刘缨-眼睛发育的基因调控2015

Fate Map of Neural Plate
Eagleson G, et al, J. Neurobiol.,1995
眼睛发育- Morphogenesis/patterning
Dorsal
Ventral Distal
patterning / Morphogenesis
Proximal
Eye field split
1
?RNAi
protein antibody ?
CA pr. DN pr.
Functional analysis - Approaches
Gain-of-function
• DNA template transcription DNA (expression vector) knock-in enhancer
研究内容


与眼睛发育及疾病相关的基因的筛选(What?)
基因的功能研究 (When and Where?) 基因调控机制 (How?)
研究方法
基因筛选 -
致病突变的定位 - 基因表达的差式分析
基因的功能研究
-
基因表达模式分析 - 基因的超表达和功能失活研究
基因调控机制研究 -
loss-of-function
knock-out/in silencer
• RNA
processing transportation mRNA translation • protein Modification Protein Wild-type pr. antibody Targeting constitutively active (CA) pr. dominant negative (DN) pr. mRNA RNAi RNAi (siRNA) (Morpholino, miRNA)
眼睛发育的基因调控
Eye Eye
Field (EF) specification : EFTF(toy, ET, Pax6, rx1…) Field (EF) split : hedgehog (shh) Nodal (cyclops, squint…)
Polarity
Patterning – Proximal – Distal (P-D): Dorsal -Ventral (D-V): Anterior-Posterior (A-P): Central-Peripheral (C-P) :
基因调控机制研究 -
基因间及与信号通路间的关系 - 基因及其表达蛋白的结构和功能 基因结构分析 (启动子、内含子/外显子分析…) 蛋白结构分析（X射线晶体学、NMR…） 结构和功能关系分析（点突变，片段缺失…）
The main stages of gene expression
Southern (DNA)
(O. Mangold, 1931)
Late neurula
Tailbud
Tadpole
P
Pigmented epithelium
Retina Lens
A
Cornea Eye vescicle Eye cup Optic nerve Prosencephalon
patterning / Morphogenesis
基因的功能研究
- 基因表达模式分析

转录水平(mRNA)： 翻译水平(蛋白)：
RT-PCR, Northern, 原位杂交 western blot, immunohistochemistry
- 基因的超表达和功能失活研究
DNA水平 RNA水平 蛋白水平
显微注射(microinjecton) 电穿孔(electroporation) 转染(lipofection) 体外处理(in vitro treatment)
Selectors confer different segment identity along AP axis by controlling "Realizator" genes. Hox genes
Realizator
The ultimate genes who do the job: cell adhesion, cytoskeleton, cell proliferation, apoptosis, ….
眼睛发育- Morphogenesis/patterning
Projection
眼睛发育的基因调控
结构基因： 调节基因：
“housekeeping” genes, Crystallin (晶状体球蛋白）…
转录因子 -- homeobox genes: Pax, rx1, vax, Brn3.0… Zinc Finger genes: RAR, RXR… Helix-Loop Helix genes: Mi, Mash… 信号通路分子及受体 -小有机分子： retinoic acid (RA)… 分泌蛋白和膜受体：BMPs, hedgehogs, PKA,…
基因间及与信号通路间的关系 - 基因及其表达蛋白的结构和功能
基因筛选
疾病的模式动物
病理材料的收集
结构及发育阶段特异性 组织材料的收集
遗传病家系的建立
基因的染色体定位
建立cDNA或蛋白质库
芯片技术、转录/蛋白质组技术…
基因的分离鉴定
同源基因的分离
基因的功能及调控机理研究
致病机理
发育机制
Dres Expression in eye
生物研究技术的进步也加快了与眼睛发育有关的基因的发现
222 179
国内研究现状
各大医院的眼科同行在临床防治视觉器官疾病方面做了大 量的工作，但是从基因水平来进行研究的工作还非常有限， 对眼睛发育的分子机制研究则是近年才开始。 • Department of Ophthalmology and Visual Sciences The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong. • The Laboratory of Visual Information Processing, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences
- 基因表达和功能的干扰（超表达和功能失活研究）
The main stages of gene expression
enhancer silencer
?RNAi mRNA Antisense RNA siRNA miRNA miRNA morpholino
knock-out/in expression vector
劳动、学习和生活的能力
眼睛是发育过程中最易发生畸变的器官之一
管怀庆等, <<现代基础眼科学>>, 1998
眼睛是发育过程中最易发生畸变的器官之一 ------------------------------------------------------------
视觉器官各种遗传性 疾病的发病已达2%左右； 近视、斜视、散光等等在 我国青年中的发病率已达 到50%左右；眼睛的老视、 白内障几乎是每一个人进 入中老年都会遇到的问题。
Fra Baidu bibliotek
1
Northern (RNA)
Western (protein)
基因的功能研究
- 基因表达模式分析


转录水平(mRNA)： RT-PCR, Northern, 原位杂交 翻译水平(蛋白)： western blot, immunocytochemistry 基因的表达模式决定基因功能干扰分析的位置和时间。
DNA水平 RNA水平 蛋白水平 显微注射(microinjecton) 电穿孔(electroporation) 转染(lipofection) 体外处理(in vitro treatment) 果蝇 斑马鱼 爪蟾 鸡 小鼠
模式动物:
果蝇 Drosophila 斑马鱼 Zebrafish 非洲爪蟾 Xenopus 鸡 Chick 小鼠 Mouse
研究目标
1.
分离确定与眼睛发育和疾病发生相关的基因
2.

阐明上述基因的功能和调控机制
阐明脊椎动物眼睛发育基因调控机制，为其它 器官和中枢神经系统发育机制的研究提供线索 由此确定引起各种先天性和后天性眼病的遗传 和环境因素，阐明其致病机理, 最终为建立相关 眼病的预防、诊断和临床治疗方法提供依据。
脊椎动物眼睛发育的基因调控
刘 缨 副研究员 中国科学院生物物理研究所
眼睛是人体最重要的感觉器官 ---------------------------------------------人从外界环境获得的
视觉
各种信息中，80%以上经
由视觉通道输入；视觉的 敏锐与否直接影响个人的
听觉、嗅觉、味觉等
>80%
研究意义 劳动、学习和生活
预防
其他器官发育 和疾病的机制
基各 因种 突诱 变变 :因 :素
诊断
治疗
眼睛发育的机制
致病机理研究
研究意义 ----------------------------------------确定引起各种先天性和后天性眼病的遗 传和环境因素，促进对其致病机理研究，提 高眼病预防、诊断和治疗水平。
果蝇 斑马鱼 爪蟾 鸡 小鼠
基因的功能分析
- 基因表达和功能的干扰（超表达和功能失活研究） 基因的表达模式决定基因功能干扰分析的位置和时间。
基因功能干扰的位置和时间（剂量）控制 ： （1）人工导入的控制 （2）特异性启动子的控制：tissue/cell type/gene specific, hsp, etc ( 3 ) 可诱导融合蛋白
A model for Hox regulation (Garcia-Bellido, 1975)
Activator
"Activator" genes delimit the realm of expression of "Selector" genes. Maternal signal
Selector
Wolpert, L, Principle of Development, 2nd, 2002
The vertebrate eye
Giuseppina Barsacchi
视觉神经系统
Xenopus development
Fertilization
Cleavage: blastula
blastomere
Eye field specification
(Nieuwkoop and Faber, 1994)
Vertebrate eye development
Early neurula Mid-neurula
Retina Lens
P
A
Eye field specification
Eye field split

揭开脊椎动物眼睛发育的秘密，并为其 它器官和系统发育机制的研究提供线索。

国际研究状况
美国： University of Texas, the Hermann Eye Centre：Retnet Howard Hughes Medical Institute, Connie Cepko St Jude Children‘s Research Hospital, Guillermo Oliver 欧洲： 意大利Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM) 德国马普研究所, Peter Gruss 瑞士巴塞尔大学，Gehring WJ Biotechnology EEC network - 英国剑桥大学、University College London - 德国马普研究所 - 意大利比萨大学 - 西班牙（CSIC）Cajal研究所
基因筛选
结构及发育阶段特异性 组织材料的收集
脑（端、间、中、后）、脊髓、视网膜 神经管（前、后）、视杯/视泡 神经板（前、后）、脊索

研究内容及方法
基因筛选 基因的功能研究 -
基因表达模式分析 (expression pattern analysis) => 可能性 (possibility) - 基因的超表达研究(gain-of-function) => 充分性(sufficiency) - 基因的功能失活研究(loss-of-function) => 必要性(necessity)
Neural induction Neurogenesis connection genesis
Gastrulation:gustrula
Neurulation: neurula
Organogenesis tailbud tadpole Metamorphosis Maturation: adult