃试验）
LT 检测（ CHO细胞培养）
O157:H7菌落特征（MAC）
O157:H7菌落特征（山梨醇麦康凯琼脂平板）
返回
右侧为对照（－－＋＋）
大肠埃希菌抗原结构
临床意义
致病物质
所致疾病
致病物质
• 侵袭力 • 内毒素 • 肠毒素 耐热肠毒素（ST） 不耐热肠毒素（LT） 菌毛、K抗原
所致疾病
• 肠道外感染 泌尿道感染（最常见）
胆道感染、腹膜炎、肺炎 菌血症、新生儿脑膜炎 • 肠道感染 ETEC、EPEC、EIEC、 EHEC、EaggEC
微生物限度、控制菌检查记录
产品名称
批号
数量
供货单位
取样量
检验日期
温度
湿度
报告日期
检验依据
供试液制备
取供试品（g），加pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至ml，混匀，作为1:10的供试液；细菌检查：吸取本品1ml至5个平皿，每个平皿0.2ml；霉菌和酵母菌检查：吸取本品1ml至平皿
平皿号
细菌
培养基/批号
营养琼脂培养基/
供试品
阳性对照
阴性对照
结果
□检出□未检出（规定：）
备注
结论
本品按进行检验，结果。
检验人
复核人
2天
3天
3天
4天
4天
5天
5天
5
1天
1天
2天
2天
3天
3天
4天
4天
5天
5天
每组菌落总数
平均数
平均数
结果
（规定：）
结果
（规定：）
备注
结论
本品经按进行检验，结果。
检验人
复核人
控制菌检查记录
检验编号：
产品名称
批号
数量
供货单位
取样量
检验日期
温度
湿度
报告日期
检验依据
一、大肠埃希菌检查
供试品制备：取供试品（g/ml/cm2），加PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至ml，混匀，作为的供试液。
培养基信息：①营养肉汤培养基配制批号：②四硫磺酸钠亮绿培养基配制批号：
③胆盐硫乳琼脂培养基配制批号：④EMB配制批号：
培养温度：培养时间：培养箱编号：
营养肉汤预增菌（18～24h）
四硫磺酸钠亮绿增菌（18～24h）
药品控制菌检查法中大肠埃希菌贮藏方法的研究
药品控制菌检查法中大肠埃希菌贮藏方法的研究
本研究旨在探究药品控制菌检查法中，大肠埃希菌的贮藏方法对于其生长、存活及对
药品的感受性等方面的影响。
为了达到这个目的，本文将进行扩散法和过滤法两种大肠埃
希菌的贮藏方案实验。
扩散法实验中，我们随机选取了10个含有大肠埃希菌的琼脂平板培养基，分别将其贮藏于4种不同的条件下：常温下24小时（即室温），4摄氏度低温保存，-20摄氏度冷冻
保存，以及液氮冷冻保存。
在贮藏60天后，我们将这些琼脂平板培养基用于检测大肠埃希菌的生长情况。
结果表明，在4种不同的贮藏条件下，大肠埃希菌的增殖情况均较为正常，但液氮冷冻较其他3种贮藏条件下更有利于大肠埃希菌的生长。
过滤法实验中，我们同样随机选取了10个含有大肠埃希菌的培养基滤膜，分别将其贮藏于与扩散法实验相同的4个不同条件下。
在贮藏60天后，我们采取相同的方法检测滤膜上的大肠埃希菌数量及其感受药品的情况。
结果显示，液氮冷冻保存对于大肠埃希菌的存
活率及对药品的感受性均更有利。
综上，本研究发现液氮冷冻保存对于药品控制菌检查法中大肠埃希菌的贮藏最为适合。
本研究的结果可以为药品的质量控制提供一定的参考。
20版药典大肠埃希菌检查操作规程
20版药典大肠埃希菌检查操作规程以下是一份20版药典大肠埃希菌检查操作规程的示例：1. 实验室准备a. 确保实验室设备、试剂和培养基的准备充足。
b. 检查培养基的质量和有效期限。
c. 清洗和消毒实验台面和工具。
2. 样品准备a. 收集待检样品，如食品、水源等。
b. 如果样品体积较大，将样品切割成适当大小的块。
c. 样品处理前，使用无菌容器收集样品。
3. 样品处理a. 杀菌样品以杀灭大肠埃希菌以外的其他微生物。
可以使用高温杀菌、化学杀菌等方法。
b. 对于液体样品，使用无菌技术将样品转移到含有适当培养基的试管中。
c. 对于固体样品，将一定重量的样品转移到含有适当培养基的培养皿中。
4. 培养与孵育a. 在适当温度下，将培养皿或试管放入培养箱孵育。
大肠埃希菌通常在37℃下生长。
b. 确保培养基含有抑菌物质（如抗生素），以防止其他非大肠埃希菌的生长。
5. 结果解读a. 在孵育一定时间后，观察培养基上是否有典型的大肠埃希菌菌落。
b. 大肠埃希菌菌落通常呈现金黄色、粘液状，有时也可能呈现其他形态。
c. 使用适当的显微镜技术，观察和鉴定菌落形态，并进行进一步的确认。
6. 结果记录和报告a. 记录培养结果和菌落形态的详细描述。
b. 如需要，进一步进行相关确认试验。
c. 根据操作结果，撰写实验报告，并将结果报告给相关人员或部门。
注意事项：- 确保操作过程中的无菌技术和消毒措施。
- 操作过程中遵循安全操作规范，注意个人防护。
- 严格遵守实验室操作流程，减少污染和误差的可能性。
- 如发现培养出大肠埃希菌，及时采取相应的措施，以避免传播和扩散。
药品控制菌检查法中大肠埃希菌贮藏方法的研究
药品控制菌检查法中大肠埃希菌贮藏方法的研究
药品控制菌检查法中，常常需要对大肠杆菌进行检测和贮藏。
本研究旨在探究不同大
肠杆菌贮藏方法对其生存能力的影响，并为药品控制菌检查提供实用的参考方法。
方法:
1.选择5个大肠杆菌标准品种进行实验，分别为ATCC25922, ATCC8739, ATCC13706, ATCC23256和ATCC8099。
2.分别将这5种大肠杆菌接种于肉汤培养基中，经过孵育后，采用过滤膜法将细菌分
别按不同浓度制成冻干菌粉：10^6CFU/g, 10^7CFU/g, 10^8CFU/g。
3.将制成的冻干菌粉分别保存在常温、冰箱和低温冰箱内，并在保存0、30、60、90、120、150和180天时分别取出1份进行活菌数的检测和分析。
结果:
1.不同浓度的大肠杆菌冻干菌粉在不同贮藏条件下的存活率有所不同，其中随着存储
时间的延长，存活率显著下降。
2.长时间耐受除冰后，低温冰箱存储的大肠杆菌贮藏状态较好，存活率较高。
3.ATCC23256和ATCC8099两种大肠杆菌在低温冰箱中的存活率较高。
结论:
1.大肠杆菌在冻干状态下对贮藏温度较为敏感。
2.长时间耐受除冰后，低温冰箱是一种可靠的大肠杆菌存储方法。
3.对不同种类的大肠杆菌，选择适合它们生存的温度和储存方式是保证其贮藏状态和
活力的关键。
总之，本研究提供了一种科学、实用的大肠杆菌贮藏方法，并为药品控制菌检查提供
了参考建议。
药品微生物限度检查方法验证步骤及示教
药品微生物限度检查方法验证一般步骤1.样品及确定验证项目样品要求：不含菌或少量菌验证项目：根据药品用药途径、处方、制法确定。
细菌、霉菌及酵母菌计数验证（一般必作）；控制菌检查如为中药制剂必须查标准，根据用药途径、处方、制法确定控制菌检查项目。
特殊的如滴眼剂、用于烧伤、严重创伤等应根据制剂通则项下要求及微生物限度标准来确定。
2. 确定供试液制备方法3. 方法选择预试验（1）目的：确定样品对试验菌有无抑菌活性及计数验证各试验菌的回收试验方法。
（2）查资料，根据样品的功能、主治及所含成分等确定方法选择预试验方案。
（3）根据预试验结果确定各试验菌计数验证方法控制菌验证方法4. 验证试验：选择3个批号样品进行3次独立实验，证明方法的有效性；5. 据验证结果优化试验条件，建立微生物限度检查方法SOP。
6. 写出验证资料。
示教内容11.5.上午：菌液制备方法：一. 新鲜浓菌液制备（要求学员练习操作的内容）新鲜浓菌液接种：细菌大肠埃希菌[CMCC（B）44102]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]生孢梭菌[CMCC（B）64941]（厌氧梭菌）铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]培养基：营养肉汤3-5ml、硫乙醇酸盐流体培养基3-5ml接种及培养：1.分别取各试验菌半个--1个菌落分别接种营养肉汤（充分研匀、摇匀），36±1℃培养16-18小时。
2.生孢梭菌新鲜培养物取0.1ml接种硫乙醇酸盐流体培养基（临用前排氧）36±1℃培养18-24小时。
霉菌及酵母菌白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]培养基：改良马丁培养基3-5ml；改良马丁琼脂培养基斜面1.取白色念珠菌的菌落接种改良马丁培养基23-28℃培养24小时（可用36±1℃培养18-24）。
2.黑曲霉孢子悬液的制备：沾取黑曲霉孢子接种改良马丁琼脂培养（红字为示教内容基，培养5-7天待培养物黑色孢子生长（全部变黑，已制备好斜面培养物示教）加入5-10ml0.9%氯化钠溶液，小心振挡洗脱表面的黑色孢子1-2次，吸出洗脱液（注意不要触到菌丝体）即为孢子悬液。
药品控制菌检查法中大肠埃希菌贮藏方法的研究
药品控制菌检查法中大肠埃希菌贮藏方法的研究
大肠埃希菌是一类常见的致病菌，在药品的生产过程中起着重要作用。
为了确保药品的安全性和有效性，需要进行大肠埃希菌的质量控制检查。
而在大肠埃希菌的检查中，贮藏方法对其生长和存活状态有着重要影响。
本文旨在探讨药品控制菌检查法中大肠埃希菌的贮藏方法对其检测结果的影响。
为了研究大肠埃希菌贮藏方法的影响，我们选取了不同种类的贮藏方法进行了实验。
实验分为三组，分别是冷冻贮藏、室温贮藏和干燥贮藏。
每组实验设置了不同的时间段进行观察，并对大肠埃希菌的存活情况进行了统计分析。
结果显示，不同贮藏方法对大肠埃希菌的存活和生长状态有明显影响。
在冷冻贮藏条件下，大肠埃希菌的存活率较高，并且菌落生长也较为充足。
这可能是由于低温冻结能够有效地抑制细菌的代谢和生长活性，从而保持其相对稳定的状态。
而在室温贮藏条件下，大肠埃希菌的存活率明显下降，并且菌落生长不如冷冻贮藏情况下充足。
这可能是由于室温环境中，细菌容易受到环境中的氧气、水分和营养物的影响而导致细菌的死亡或生长受限。
而在干燥贮藏条件下，大肠埃希菌的存活率更低，并且菌落生长更为有限。
这可能是由于干燥环境中，细菌容易受到干扰和破坏，从而导致其死亡和生长受限。
通过对不同贮藏方法下大肠埃希菌存活和生长情况的观察和统计分析，可以得出以下结论：冷冻贮藏是维持大肠埃希菌稳定存活和生长的最佳方法；室温贮藏虽然能够保持菌体的存活，但是会明显影响细菌的生长活性；干燥贮藏条件下，细菌的存活率和生长状况都较差。
《微生物与实验技术》食品中大肠埃希菌的检验实验
《微生物与实验技术》食品中大肠埃希菌的检验实验一、实验目的1.熟悉大肠埃希菌的检验原理2.熟悉大肠埃希菌检验的基本操作二、实验原理1.大肠杆菌，又叫大肠埃希氏菌是条件致病菌，在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染。
因此，检查食品中是否存在治病大肠埃希氏菌具有实际意义。
2. 在TSI琼脂中,典型菌株为斜面与底层均呈黄色，产气或不产气，不产生硫化氢(H2S)。
置MUG-LST肉汤管于长波紫外灯下观察,MUG阳性的大肠埃希氏菌株应有荧光产生,MUG阴性的应无荧光产生，大肠埃希氏菌O157:H7/NM为MUG试验阴性,无荧光。
三、试剂及器材1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤：2 EC肉汤（E.coli broth）：3 蛋白胨水：4磷酸盐缓冲液：5伊红美蓝（EMB）琼脂：6 营养琼脂斜面：7结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）：8革兰氏染色液：9无菌1mol/LNaOH：10无菌1mol/LHCl：四、操作方法样品的稀释1. 固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min，制成1:10的样品匀液或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min制成1:10的样品匀液。
2.液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1.10的样品匀液。
3. 样品匀液的pH值应在6.5~7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl 调节。
4 .用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL 磷酸盐缓冲液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面）振摇试管或换用1支1mL无菌吸管或吸头反复吹打，使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。
大肠菌群的检验方法
大肠菌群的检验方法
大肠菌群是指人体肠道内的一类细菌群落，对人体健康有着重要的影响。
检验大肠菌群的方法主要包括以下几种：
1. 粪便培养法，通过采集患者的粪便样本，将其培养在含有特定营养物质的培养基上，利用培养基的选择性和差异培养特性，可以筛选出大肠菌群中的细菌，并对其进行鉴定和计数。
2. 分子生物学方法，包括PCR（聚合酶链式反应）、16S rRNA 基因测序等技术，通过检测特定基因序列或者DNA指纹图谱来确定大肠菌群的成分和数量。
3. 生化检测法，通过测定粪便中的各种生化指标，如pH值、氨氮含量等，来间接反映大肠菌群的代谢活动和数量。
4. 荧光原位杂交技术（FISH），利用荧光探针对大肠菌群中的特定细菌进行染色和检测，可以直观地观察其在肠道内的分布和数量。
5. 免疫学检测法，通过检测粪便中的特定抗原或抗体水平，来
间接反映大肠菌群的情况，如检测肠道病原菌的抗原或特定免疫球蛋白的水平。
总的来说，不同的检测方法各有优势，可以综合应用以获得更全面和准确的大肠菌群信息。
这些方法可以帮助医生评估肠道菌群的健康状况，指导治疗和调整饮食，对于维护肠道健康和预防疾病具有重要意义。
埃希菌属及其鉴定
埃希菌属及其鉴定本属以大肠埃希菌为代表种。
1．细菌特性大肠埃希菌为革兰阴性杆菌，直杆状，周鞭毛，能运动，有菌毛。
具有O抗原、H抗原、K抗原，其血清型别按O∶K∶H的顺序排列，以数字表示，如O111∶K58∶H2；O157∶H7等。
兼性厌氧，营养要求不高，菌落为灰白色、圆形，在肠道选择培养基上能发酵乳糖产酸形成不同颜色的菌落。
生化特征为：发酵多种糖类产酸产气，KIA：AA+-，脲酶-；IMViC++--。
2．临床意义大肠埃希菌是临床最常见的革兰阴性杆菌，也是医院感染常见病原菌，可引起各种肠道外感染和肠道内感染。
引起肠道内感染的亦称为致腹泻大肠埃希菌，分为五组：（1）肠产毒性大肠埃希菌（ETEC） ETEC致病机制主要通过产生LT和ST肠毒素导致腹泻和中毒症状，是旅游者腹泻和婴幼儿腹泻的常见病因，导致恶心、腹痛、低热和类似轻型霍乱的急性水样腹泻。
（2）肠致病性大肠埃希菌（EPEC）是婴儿腹泻的重要病原菌，可导致发热、呕吐、严重水泻和粘液便，常引起婴儿脱水性酸中毒。
（3）肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）与志贺菌有共同抗原，可引起类似志贺菌肠炎的症状，如发热、腹痛、水泻或典型菌痢的里急后重症状，并出现脓血粘液便。
（4）肠出血性大肠埃希菌（EHEC）主要血清型为O157∶H7，引起出血性结肠炎（HC）。
表现为腹痛、水泻、血性便。
主要见于婴幼儿。
以暴发流行为主。
O157∶H7感染者中有少部分可发展成为溶血性尿毒综合征（HUS），出现溶血性贫血、血小板减少性紫癜和急性肾功能不全。
（5）肠凝聚性大肠埃希菌（EaggEC）引起婴儿急性或慢性水样腹泻伴脱水，偶有腹痛、发热与血便。
3．微生物学检验（1）标本采集无菌方法采集各类感染标本及时送检；粪便标本宜采集新鲜、有脓血、粘液的部分。
（2）检验方法1）显微镜检查为革兰阴性杆菌。
2）分离培养标本接种于BAP、SS、MAC/EMB培养基、或增菌培养基，置35℃孵育18～24h，观察菌落。
大肠埃希菌的微生物检验分析 王春玲
大肠埃希菌的微生物检验分析王春玲摘要】目的：探讨大肠埃希菌的微生物检验方法及临床意义。
方法：对100例各类送检标本中大肠埃希菌的肠道外感染大肠埃希菌鉴定和肠道内感染大肠埃希菌鉴定方法进行分析。
结果：大肠埃希菌中检出率48%。
大肠埃希菌常引起各种肠内外感染，是腹泻和泌尿道感染的主要病原菌。
结论：肠道外感染的鉴定是临床分离的革兰阴性杆菌中最常见的之一。
可引起各种感染，常见的是泌尿系感染。
还可引起胆囊炎、菌血症、肺炎及新生儿脑炎等，亦可引起腹腔内脓肿、肠穿孔继发腹膜炎，术后感染或大面积创面感染等，又易混合厌氧菌感染等症。
肠道外感染大肠埃希菌的鉴定。
肠道内感染的大肠埃希菌的鉴定这些菌株可引起轻微腹泻或霍乱样腹泻。
严重时，可引起致死性并发症(HUS)，造成严重后果。
【关键词】大肠埃希菌；微生物检验【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）14-0376-02大肠埃希菌是重要的条件致病菌，俗称大肠杆菌，常引起各种肠内外感染，是腹泻和泌尿道感染的主要病原菌。
现对大肠埃希菌的微生物检验及临床意义进行分析如下。
1.资料与方法1.1 一般资料对2014年1月～12月收治的各类送检标本100例，为住院或门诊患者，年龄8～83岁，其中尿液45例，痰液16例，脓液13例，血液11例，分泌物5例，胆汗4例，引流液2例，其他2例。
1.2 方法1.2.1肠道外感染大肠埃希菌鉴定1.2.1.1标本采集根据不同疾病采集不同部位的标本。
采集血液标本以无菌操作技术抽取静脉血5mL；痰标本取自口腔清洁后从深部咳出的痰液；脓、分泌物等标本用无菌棉拭子直接采取。
1.2.1.2检验方法(1)标本直接检查：除血液标本外，其他标本均可作涂片染色镜检。
中段尿和其他各种体液标本以3000r／min离心10 min后取沉淀物涂片，脓、痰、分泌物等可直接涂片，革兰染色后镜检。
镜下可见革兰阴性短杆菌。
(2)分离培养与鉴定：①分离培养：血液标本接种肉汤增菌培养，待生长后移种于血平板；其他标本直接或离心取沉淀接种于血平板及肠道弱选择性平板，35℃孵育18～24h。
大肠埃希菌检查法
大肠埃希菌检查法Escherichia Coli Test Method1.目的建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。
2.围适用于大肠埃希菌检查的操作。
3.责任者QC化验员。
4.程序：. 大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属的模式种。
埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等5个种。
大肠埃希菌是人和温血动物肠道的栖居菌，随粪便排出体外。
在药品中检出大肠埃希菌，说明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。
大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。
为保证人体安康，口服药品必须检查大肠埃希菌。
. 用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，MUG)和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中别离单个菌，如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。
. 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反响作为指示系统来鉴定目标菌。
实验证明，96％的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUD)，约10％的沙门菌属一些菌种也含有此酶。
MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反响的敏感度较颜色反响强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。
单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6％，鉴于98％的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUG与靛基质试验结合，比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。
如MUG与Indole 试验的反响不一致时，那么需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板别离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。
该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98％。
如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含混的。
大肠埃希氏菌
甲基红试验
原理:某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖 产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解，产生甲酸、 乙酸、乳酸等，使培养基的pH降至4.5以下， 当加入甲基红试剂则呈红色，为甲基红试验阳 性。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸 进一步转化为其他物质（如醇、酮、醚、气体 和水等），则培养基的酸度仍在pH6.2以上， 故加入甲基红指示剂呈黄色，是为阴性。
柠檬酸实验
柠檬酸盐培养基系一综合性培养基，其中柠檬酸钠为 碳的唯一来源。而磷酸二氢铵是氮的唯一来源。有的 细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在 柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸 盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚 蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳 源的细菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。 ①将试验菌培养在柠檬酸盐培养基斜面上37℃培养 24-28小时. ②观察有无细菌生长与培养基颜色变化.如果含有溴 麝香草酚蓝的斜面蓝色者为阳性反应,呈绿色的为阴 性反应;含苯酚红的斜面如果呈红色为阳性反应,呈黄 色为阴性反应.
标准
《中国药典》（2010年版）二部 口服给药制剂 细菌总数每1ml不得过100cfu 霉菌和酵母菌总数每1ml不得过100cfu 大肠埃希菌总数不得检出
备料单（增菌培养）
序号 1 2 3 品名 锥形瓶 刻度吸管 刻度吸管 规格 250ml 10ml 1ml 数量 4 2 1 备注
10ml
样 BLห้องสมุดไป่ตู้养基
备料单（快速生化试验）
序号 1 2 3 品名 刻度吸管 试管 MUG培养 基 规格 1ml 中 5ml 数量 3 4 4 分装到试 管中 备注
4
靛基质
药品控制菌检查法中大肠埃希菌贮藏方法的研究
药品控制菌检查法中大肠埃希菌贮藏方法的研究药品控制菌检查法中大肠埃希菌的贮藏方法是药品质量控制的重要环节之一。
本文研究了不同贮藏方法对大肠埃希菌的存活率和生长状态的影响，为药品中大肠埃希菌的检测提供理论依据。
1.实验材料和方法1.1 材料：野生型大肠埃希菌(Escherichia coli) ATCC 25922,平板培养基(E. coli agar plate)。
1.2 仪器：干燥箱、冰箱、搅拌器、恒温培养箱。
1.3 方法（1）大肠埃希菌的培养取一个E. coli agar plate，用无菌棒在上面均匀涂敷E. coli菌落，放在37℃恒温培养箱中培养16h，使菌落生长到合适的大小。
（2）分装和贮藏将上述培养好的大肠埃希菌分装到3种不同贮藏方式中：A组：将菌液用无菌移液管吸取30μl，滴在枯燥的平板培养基上，待其彻底干燥后将平板用无菌铝箔包装。
B组：将培养好的大肠埃希菌用无菌移液管吸取30μl，加入等体积的甘油，混匀后用无菌冻管保存，放入干燥箱中保存。
C组：将培养好的大肠埃希菌用无菌移液管吸取30μl，加入等体积的冰醋酸缓冲液(0.1mol/L,pH=7.4)，混匀后用无菌冻管保存，放入冰箱中保存。
2.实验结果将不同贮藏方式的大肠埃希菌取出，经过相应的处理后在培养基上进行菌落计数，观察菌落的生长状态。
结果表明：经过不同贮藏处理的大肠埃希菌生长状态和存活率存在显著差异，三种贮藏方式的大肠埃希菌细胞数量分别为A组1548±69 CFU、B组3322±120 CFU、C组3017±106 CFU，其中B组显著高于A组和C组(P<0.05)，而A组、C组之间未见显著差异(P>0.05)。
从菌落的大小和形态上看，A组和C组的菌落较小，疏松，颜色较浅；而B组的菌落较大、紧密，颜色较深，状况较好。
3.讨论根据实验结果可以得出结论，三种贮藏方式的大肠埃希菌生长状态和细胞存活率存在差异，其中将细菌用甘油保存的B组的存活率最高，菌落的大小和形态也最好。
控制菌(大肠埃希菌)检查操作规程
控制菌（大肠埃希菌）检查操作规程1.目的建立一个控制菌大肠埃希菌控制菌大肠埃希菌检查标准工作程序，规范QC控制菌大肠埃希菌检查人员的控制菌大肠埃希菌检查的操作。
2.范围适用于本公司的口服制剂完成内包后外包前的中间体和局部给药制剂产品的内包装材料的控制菌大肠埃希菌的检测。
3.责任者QC控制菌大肠埃希菌检查人员；质量管理部4.内容4.1检测准备4.1.1 QC人员接到控制菌大肠埃希菌检查的《工作进程计划单》后，核对《取样指令》，确定控制菌大肠埃希菌检查所需容器具、试液、培养基等项目和数量，执行微生物检查准备工作操作程序和培养基配制操作规程，进行控制菌大肠埃希菌检查前的准备工作。
4.1.2 为了保证被检品在取样后规定的时间内完成检验，取样前应准备好检验需要的各种器皿（清洗→干燥→包裹）、培养基和稀释剂等（配制→分装→包裹），并灭菌备用。
4.2 供试液的制备4.2.1 供试液供试液是指按照供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法将供试品制成供试验用的均匀液体。
4.2.2 供试液的制备根据供试品的理化特性与生物需特性，采取适宜的方法制备供试液。
如果使用了乳化剂、分散剂、中和剂和灭活剂，其用量应证明是有效的，并对微生物的生长和存活无影响性。
4.2.2.1 可溶性液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。
可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。
4.2.2.2 非水溶性液体供试品油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀，然后再加0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100m，混匀，作为供试液。
4.2.2.3 水溶性固体、半固体或黏稠性供试品称取供试品10g，置PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml中，用匀浆仪或其他适宜方法，混匀，作为1：10供试液。
必要时可加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。
4.2.2.4 非水溶性供试品取供试品5g(5m1)，加入含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使其充分乳化，作为1:20供试液。
药品控制菌检查法中大肠埃希菌贮藏方法的研究
2019年11期应用科技科技创新与应用Technology Innovation and Application表1菌种计数结果天数 cfu/ml 天数 cfu/ml 天数 cfu/ml 天数 cfu/ml 天数 cfu/ml 1d 6.2 1092d 7.2 1093d 5.3 1094d 4.8 1095d3.5 1096d7.9 1097d3.2 1098d2.5 1099d2.3 109 10d 6.7 10911d 5.8 109 12d 3.4 109 13d 2.9 109 14d 2.7 109 15d 5.3 10916d 6.8 109 17d 7.7 109 18d 1.5 109 19d 4.4 109 20d 7.1 10921d 3.1 10922d 5.7 10923d 4.7 10924d 8.1 109 25d 6.9 10926d 8.7 10927d 4.8 10928d 7.2 10929d 1.8 10930d 2.3 10931d 1.9 109药品控制菌检查法中大肠埃希菌贮藏方法的研究胡林，刘旭海，张细和，陈小荣（江中药业股份有限公司，江西南昌330096）依据《中华人民共和国药典》2015版，非无菌产品微生物限度检查中的控制菌检查法，需进行阳性对照试验，每次试验均需要加入不大于100cfu 的对照菌[1]。
依据药典指导原则，菌种可采用低温冷冻干燥、液氮贮存、超低温冷冻（低于-30℃）等保存方法。
使用以上方法保存菌种，则需在每次实验前都要进行菌种活化和计数实验，进而配制不大于100cfu 的加菌量。
本公司药品均进行微生物限度检查，其中含有大肠埃希菌项目。
为提高检验效率，寻找适宜的菌种贮藏方法，同时结合本实验室实际情况，将大肠埃希菌经复苏后接种至胰酪大豆胨液体培养基中，24h 菌种活化后，4°C 冰柜里贮藏。
随后每日进行菌种数量及性状验证，为进行大肠埃希菌的贮藏提供有益的科学探讨。
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大肠埃希菌检查法Escherichia Coli Test Method1.目的建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。
2.范围适用于大肠埃希菌检查的操作。
3.责任者QC化验员。
4.程序：4.1.简述4.1.1. 大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属的模式种。
埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等5个种。
大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。
在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。
大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。
为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。
4.1.2. 用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，MUG)和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。
4.1.3. 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。
实验证明，96％的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUD)，约10％的沙门菌属一些菌种也含有此酶。
MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。
单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6％，鉴于98％的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUG与靛基质试验结合，比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。
如MUG与Indole 试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。
该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98％。
如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌，其结果是含混的。
4.2.仪器、设备及用具4.2.1. 无菌室4.2.2. 净化工作台4.2.3. 培养箱(36±1℃)4.2.4. 高压蒸汽灭菌器4.2.5. 显微镜(1500X)4.2.6. 微波炉4.2.7. 恒温水浴（45±1℃）4.2.8. 离心机(500～4000r/min)4.2.9. 0.45μm±0.02μm薄膜及过滤器4.2.10. 电冰箱4.2.11. 匀浆仪4.2.12. 366nm紫外灯4.2.13. 玻璃器皿、器具4.3.试液、指示液4.3.1. 0.9％无菌氯化钠溶液取氯化钠9.0g，加水使溶解成1000ml，121℃灭菌20分钟。
4.3.2. 靛基质试液取氯化二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戊醇(或丁醇)75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免聚热导致溶液色泽变深，或取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95％乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入。
4.3.3. 甲基红指示液取甲基红0.1g，加95％乙醇300ml，使溶解后加水至500ml，即得。
4.3.4. V-P试液α-萘酚乙醇试液：取α－萘酚6.0g，加无水乙醇溶解使成100ml。
氢氧化钾试液：取氢氧化钾40.0g、加水使溶解成100ml。
4.3.5. 革兰染色液4.3.5.1. 结晶紫染液取结晶紫1.0g、95％乙醇20ml、1％草酸铵[(NH4)2C2O4]溶液80ml。
将结晶紫溶于乙醇后，与草酸铵混合，静置48h，置密闭棕色瓶，可存放数月。
4.3.5.2. 革兰碘液碘1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300ml。
用少量水溶碘化钾，再加碘，待全溶后，加蒸馏水至30ml，置棕色瓶备用。
4.3.5.3. 脱色液 95％乙醇4.3.5.4. 沙黄(番红)染液沙黄(SafranineO)0.25g、95％乙醇10ml、蒸馏水适量，将沙黄加入乙醇中，完全溶解后再加水至100ml。
4.3.6. 亚甲蓝指示液取亚甲蓝0.5g，加水溶解使成100ml。
4.3.7. 溴麝香草酚蓝指示液取溴麝香草酚蓝0.4g，加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解，再加水稀释至100ml。
变色范围pH6.0～7.6(黄→红)4.3.8. 酸性品红指示液取酸性品红0.5g，加水100ml溶解，再逐渐加1mol/L 氢氧化钠溶液16ml，每加1滴需将溶液充分摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色；于沸水中保持15分钟，静置2小时，滤过，即得。
变色范围pH6.0～7.4(黄→红)。
4.3.9. 曙红钠指示液取曙红钠2.0g，加水溶解使成100ml。
4.3.10. 无菌聚山梨酯80-氯化钠溶液取聚山梨酯80 1ml加0.9％氯化钠溶液使成100ml，121℃灭菌20分钟。
4.3.11. 无菌磷酸盐缓冲液(pH7.2) 取磷酸氢二钠25.8g与磷酸二氢钠4.4g，加水稀释至1000ml，121℃灭菌20分钟。
4.3.12. 无菌对氨基苯甲酸试液取对氨基苯甲酸0.1g，加入含10ml水的具塞试管中，121℃灭菌20分钟。
4.3.13. 中性红指示液取中性红1.0g，研细，加95%乙醇60ml使溶解，再加水至100ml。
变色范围Ph6.8～8.0（红→黄）。
4.3.14. 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH7.0) 取磷酸二氢钾3.56g，磷酸氢二钠7.23g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000ml，加热使溶解，过滤。
分装，灭菌。
4.4.培养基4.4.1. 营养肉汤培养基胨 10g 氯化钠5.0g牛肉浸出粉 3.0g 水1000ml取上述成份混合，微温溶解，调解pH为弱碱性，煮沸，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。
4.4.2. 营养琼脂培养基胨 10g 氯化钠5.0g牛肉浸出粉 3.0g 水1000ml琼脂 14.0g取上述成份混合，微温溶解，调解pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。
4.4.3. 胆盐乳糖培养基（BL）胨20.0g 磷酸二氢钾1.3g乳糖 5.0g 牛胆盐 2.0g氯化钠 5.0g （或去氧胆酸钠）(0.5g)磷酸氢二钾4.0g 水1000ml除乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH 值使灭菌后为7.4±0.2，煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠，分装，灭菌。
4.4.4. 4-甲基伞形酮葡萄糖化酶苷酸（4-methylumbellifery1-β-D-glu-curonide,MUG）培养基胨 10.0g 磷酸二氢钾（无水）0.9g硫酸锰 0.5mg 磷酸氢二钠（无水） 6.2g硫酸锌 0.5mg 亚硫酸钠40mg硫酸镁 0.1g 去氧胆酸钠1.0g氯化钠 5.0g MUG 75mg氯化钙 50mg 水1000ml除MUG外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入MUG，溶解，每管分装5ml，灭菌。
4.4.5. 曙红亚甲基蓝琼脂培养基（EMB）营养琼脂培养基100ml 曙红钠指示液2ml20%乳糖溶液5ml 亚甲蓝指示液 1.3-1.6ml取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷至60℃，按无菌操作加入灭菌的其他3种溶液，摇匀，倾注平皿。
4.4.6. 麦康凯琼脂培养基（MacC）胨20.0g 1%中性红指示液3ml乳糖10.0g 琼脂14.0g牛胆盐 5.0g 水1000ml氯化钠 5.0g除乳糖1%中性红指示液、牛胆盐及琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，灭菌，冷至约60℃，倾注平皿。
4.4.7. 蛋白胨水培养基胰蛋白胨 10g氯化钠 5g水 1000ml取上述成分混合，加热溶化，调节pH使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管，灭菌。
4.4.8. 磷酸盐葡萄糖胨水培养基胨 7g 磷酸氢二钾（K2HPO4）2g葡萄糖 5g 水1000ml取上述成分混合，微温溶解，调节pH使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管，灭菌。
4.4.9. 枸橼酸盐培养基氯化钠 5g 枸橼酸钠（无水）2g硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0.2g 溴麝香草酚蓝指示液20ml磷酸氢二钾（K2HPO4） 1g 琼脂14g硫酸二氢铵（NH4H2PO4） 1g 水1000ml除指示液和琼脂外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH使灭菌后为6.9±0.1，加入琼脂，加热溶化，加入指示液，混匀。
分装于小试管，灭菌，制成斜面。
注：所用琼脂应不含游离糖，用前用水浸泡冲洗。
4.4.10. 乳糖培养基胨 20.0g 乳糖10.0g0.04%溴甲酚紫指示液 25ml 水1000ml除0.04%溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后为7.2±0.2，加入指示液，分装于含倒管的小试管中，每管3ml。
灭菌。
5%乳糖培养基胨 0.2g溴麝香草酚蓝指示液 6ml氯化钠 0.2g 乳糖5g磷酸氢二钠 0.2g 水100ml除乳糖和指示液外，混合各成分，微温溶解，调节pH使灭菌后为7.4，加入乳糖/指示液，混合，分装于含小倒管的灭菌小试管中，115℃灭菌15min。
4.5.对照用菌液取大肠埃希菌[CMCC(B)44102]的营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，置36±1℃培养18～24小时，取均匀培养物1 ml用0.9％灭菌氯化钠溶液稀释制成每1ml含菌10～100cfu的菌悬液，其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。
4.6.准备4.6.1. 检验量4.6.1.1. 每批供试品检验量，一般为10g或10ml，特殊贵重或微量包装的供试品检验量可以酌减。
4.6.1.2. 供试品均须取自2个以上的包装单位。
4.6.2. 供试液的制备4.6.2.1. 液体供试品取供试品10ml，加无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH7.0)至100ml，混匀，作为供试液。
4.6.2.2. 固体、半固体或黏稠液供试品取供试品10g，加无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH7.0) 至100ml，用匀浆仪（3000～5000r/min、2～4min）或其他有效的方法，混匀，作为供试液。
必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。
4.6.2.3. 非水溶性供试品方法1 取供试品5g（或5ml），加至含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻璃棒搅拌成团后，慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1：20的供试液。