蛋白纯化试剂盒说明书

蛋白纯化试剂盒

介绍

试剂盒有10个重力流柱，而该柱在自然条件下纯化可重新装填Ni-IDA Sefinose TM 6 Fast Flow 和结合缓冲液，洗脱液。这10个柱子通过固定化金属亲和层析可用于纯化带组氨酸标签的蛋白。Ni-IDA Sefinose 6 Fast Flow 有很高的蛋白结合能力，低镍离子（Ni2 +）的泄漏以及可与变性剂和广泛的添加剂相兼容。澄清和非澄清的样品可使用该柱。特殊的frits 在纯化过程可防止介质变干燥。一次纯化平均需要30分钟。在变性下纯化，请自备额外的结合缓冲液和洗脱液。

特征

柱材料聚丙烯桶，聚乙烯筛板

介质Ni-IDA Sefinose 6 Fast Flow

平均粒径90 µm

蛋白结合能力约6 mg组氨酸标签蛋白/1毫升树脂

床体积 1 mL/柱

使用时兼容性在各种通用缓冲液，洗涤剂和变性剂中稳定

避免在缓冲液中含螯合剂，例如EDTA，EGTA，柠檬酸等

pH稳定性，短期（2h）2-14

储存20%乙醇

保存温度4或30℃

与NI-IDA树脂相兼容的试剂

还原试剂

5 mmol/L DTE(二硫赤藓糖醇)

5 mmol/L DTT(二硫苏糖醇)

20 mmol/L β-巯基乙醇

5 mmol/L TCEP(磷酸三氯乙酯)

10 mmol/L 还原型谷胱甘肽

变性剂

8 mol/L尿素

6 mol/L 盐酸胍

洗涤剂

2% TritonX-100(非离子物质)

2% Tween 20（非离子物质）

2% NP-40 (非离子物质)

2% 胆酸盐

1% CHAPS（两性离子）

其他添加剂

20% 乙醇

50% 甘油

100 mmol/L Na2SO4

1.5 mol/L NaCl

1 mmol/L EDTA

60 mmol/L柠檬酸盐

100 mmol/L 磷酸钠，pH 7.4 缓冲液

100 mmol/L Tris-HCl pH 7.4

100 mmol/L Tris pH 7.4

100 mmol/L HEPES pH 7.4

100 mmol/L MOPS pH 7.4

100 mmol/L 醋酸钠pH 4

注意：

1.为了最佳的操作过程，按照上述纯化步骤进行预洗以除去任何削弱结合镍离子的物质。柱子不用时柱内不要留有缓冲液，因为该缓冲液内含还原剂。

2.由于需要保持较高粘度，所以在室温下使用。

3.通常螯合剂需谨慎使用（即仅在样品中而非缓冲液中使用）。任何金属离子的剥离可通过在离心/过滤样品前添加少量过量的MgCl2来抵消。

推荐使用的缓冲液

自然条件下

结合/洗涤液（含10 mmol/L 咪唑）：BSP030-3

洗脱液（含250 mmol/L 咪唑）：BSP030-4

变性条件下

结合/洗涤液：20 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L 尿素，500 mmol/L NaCl，5 mmol/L 咪唑，pH 8.0

洗脱液20 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L 尿素，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH 8.0

注意：样品和缓冲液中适当浓度的咪唑对获得最大的纯化是必需的，而且产量因蛋白而不尽相同。自然条件下，20-40 mmol/L 的咪唑的几盒缓冲液对许多蛋白已经足够。洗脱液中500 mmol/L 咪唑绝大多数情况下完全可洗下目的蛋白。

样品准备

自然条件下由大肠杆菌表达的含多聚组氨酸标签蛋白样品的准备（主要以可溶模式表达）。

1. 对于大肠杆菌表达的蛋白。稀释细胞团：家5-10毫升结合缓冲液稀释细胞团。样品和结合缓冲液需含同样浓度的咪唑以防止宿主细胞的蛋白与暴露的组氨酸结合。同时出去大颗粒和高浓度的试剂。例如，EDTA，组氨酸和柠檬酸，这些可破坏NI-IDA的树脂。

2. 酶法裂解：0.2 mg/ml 溶菌酶，20 µg/ml MgCl2（终浓度为1 mmol/L）, 1 mmol/L PMSF （苯甲磺酰氟）或其他蛋白抑制剂。这些抑制剂不能影响树脂的稳定性。然后4℃搅拌，30

min。

3. 机械裂解：超声，同质化，重复冻结/解冻，或其他类似技术。

4. 调整裂解液pH 至7.4：不要用强酸或强碱调pH （沉淀风险）

5. 离心裂解液，转移至管中室温下12000 rpm×20 min，或4℃下离心（根据蛋白灵敏度）。

6. 收集上清并进行纯化或/和手机包涵体沉淀以作进一步处理。

7. 对于通过酵母，昆虫或哺乳动物表达系统分泌到培养基的蛋白。若有大量上清，用硫酸铵沉淀收集蛋白，用1×PBS透析，然后装到柱中。如果上清不含那些会影响镍柱，例如EDTA，组氨酸等，则可直接使用柱子。对于细胞质中表达的蛋白，请使用其他商业试剂或试剂盒(such as BSP020 Insect Cell Protein Lysis Buffer, BSP022, Animal Cells Protein Lysis Buffer, BSP026 Yeast protein Lysis Buffer ) 或参考相关文献，然后通过将蛋白提取物和5倍体积结合/洗涤液混匀来准备样品。其他比例也可使用，但需要试验验证。

注意：你可将非澄清样品转至柱内（即省略上述步骤5），。如果是这样，延长机械裂解，例如超声10 min。总纯化时间将因非澄清样的较高粘度而增加。

变性条件下，聚组氨酸标签蛋白质样品的准备（主要在包涵体内表达）

1. 用1×PBS 重悬细胞沉淀（约5 mL/mL沉淀）。且按上述方法超声破碎细胞。

2. 离心裂解液收集包涵体，12000 rpm×10 min。如果有必要则用1×PBS洗几次包涵体。

3. 再结合/洗涤缓冲液中溶解包涵体（约5 mL/mL沉淀），并室温下孵育30-60 min，同质化或超声可助于充分溶解沉淀。

4. 12000 rpm×30 min以除去剩余不溶性物质，小心转移上清至干净管而不打散沉淀。

组氨酸标签重力纯化过程

每1 mL能处理的样品体积是10 mL。如果样品体积大于柱子的体积，则进行多次步骤知道所有样品流过柱子。小心不能超过柱子所能结合的能力。

1. 平衡柱到工作温度。在室温或4℃下完成纯化。