高效液相色谱操作步骤1
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高效液相色谱
1.概述-发展
• 关于色谱分离方法的研究始于1901年，俄国植物 学家 Tswett（茨维特）在研究植物叶子的组成 时，用碳酸钙填充竖立的玻璃管，以石油醚洗脱 植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植 物色素在碳酸钙柱中实现分离，由一条色带分散 成三种颜色的6个色带。
• 两年后他发表了他的研究成果“一种新型吸附现 象及其在生化分析上的应用”，提出了应用吸附 原理分离植物色素的新方法，在这一方法中把玻 璃管叫做“色谱柱”，碳酸钙叫做“固定相”， 石油醚叫做 “流动相”。三年后，他将这种方 法命名为色谱法（Chromatography）。
色谱柱简介
• 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如 （NH2）和氰基团（CN）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此， 分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先 被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正 已烷，氯仿，二氯甲烷等。
• 分离效率高 若用塔板理论数来表示色谱柱的效率，每米柱长可达几 千至几十万的塔板数，特别适用于极复杂混合物的分离， 且通常收率、产率、和纯度都较高。
• 操作模式多样 可通过选择不同的操作模式，以适应不同样品的分离。
• 灵敏度高 可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。
• 常用的极性吸附剂：硅胶、氧化铝。 • 常用的非极性吸附剂：活性炭。
凝胶过滤色谱
凝胶过滤色谱（凝胶渗透色 谱、分子筛滤过色谱、排阻 色谱）
原理：分子筛作用
葡聚糖凝胶（sephadex G） 羟丙基葡聚糖凝胶(sephadex LH-20)
离子交换树脂法
原理：可交换离子与树脂上的交换基团进 行离子交换，并被吸附，用适当的溶剂 从柱上洗脱下来，实现物质的分离。
常用的固定相（色谱柱填料）
• 硅胶
• 凝胶
• 活性炭
• 纤维素衍生物
• 离子交换树脂
• 环糊精
• 大孔吸附树脂
• 聚丙烯酰胺
• 氧化铝
• 硅胶：应用广泛，适合各类成分
• 氧化铝：主要用于碱性或中性亲脂性成分，如生 物碱、甾体、萜类等
• 活性炭:用于水溶性氨基酸、糖类及苷类
• 聚酰胺：主用于酚类、醌类如黄酮类、蒽醌类及 鞣质等成分
色谱分离法
分配色谱
吸附色谱
凝胶过滤 色谱
大孔树脂 色谱
离子交换 色谱
吸附色谱
• 物理吸附：硅胶、氧化铝、活性炭为吸附剂进行 的吸附色谱；
• 化学吸附：黄酮等酚酸性物质被氧化铝吸附、生 物碱被酸性硅胶吸附等；
• 半化学吸附：聚酰胺与黄酮类、醌类等酚性化合 物之间的氢键吸附，吸附力较弱，介于物理吸附 与化学吸附之间。
• 反相柱------固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱 官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓 冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的 组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。 常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5 （Phenyl）等。
底相交两点之间的距离 – 半(高)峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰
高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两侧 相交两点之间的距离
HPLC的图形结果 --色谱图(Chromatogram)
色谱图:色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间 的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为保留时间.
• 色谱法于二十世纪五十年代之后飞速发展， 并发展出一个独立的三级学科-色谱学。
• 1952年英国科学家阿切尔·马丁、理查 德·辛格因发明了分配色谱法而共同获得 诺贝尔化学奖，此外色谱分析方法还在12 项获得诺贝尔化学奖的研究工作中起到关 键作用。
1.概述-色谱分离的特点
• 应用范围广 复杂混合物，有机同系物，异构体，手性异构体。 气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。 液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。
不对称因子 (As) =B
A
拖尾因子T拖=f尾因A子+ B(Tf)
2A
10% 峰高
5% 峰高
液相色谱图相关术语(3)
色谱图相关术语: 基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所产 生的响应信号的曲线
基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓慢变 化
基线噪声(N)(Baseline Noise):由各种因素所引起的 基线波动
洗脱方式
❖ 等度洗脱 用恒定配比的溶剂系统洗脱
❖ 梯度洗脱 在一个分析周期内，按一定程序不断改 变流动相的浓度配比。
化学键合相
利用化学反应将不同的有机官能团通过共价键键 合到载体硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相。 种类 非极性键合相：
如键合C18、C8、苯基等，其中十八烷（ODS或 C18）键合相是常用的代表，可完成HPLC分析任 务的80%。 中等极性键合相： 如键合醚基，可分离能形成氢键的化合物（如酚 类）
流动相
• 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度 H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇 ＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃
• 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序 正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇
流动相的选择原则
• ①样品易溶，且溶解度尽可能大。 • ②化学性质稳定，不损坏柱子。 • ③不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。 • ④粘度低，流动性好。 • ⑤易于从其中回收样品。 • ⑥无毒或低毒，易于操作。 • ⑦易于制成高纯度，即色谱纯。 • ⑧废液易处理，不污染环境
←色谱峰
峰宽 时间(分)
基线 ↓
峰高
❖ 分离度
❖ 峰宽Wb：色谱峰拐 点处的两条切线与基
线的两个交点之间的 距离；
❖ 半峰宽Y1/2：峰高一 半处对应的峰宽，为
2.35 ；
❖ 相邻色谱峰峰顶之间
的距离除以此二色谱 峰的平均宽度。用R 表示：
t t R
r2
r1
w w 1/ 2
w w b1
❖ 色谱分离的几个概念
❖ 所有的色谱分离操作均分为：装柱、上样、层 析、洗脱。
❖ 其中的固定不动的相，称为固定相；
❖ 携带试样混合物流过此固定相的流体，称为流 动相；
❖ 作为流动相的液体或气体，称为洗脱剂；
❖ 洗脱时从柱中流出的溶液，称为洗脱液；
❖ 加入洗脱剂使各组分分层的操作，叫层析，也 叫展开。
❖ 良好的检测器其噪声与漂移都应很小。
流动相脱气的方法
❖ 超声波振荡脱气 ❖ 惰性气体鼓泡吹扫脱气 ❖ 在线（真空）脱气
HPLC用水
❖ 专门的纯水机或超纯水机； ❖ 二次或三次重蒸水； ❖ 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水； ❖ 其它途径；
流动相溶剂的要求
❖ 溶剂对于待测样品 必须具有合适的极性和良好 的选择性。
b2
2tr
b1
b2
❖定性时要求：R =1.0（相邻两峰分离程度98%）
❖定量时要求：R =1.5（相邻两峰分离程度99.7%， 基线分离，作为完全分离的标准）。
❖一般将R≥1作为色谱能较好分离的判据。
液相色谱图相关术语(2)
色谱图相关术语: 峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响应值
化学键合相
利用化学反应将不同的有机官能团通过共价键键 合到载体硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相。 种类 非极性键合相：
如键合C18、C8、苯基等，其中十八烷（ODS或 C18）键合相是常用的代表，可完成HPLC分析任 务的80%。 中等极性键合相： 如键合醚基，可分离能形成氢键的化合物（如酚 类）
分配系数不同。
正相分配色谱：流动相极性< 固定相极性 反相分配色谱：流动相极性>固定相极性
液相色谱类型
• 正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 • 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。
用的最多，约占60～70％。
高效液相色谱仪的应用
• 1.环境污染物分析：大气、水、土壤和食品中的多 环芳烃、多环联苯，阴离子表面活性剂，有机氯农 药、有机磷农药，除草剂，酚类胺类，黄曲霉毒素 等污染物的分离与鉴定。
分离原理
❖ 色谱过程的本质是待分离物质分子在固 定相和流动相之间分配平衡的过程，不同 的物质在两相之间的分配会不同，这使其 随流动相运动速度各不相同，随着流动相 的运动，混合物中的不同组分在固定相上 相互分离。
❖ 不同组分在色谱分离过程中分离情况取 决于各组分在两相间的分配系数、吸附能 力、亲和力等的差异。
保留时间(tR)(Retention time)：组分从进样到出现峰 最 大值所需的时间
噪声和漂移
❖ 噪声（N） ：在没有样品进入检测器时，基线 在短期内发生的波动。
❖ 噪声的来源：固定液的流失、载气的不纯，电 子元件不稳定、温度变化、外磁场干扰等。
❖ 基线漂移：基线在一定时间内产生的单向、缓 慢移动。
评价色谱柱好坏的标准
1）理论塔板数n 2）拖尾因子Tf 3) 色谱柱批与批之间的重现性 4）pH值的适用范围 5）使用寿命
• 柱效率
• 实际工作中，塔板数的计算用下列公式：
n 5.54( tR )2 16( tR )2
Y1/ 2
Wb
• 而理论塔板数的计算公式为：
n=L/H 其中L为色谱柱的柱长； H为理论板高度。
考虑到组分在死时间内不参与柱内分配，用
调整保留时间代替保留时间，得有效塔板数和有
效塔板高度：
n 5.54( tR )2 Y1/ 2
❖ 调Biblioteka Baidu保留时间（t R ＇）： t R＇= t R－t M
液相色谱图相关术语(1)
• 色谱图相关术语:
– 色谱峰(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生 的响应信号的微分曲线
– 峰底(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线 – 峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距离 – 峰宽(Peak Width):在峰两侧拐点处所作切线与峰
❖ 溶剂要与检测器匹配 对于紫外吸收检测器，应 注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较 大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。
❖ 高纯度 由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂 的纯度也要求高。
❖ 化学稳定性好
❖ 低粘度 若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不 利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙 腈等。
色谱分离过程理论基础
❖ 塔板理论
❖ 由马丁（Martin）和欣革（Synge）最早提出
❖ 将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色谱柱设想 成由许多小段组成。在每一小段内，一部分空间 被固定相占据，而另一部分空间充满流动相。组 分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。 在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间 形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从 一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平 衡。一个色谱柱的塔板数越多，其分离效果就越 好。
n有效
5.54(
t
' R
)2
Y1/ 2
16(
t
' R
)2
Wb
L H 有效 n有效
❖保留值是色谱过程的基本热力学参数之一。在相同 的操作条件下，不同的物质有各自固有的保留时间， 因此它也是色谱定性的基本依据。
❖ 保留时间（t R）：从进 样到某个组分的色谱峰 顶点之间的时间间隔
❖ 死时间（t M）：不被固 定相滞留的组分从进样 开始、通过色谱柱、到 出现峰最大值所需要的 时间。
标准偏差(σ)(Standard Error):0.607倍峰高处所对 应峰宽的一半
拖尾峰(Tailing Peak):后沿较前沿平缓的不对称峰
前伸峰(Leading Peak):前沿较后沿平缓的不对称峰
鬼峰(Ghost Peak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰
h
AB
1/10h
拖尾
T
f
＝
B A
前伸
• 2.精细化工：在精细化工生产中使用的具有较高分 子量和较高沸点的有机化合物，如高碳数脂肪族或 芳香族的醇、药物、燃料，工业产品的醛、酮、醚、 酸、酯等化工原料，以及各种表面活性物质的分离 与测定。
• 3.食品、药品质量分析：药物残留，防腐剂、抗氧 化剂、人工合成色素等食品添加剂的分离与测定， 保健食品中的功效成分检测，真菌毒素分析等。
吸附规律 阳离子交换树脂—分离碱性成分 阴离子交换树脂—分离酸性成分
大孔吸附树脂
❖ 吸附性和分子筛原理相结合以苯乙烯为母体，二乙烯苯 为交联剂（非极性）
❖ 吸附力：范德华力或氢键
❖ 工艺流程：树脂预处理→树脂上柱→药液上柱→树脂的 解吸→树脂的清洗、再生。
分配色谱 原理：被分离成分在固定相和流动相之间的
1.概述-发展
• 关于色谱分离方法的研究始于1901年，俄国植物 学家 Tswett（茨维特）在研究植物叶子的组成 时，用碳酸钙填充竖立的玻璃管，以石油醚洗脱 植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植 物色素在碳酸钙柱中实现分离，由一条色带分散 成三种颜色的6个色带。
• 两年后他发表了他的研究成果“一种新型吸附现 象及其在生化分析上的应用”，提出了应用吸附 原理分离植物色素的新方法，在这一方法中把玻 璃管叫做“色谱柱”，碳酸钙叫做“固定相”， 石油醚叫做 “流动相”。三年后，他将这种方 法命名为色谱法（Chromatography）。
色谱柱简介
• 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如 （NH2）和氰基团（CN）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此， 分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先 被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正 已烷，氯仿，二氯甲烷等。
• 分离效率高 若用塔板理论数来表示色谱柱的效率，每米柱长可达几 千至几十万的塔板数，特别适用于极复杂混合物的分离， 且通常收率、产率、和纯度都较高。
• 操作模式多样 可通过选择不同的操作模式，以适应不同样品的分离。
• 灵敏度高 可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。
• 常用的极性吸附剂：硅胶、氧化铝。 • 常用的非极性吸附剂：活性炭。
凝胶过滤色谱
凝胶过滤色谱（凝胶渗透色 谱、分子筛滤过色谱、排阻 色谱）
原理：分子筛作用
葡聚糖凝胶（sephadex G） 羟丙基葡聚糖凝胶(sephadex LH-20)
离子交换树脂法
原理：可交换离子与树脂上的交换基团进 行离子交换，并被吸附，用适当的溶剂 从柱上洗脱下来，实现物质的分离。
常用的固定相（色谱柱填料）
• 硅胶
• 凝胶
• 活性炭
• 纤维素衍生物
• 离子交换树脂
• 环糊精
• 大孔吸附树脂
• 聚丙烯酰胺
• 氧化铝
• 硅胶：应用广泛，适合各类成分
• 氧化铝：主要用于碱性或中性亲脂性成分，如生 物碱、甾体、萜类等
• 活性炭:用于水溶性氨基酸、糖类及苷类
• 聚酰胺：主用于酚类、醌类如黄酮类、蒽醌类及 鞣质等成分
色谱分离法
分配色谱
吸附色谱
凝胶过滤 色谱
大孔树脂 色谱
离子交换 色谱
吸附色谱
• 物理吸附：硅胶、氧化铝、活性炭为吸附剂进行 的吸附色谱；
• 化学吸附：黄酮等酚酸性物质被氧化铝吸附、生 物碱被酸性硅胶吸附等；
• 半化学吸附：聚酰胺与黄酮类、醌类等酚性化合 物之间的氢键吸附，吸附力较弱，介于物理吸附 与化学吸附之间。
• 反相柱------固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱 官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓 冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的 组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。 常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5 （Phenyl）等。
底相交两点之间的距离 – 半(高)峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰
高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两侧 相交两点之间的距离
HPLC的图形结果 --色谱图(Chromatogram)
色谱图:色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间 的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为保留时间.
• 色谱法于二十世纪五十年代之后飞速发展， 并发展出一个独立的三级学科-色谱学。
• 1952年英国科学家阿切尔·马丁、理查 德·辛格因发明了分配色谱法而共同获得 诺贝尔化学奖，此外色谱分析方法还在12 项获得诺贝尔化学奖的研究工作中起到关 键作用。
1.概述-色谱分离的特点
• 应用范围广 复杂混合物，有机同系物，异构体，手性异构体。 气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。 液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。
不对称因子 (As) =B
A
拖尾因子T拖=f尾因A子+ B(Tf)
2A
10% 峰高
5% 峰高
液相色谱图相关术语(3)
色谱图相关术语: 基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所产 生的响应信号的曲线
基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓慢变 化
基线噪声(N)(Baseline Noise):由各种因素所引起的 基线波动
洗脱方式
❖ 等度洗脱 用恒定配比的溶剂系统洗脱
❖ 梯度洗脱 在一个分析周期内，按一定程序不断改 变流动相的浓度配比。
化学键合相
利用化学反应将不同的有机官能团通过共价键键 合到载体硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相。 种类 非极性键合相：
如键合C18、C8、苯基等，其中十八烷（ODS或 C18）键合相是常用的代表，可完成HPLC分析任 务的80%。 中等极性键合相： 如键合醚基，可分离能形成氢键的化合物（如酚 类）
流动相
• 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度 H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇 ＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃
• 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序 正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇
流动相的选择原则
• ①样品易溶，且溶解度尽可能大。 • ②化学性质稳定，不损坏柱子。 • ③不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。 • ④粘度低，流动性好。 • ⑤易于从其中回收样品。 • ⑥无毒或低毒，易于操作。 • ⑦易于制成高纯度，即色谱纯。 • ⑧废液易处理，不污染环境
←色谱峰
峰宽 时间(分)
基线 ↓
峰高
❖ 分离度
❖ 峰宽Wb：色谱峰拐 点处的两条切线与基
线的两个交点之间的 距离；
❖ 半峰宽Y1/2：峰高一 半处对应的峰宽，为
2.35 ；
❖ 相邻色谱峰峰顶之间
的距离除以此二色谱 峰的平均宽度。用R 表示：
t t R
r2
r1
w w 1/ 2
w w b1
❖ 色谱分离的几个概念
❖ 所有的色谱分离操作均分为：装柱、上样、层 析、洗脱。
❖ 其中的固定不动的相，称为固定相；
❖ 携带试样混合物流过此固定相的流体，称为流 动相；
❖ 作为流动相的液体或气体，称为洗脱剂；
❖ 洗脱时从柱中流出的溶液，称为洗脱液；
❖ 加入洗脱剂使各组分分层的操作，叫层析，也 叫展开。
❖ 良好的检测器其噪声与漂移都应很小。
流动相脱气的方法
❖ 超声波振荡脱气 ❖ 惰性气体鼓泡吹扫脱气 ❖ 在线（真空）脱气
HPLC用水
❖ 专门的纯水机或超纯水机； ❖ 二次或三次重蒸水； ❖ 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水； ❖ 其它途径；
流动相溶剂的要求
❖ 溶剂对于待测样品 必须具有合适的极性和良好 的选择性。
b2
2tr
b1
b2
❖定性时要求：R =1.0（相邻两峰分离程度98%）
❖定量时要求：R =1.5（相邻两峰分离程度99.7%， 基线分离，作为完全分离的标准）。
❖一般将R≥1作为色谱能较好分离的判据。
液相色谱图相关术语(2)
色谱图相关术语: 峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响应值
化学键合相
利用化学反应将不同的有机官能团通过共价键键 合到载体硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相。 种类 非极性键合相：
如键合C18、C8、苯基等，其中十八烷（ODS或 C18）键合相是常用的代表，可完成HPLC分析任 务的80%。 中等极性键合相： 如键合醚基，可分离能形成氢键的化合物（如酚 类）
分配系数不同。
正相分配色谱：流动相极性< 固定相极性 反相分配色谱：流动相极性>固定相极性
液相色谱类型
• 正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 • 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。
用的最多，约占60～70％。
高效液相色谱仪的应用
• 1.环境污染物分析：大气、水、土壤和食品中的多 环芳烃、多环联苯，阴离子表面活性剂，有机氯农 药、有机磷农药，除草剂，酚类胺类，黄曲霉毒素 等污染物的分离与鉴定。
分离原理
❖ 色谱过程的本质是待分离物质分子在固 定相和流动相之间分配平衡的过程，不同 的物质在两相之间的分配会不同，这使其 随流动相运动速度各不相同，随着流动相 的运动，混合物中的不同组分在固定相上 相互分离。
❖ 不同组分在色谱分离过程中分离情况取 决于各组分在两相间的分配系数、吸附能 力、亲和力等的差异。
保留时间(tR)(Retention time)：组分从进样到出现峰 最 大值所需的时间
噪声和漂移
❖ 噪声（N） ：在没有样品进入检测器时，基线 在短期内发生的波动。
❖ 噪声的来源：固定液的流失、载气的不纯，电 子元件不稳定、温度变化、外磁场干扰等。
❖ 基线漂移：基线在一定时间内产生的单向、缓 慢移动。
评价色谱柱好坏的标准
1）理论塔板数n 2）拖尾因子Tf 3) 色谱柱批与批之间的重现性 4）pH值的适用范围 5）使用寿命
• 柱效率
• 实际工作中，塔板数的计算用下列公式：
n 5.54( tR )2 16( tR )2
Y1/ 2
Wb
• 而理论塔板数的计算公式为：
n=L/H 其中L为色谱柱的柱长； H为理论板高度。
考虑到组分在死时间内不参与柱内分配，用
调整保留时间代替保留时间，得有效塔板数和有
效塔板高度：
n 5.54( tR )2 Y1/ 2
❖ 调Biblioteka Baidu保留时间（t R ＇）： t R＇= t R－t M
液相色谱图相关术语(1)
• 色谱图相关术语:
– 色谱峰(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生 的响应信号的微分曲线
– 峰底(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线 – 峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距离 – 峰宽(Peak Width):在峰两侧拐点处所作切线与峰
❖ 溶剂要与检测器匹配 对于紫外吸收检测器，应 注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较 大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。
❖ 高纯度 由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂 的纯度也要求高。
❖ 化学稳定性好
❖ 低粘度 若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不 利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙 腈等。
色谱分离过程理论基础
❖ 塔板理论
❖ 由马丁（Martin）和欣革（Synge）最早提出
❖ 将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色谱柱设想 成由许多小段组成。在每一小段内，一部分空间 被固定相占据，而另一部分空间充满流动相。组 分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。 在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间 形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从 一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平 衡。一个色谱柱的塔板数越多，其分离效果就越 好。
n有效
5.54(
t
' R
)2
Y1/ 2
16(
t
' R
)2
Wb
L H 有效 n有效
❖保留值是色谱过程的基本热力学参数之一。在相同 的操作条件下，不同的物质有各自固有的保留时间， 因此它也是色谱定性的基本依据。
❖ 保留时间（t R）：从进 样到某个组分的色谱峰 顶点之间的时间间隔
❖ 死时间（t M）：不被固 定相滞留的组分从进样 开始、通过色谱柱、到 出现峰最大值所需要的 时间。
标准偏差(σ)(Standard Error):0.607倍峰高处所对 应峰宽的一半
拖尾峰(Tailing Peak):后沿较前沿平缓的不对称峰
前伸峰(Leading Peak):前沿较后沿平缓的不对称峰
鬼峰(Ghost Peak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰
h
AB
1/10h
拖尾
T
f
＝
B A
前伸
• 2.精细化工：在精细化工生产中使用的具有较高分 子量和较高沸点的有机化合物，如高碳数脂肪族或 芳香族的醇、药物、燃料，工业产品的醛、酮、醚、 酸、酯等化工原料，以及各种表面活性物质的分离 与测定。
• 3.食品、药品质量分析：药物残留，防腐剂、抗氧 化剂、人工合成色素等食品添加剂的分离与测定， 保健食品中的功效成分检测，真菌毒素分析等。
吸附规律 阳离子交换树脂—分离碱性成分 阴离子交换树脂—分离酸性成分
大孔吸附树脂
❖ 吸附性和分子筛原理相结合以苯乙烯为母体，二乙烯苯 为交联剂（非极性）
❖ 吸附力：范德华力或氢键
❖ 工艺流程：树脂预处理→树脂上柱→药液上柱→树脂的 解吸→树脂的清洗、再生。
分配色谱 原理：被分离成分在固定相和流动相之间的