海洋藻类基因工程研究综述

海洋藻类基因工程综述

藻类基因工程亦称藻类遗传工程或藻类重组DNA技术，是以海藻为研究对象将某种生物基因通过基因载体或其他手段运送到海藻活细胞中，并使之增殖(克隆)和行使正常功能(表达)，从而创造出藻类新品种的遗传学技术。

通过对藻类基因工程的研究，一方面期望从改造的藻体中筛选出抗性强且生长快的优良藻种，并把藻类作为新型的生物反应器生产某种特殊的有用物质；另一方面期望从藻类中分离、克隆有重要经济价值的基因，作为农作物改良的目的基因或用于微生物发酵生产。

藻类基因工程起步较晚，国际上藻类基因工程研究的热点，从70年代淡水蓝藻，经80年代海洋蓝藻和淡水真核微藻，到90年代大型藻，体现了从原核到真核，从淡水到海水，从模式藻到经济藻，从单细胞、丝状体微藻到多细胞大型藻的发展趋势。

蓝藻又名蓝细菌(Cyanobacteria)，是一类光合自养的原核生物。它结构简单、生长迅速、适应性强、易于进行遗传操作，并且多数不含毒蛋白，可作为很好的基因工程受体系统。作为基因工程受体，与大肠杆菌相比其表达产物不形成包涵体，容易纯化；不含毒素，比较安全；培养基为无机盐，廉价不易污染。

蓝藻是藻类中最早能稳定地表达外源基因的种类。从1970年发现蓝藻可以转化，1973年证明蓝藻中含有质粒，1981年首次在蓝藻中表达外源基因成功，到1996年聚胞藻PCC6803作为第一个光合生物完成了

基因组全序列测定，蓝藻的研究一直处于整个生物学的前沿，有些研究较多的蓝藻种类已成为分子生物学和基因工程研究中的重要模式生物目前，蓝藻基因工程主要研究的内容包括基因的选择、鉴定、测序、序列分析与克隆，载体的构建，调控表达原件的分析，基因转化系统的发现和筛选，转基因蓝藻的筛选及培养条件的优化等。

蓝藻质粒广泛用于构建基因载体。自1973年发现蓝藻质粒以来，已在约50 %被检单细胞及丝状蓝藻中证明了内源性质粒的存在，质粒数目从1~10个不等，大小在1.3-130 Kb之间，但只在极少数淡水蓝藻中找到质粒编码功能的证据，一般认为蓝藻质粒属隐秘型质粒。至今蓝藻质粒尚未发现可识别的遗传标记，不能在E.coli中复制，不能作为克隆载体。用含Tn901的E.coli质粒转化淡水蓝藻Synechococcus PCC 7942，由于Tn901插入蓝藻内源质粒，第一次得到带Apr标记的杂交质粒pCH1及衍生质粒pUC1，将后者与pCYC184融合，首次获得了双向质粒

pUC104和pUC105，其后，利用多种单细胞蓝藻质粒与E.coli质粒如pBR322等重组，或引入多克隆位点，或补充新的选择标记，改善载体克隆潜力，又相继构建了许多双向质粒。这类嵌有细菌遗传标记的重组质粒，由于在细菌和蓝藻中均能复制、稳定存在和表现选择标记，故被称为穿梭载体(Shuttle vector)。至今，应用于蓝藻遗传转化的供体DNA大体可分为三类:第一类是直接利用未修饰的外源质粒，如pBR322，pBR328等，可将外源DNA导入蓝藻，但效率很低，且对受体需做特殊的处理；第二类是利用自身染色体或基因组，通过同源重组作为插入突变的有效方法，在这方面，海洋蓝藻Synechococcus PCC 700 Stevens，1980年有过成功尝试，嵌入Strr标记的染色体片段天然转化成功;第三类即是穿梭载体。研究结果表明，穿梭载体是一方便、有效的运载体，海洋蓝藻的遗传转化也大多采用穿梭载体作为中介。

蓝藻基因转移系统主要可分为两类：一类是遗传转化，包括自然转化、诱导转化、电击转化。自然转化如聚球藻PCC7002、PCC7942和集胞藻PCC6803等，具有自然吸收外源DNA的能力，然而到目前为止自然转化的机制尚不清楚。诱导转化是利用溶菌酶、Ca2+诱导细胞感受态，或利用溶菌酶EDTA处理产生原生质球用于蓝藻转化。自从1989年Thiel等首次通过电击转化成功地把穿梭表达载体pRL6转入鱼腥藻M131以来，已有一批穿梭表达质粒通过电击在多种蓝藻中转化成功。除了遗传转化另一类便是接合转移，接合转移是目前蓝藻基因转移系统中使用最为普遍的一种方法。它操作较为简单，适用于大多数的单细胞、丝状蓝藻。从Wolk 首创鱼腥藻接合转移系统以来，这个系统已被修改并可应用于其它藻株，如念珠藻属、集胞藻属、聚球藻属、织线藻属等。此外，楼士林等也尝试用超声转化蓝藻并取得了一定的成功。

现已证明，来自大肠杆菌、枯草杆菌以及人的一些外源基因可以在蓝藻中表达，例如大肠杆菌谷氨酸脱氢酶基因在蓝藻中表达引起抗铵，人的超氧化物歧化酸(superoxide dismutase， SOD)基因在蓝藻中表达以减少氧胁迫。这就可能通过引入外源基因，以赋于蓝藻新的遗传特性，或作为重要的天然产物基因表达的宿主。目前还成功地将芽孢杆菌的杀虫毒素基因导入并表达于几种蓝藻细胞中。在医药保健方面、在环境保护方面、农业方面、在蚊虫控制方面、生物传感器方面等的的应用研究，这些都标志着蓝藻基因工程正向着实用目标迈进。

真核藻类(eukaryotic algae)基因工程起始于80年代，Rochaix和Dillewjin(1983)第一个报道了他们利用质粒为载体对单细胞绿藻——莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardi Dang)进行基因转移的研究。随着真核藻类基因工程

研究的广泛深入，目前衣藻已成为叶绿体、线粒体与染色体三套基因组均能遗传转化的藻类。除衣藻外，椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea Gern.)也正在成为另一个单细胞绿藻转化系统，目前已对20余种红藻进行了研究，在14种红藻中发现有质粒，数目一至多个不等。近两年来，在一些经济藻类如钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)、真江蓠(Gracilaria asiatica)中也发现了质粒。真核藻类特别是一些经济藻类质粒的发现，为真核藻类基因工程提供了潜在的载体，对藻类基因工程的发展具有积极意义。

对于衣藻，其中染色体转化最简便，最有效的方法是玻璃珠研磨法，但必须选用细胞壁缺失突变株或选用配子自溶素(gamete autolysin)消化去壁。筛选的方法，一般采用互补选择。选用营养缺陷、光合作用缺陷或鞭毛缺失突变株，转化野生型基因，再利用局限营养、光合作用、运动等特性筛选转化子。1982年Roehaix用携带有酵母arg4位点和复制起点的酵母质粒成功地转化了一个缺壁嗜精氨酸(具arg7位点突变)莱茵衣藻突变体，得到了能在不加精氨酸的培养基上生长的转化藻株，但转化频率很低。Letmg(1985)用SV40（猴空泡病毒）启动子、APH基因产生Ap、Kar、neo及G418抗性和2μm的酵母复制起点作为异源复制子，构成pSVzneo 2μm质粒转化缺壁的衣藻突变体，得到了抗新霉类似物G418的转化藻株。Karen和Kindle(1990)利用玻璃珠研磨法，将莱茵衣藻野生型中的硝酸还原酶基因转人到含有nitl-305的突变藻株中，以硝酸盐为唯一氮源进行筛选，获得了103转化体／ug DNA的高频转化率。Hall等(1993)采用玻璃珠研磨法，将含有NPTⅡ和nos启动子的pGA482转化莱茵衣藻硝酸还原酶突变株，用双选择标记筛选，硝酸盐筛选的转化子中52％对卡那霉素具有抗性，这是首次关于将外源DNA 转人到莱茵衣藻中的报道。目前叶绿体转化最有效的方法是基因枪法。Boynton 等(1988)报道了该小组用基因枪喷射技术把带有克隆野生型叶绿体DNA片段导人距细胞膜很近的莱茵衣藻杯状叶绿体中，使发生25kb删除突变的叶绿体基因组恢复原长度和功能。

对于小球藻(Chlorella ellipsoidea)，Jarivs等(1991)用PEG9(聚乙二醇)法成功地将荧光素酶基因导人椭圆小球藻的原生质体中获得了瞬间表达；Masato 等(1994)用电击法以CaMV35S为启动子将GUS(转β-葡糖醛酸酶)基因导入(C．saccharophila)的原生质体中也获得了瞬问表达。但由于小球藻细胞壁成份复杂。不同生长阶段细胞壁成分不同，不易获得高产量的原生质体，因此PEG转化法对小球藻具有一定的局限性。陈颖等(1998a；1988b)分别用基因枪法和电击法利用不同启动子将GUS基因成功地导人完整的小球藻细胞中，得到瞬时表达，