生物化学第二章 蛋白质

阳离子交换树脂中，然后用该缓冲溶液洗脱，这5中
氨基酸洗脱顺序如何？并说明原因。
Asp >Thr> Gly> Leu>Lys
怎么办
小
结
1.某氨基酸的等电点即为该氨基酸两性离子 两边的pK值和的一半。 2.在氨基酸等电点以上任何pH，AA带净的负 电荷，在电场中向阳极移动；在氨基酸等 电点以下任何pH，AA带净的正电荷，在电 场中向阴极移动。 3.在一定pH范围中，溶液的pH离AA等电点愈 远，AA带净电荷愈多。
COO-
OOC CHCH2 S Hg NH3+
+
COO
-
作用：与金属离子的螯合性质可用于体内解毒。
2.2.4 侧链基团的化学性质
(1) 巯基（-SH）的性质
-
OOC CHCH2 SH
+ NH3
-
OOC CH CH2 NH3+ S S
胱氨酸
-
OOC CHCH2 SH NH3+
-
OOC CH CH2 NH3
对于中性氨基酸（一氨基一羧基氨基酸）：以R 表示带电情况，则：
R+
K1’
R0 + H+
K1’=[R0][H+]/[R+ ] 则 [ R+] = [R0][H+]/ K1’ R0
K2’
R- + H+ 则 [R-]= [R0] K2’/ [H+]
K2’=[R-][H+]/R0
当在等电点时，[ R+] = [R-]
2.2.2 -羧基参与的反应
NH3+ R CH COO
+ R CH2 NH2 + H + CO2
用途：酶催化的反应。
2.2.3 -氨基和羧基共同参与的反应
O
O H2O H2O C C C O
O C C C O
C C N C C O O C
茚三酮
C C O C O
OH OH
水合茚三酮
( 1 与 茚 三 酮 反 应
（ 3 ） 形 成 酰 卤 的 反 应
2.2.2 -羧基参与的反应
NHPG R CH COO
-
PCl3, PCl5 or SOCl2
NHPG R CHCOCl
用途：这是使氨基酸羧基活化的一个重要反应。
2.2.2 -羧基参与的反应
（ 4 ） 叠 氮 化 反 应
用途：常作为多肽合成活性中间体。
（ 5 ） 脱 羧 反 应
pH = pI
净电荷=0
pH > pI
净电荷为负
当氨基酸溶液在某一定 pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等 ，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的 pH值即为 该氨基酸的等电点(isoelctric point)。
两性离子:同一分子上带有正 负两种离子 两个概念 等电点:净电荷为零时的pH 值(用pI表示) ◆ 等电点是氨基酸的特征常数
举例 例1: 甘氨酸的pK1=2.34,pK2=9.60.问该氨基 酸在pH为5.0时在电场中的移动方向.
怎么办
解:先求出甘氨酸的等电点,再根据等电点与pH的关系,判断其 所带电荷,从而可得到答案. GlypI=(pK1+Pk2)/2=(2.34+9.60)/2=5.97 因为等电点(5.97)大于pH(5.0),故而带正电荷,所以在电场 中向负极移动.
+
◆ 通过改变溶液的pH，可使氨基酸分子的解离状态发生改变。 ◆ 氨基酸在酸性环境中，主要以阳离子的形式存在，在碱性环境 中，主要以阴离子的形式存在。
R
CH NH3+ COOH
+ +
OHH+
R CH NH3+
+ OH+ H+ (pK´2)
R
ห้องสมุดไป่ตู้COO
(pK´1)
CH NH2 COO
pH< pI
净电荷为正
当pH为11.5时,pI小于pH,故是在碱性条件下,氨基酸本身带负 电,在电场中向阳极移动.
怎么办
例3：计算0.1mol/L的谷氨酸溶液
在等电点时主要的离子浓度？
2.2 氨基酸的化学性质
2.2.1 有氨基参与的反应
2.2.1.1 与亚硝酸的反应 R-CH-COOH+HO-ON→N2+H2O+R-CHCOOH | | NH2 OH 此性质为Van Slyke氨基氮测定方法的原理.
2.2.1.2 与甲醛的反应：氨基酸是一种两性电解质，但
不能直接用酸或碱来进行定量测定。这是因为氨基酸的酸、碱 滴定的等电点pH过高（12-14）或过底（1-2），没有适当的指 示剂可被选用。但如果加入过量的甲醛，生成二羟甲基氨基酸 后即可降低氨基的碱性，而增加羧基的酸性，使其PK’值减少23个pH单位。这时即可用标准的NaOH溶液滴定。
则有：
[H+]2 = K1’ · K2’ 即 [H+]= （K1’ · K2’）1/2 等式两边取负对数得：
pH=1/2（pK1’+pK2’） 也就是pI= 1/2（pK1’+pK2’）
同样对于三个可解离的氨基酸例如天冬氨酸和赖氨酸 来说，只要写出它的解离公式，然后取两性离子两边 的pK值的平均值，则得其 等电点。如天冬氨酸的解离 如下： R+ 则
（ 1 ） 成 盐 反 应
2.2.2 -羧基参与的反应
氨基酸与碱作用生成相应的盐。氨基酸 的碱金属盐能溶于水,而重金属盐则不溶于 水。
应（ 2 ） 形 成 酯 的 反
2.2.2 -羧基参与的反应
NH3
+ -
NH2.HCl R CHCOOR2 + H2O
R CH COO + R2OH
用途：是合成氨基酸酰基衍生物的重要中间体。

等电点的计算公式:
对于一氨基一羧基和一氨基二羧基氨基酸,其公式为: pI=(pK1+Pk2)/2 对于二氨基一羧基氨基酸,其公式为: pI=(pK2+pK3)/2 等电点的主要用途: 1.分离氨基酸(离子交换,电泳等). 2.氨基酸制备(等电点沉淀法,电泳等).
等电点计算公式的推导：在氨基酸完全质子化时，各 种不同氨基酸的等电点可由下面的方法推导出来：
氨基酸的两性解离符合Bronsted – Lowry的酸碱质
子理论，即氨基酸在水溶液中的偶极离子既起酸 （质子供体），又起碱（质子受体）的作用。氨基 酸完全质子化时，可以看成是多元酸.侧链不解离的 中性氨基酸可看作二元酸，酸性氨基酸和碱性氨基 酸可视为三元酸。
在这里同样可以利用Handerson – Hasselbalch公式进行pH或氨基酸各种离 子浓度比例的计算： [质子受体] pH=pK’+lg-------------- [质子供体] pK’为表观解离常数的负对数，可用 测定滴定曲线的实验方法求得。其拐点处 PH值即为PK’
-
作用：可用于比色法定量测定半胱氨酸的含量。
2.2.4 侧链基团的化学性质
(2) 羟基的性质
O
-
OOCCHCH2OH + NH3+
F POCH(CH3)2 OCH(CH3)2
二异丙基氟磷酸酯
O
-
OOCCHCH2O NH3+
POCH(CH3)2 OCH(CH3)2
作用：可用于修饰蛋白质。
2.2.4 侧链基团的化学性质
2.2.1.7 形成西佛碱反应：氨基酸的α-氨基能与醛类化合物
反应生成弱碱，即所谓西佛碱（Schiff’s base）。 R’ | C=O + | H 醛 R | -H2O H2N-C-COOH------------→ | H 氨基酸 R’ R | | C=N-C-COOH | | H H 西佛碱
第二章 蛋白质
3.1 氨基酸的两性解离性质及等电点 3.2 氨基酸的化学性质 3.3 蛋白质的分子结构 3.4 蛋白质测序的基本方法路线
2.1 氨基酸的两性解离性质及等电点
氨基酸分子既含有酸性的羧基(-COOH)，
又含有碱性的氨基(-NH2)。其-COOH能放 出质子(H＋)，而变成-COO－；其-NH2 能 接受质子，而变成-NH3+。因此，氨基酸 是两性电解质(ampholyte)。
作用：多肽及蛋白质的 N-末端氨基酸上面的游 离氨基也能与2,4-二硝 基氟苯作用.所以此反应 常用于蛋白质一级结构 氨基末端的测定.
+
DNP-AA(黄色)
HF
2.2.1.5 氨基酸与苯异硫氰酯（PITC）的反应 （Edman反应）
+
PITC（phenylisothiocyanate） 弱碱中 (400 C)
R1 O H2N C C OH + H R2 H N C COOH H H - H2O R1 O H R2 H H 肽键 H2N C C N C COOH
用途：是多肽和蛋白质生物合成的基本反应。
2.2.4 侧链基团的化学性质
(1) 巯基（-SH）的性质
O
CH2OCCl
-
OOC CHCH2 SOCCH2 NH3+ O
+
作用：氧化还原反应可使蛋白质分子中二硫键形成或
端裂。
2.2.4 侧链基团的化学性质
(1) 巯基（-SH）的性质
COO - S + H3NCHCH2S +
S
-
CO2H 硝基苯甲酸二硫化合物(DTNB) NO2 NO2 CO2H
COO + H3NCHCH2S-S-
-
HSNO2 + CO2H
COO NO2
例2:LyspK1=2.18,pK2=8.59, pK3=10.53,问在pH为4.0和在 11.5时各带何种电荷,并说明在电场 中的移动方向.
解.因Lys属于碱性氨基酸,所以,它的等电点为: pI=(pK2+pK3)/2=(8.59+10.53)/2=9.56
怎么办
当pH为4.0时,pI大于pH,故是在酸性条件下,氨基酸本身带正 电,在电场中向阴极移动.
CH2Cl
-
OOC CHCH2 SH NH3+
-
OOC CHCH2 S CH2 NH3
+
O ICH2CNH2
OOC CHCH2 SCH2CNH2 NH3+ O
作用：这些反应可用于巯基的保护。
2.2.4 侧链基团的化学性质
(1) 巯基（-SH）的性质
-
OOC CHCH2 SH NH3+
-
+
HO-Hg+
C C C O
O C C
O OH OH + H2N CHCOOH R
O C C
)
H OH
-
+ RCHO + NH2 + CO2
+
O NH4 O C + 2H2O
HO C C O + 2NH3 + H O O
用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。
（ 2 ） 成 肽 反 应
2.2.3 -氨基和羧基共同参与的反应
西佛碱是以氨基酸为底物的某些酶促反应例如转氨基反应的 中间物。
2.2.1.8 与荧光胺反应：荧光胺可与α-氨基酸中的氨基反应
生成产荧光的化合物，且反应非常灵敏。它具有特定的激发波长 （390纳米）和发射波长（475纳米），读取发射光的荧光强度 即可测定氨基酸的含量。
2.2.1.9 脱氨基反应：见氨基酸代谢。
(硝基甲烷 400 C) H+ 苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothiohydantion-AA）
2.2.1.6 烃基化反应
Cl
CH2 CH2 Cl S: R1
R2
CH2 CH2 S+ R1
H2N CH COO
R1SCH2NHCH(R2)COO
-
用途：是鉴定多肽N-端氨基酸的重要方法。
与丹磺酰氯反应 AA AA 弱碱 多肽 DNS- 多肽 DNS + 蛋白 蛋白
酸
DNS-AA +游离AA
（乙醚抽提，有荧光）
用途：可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸.
2.2.1.4 氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB) 的反应（sanger反应）
+
DNFB（dinitrofiuorobenzene） 弱碱中 氨基酸
这里-NH2中的一个H被苄氧甲酰基（可简写为Cbz）取 代生成Cbz-氨基酸。除了苄氧甲酰氯外，酰化试剂还 有叔丁氧甲酰氯，对-甲苯磺酰氯以及邻苯二甲酸酐等。 这些酰化试剂在多肽的蛋白质的人工合成中被用作氨 基的保护试剂。
另一个酰化试剂是丹磺酰氯（dansyl chloride）， 它是5-二甲基氨基萘-1-磺酰氯的简称，被用于多肽链 NH2末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。
pK1’
R0
pK2’
R-
pK3’
R2-
pI= 1/2（pK1’+pK2’）
而赖氨酸的解离如下： R2+ 则
pK1’
R+
pK2’
R0
pK3’
R-
pI= 1/2（pK2’+pK3’）
举例 将含有Asp，Gly，Thr，Leu和Lys的pH＝3.0的缓冲 溶液，加到预先用同样缓冲溶液平衡过的Dowex－50
作用: 氨基酸的甲醛滴定（formol titration）法是氨基酸测定的一 种常用方法。当氨基酸溶液存在1摩尔/升甲醛时，滴定终点由 pH12左右移至9附近，亦即酚酞指示剂的变色区域，这就是 SØ rensen甲醛滴定法的基础。
2.2.1.3 与酰化试剂反应：
氨基酸的氨基与酰氯或酸酐在弱碱溶液中发生作用 时，氨基即被酰基化。例如与苄氧（苯甲氧）甲酰氯 （carbobenzyloxychlorride）反应：