双水相萃取
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《双水相萃取技术》课件
影响因素
03
双水相萃取技术的实验操作
实验准备
01
02
03
实验材料
准备双水相萃取所需的试 剂和材料，如蛋白质溶液 、双水相体系、离心管等 。
实验设备
确保实验所需的设备齐全 ，如离心机、天平、量筒 等。
安全措施
确保实验环境安全，穿戴 适当的实验服和护目镜， 避免试剂溅出。
实验步骤
加入蛋白质溶液
将待分离的蛋白质溶液加入离 心管中。
应用范围广泛
该技术在生物、医药、环保等领域有 广泛应用，可用于蛋白质、酶、细胞 等的分离和纯化。
操作简便高效
双水相萃取技术操作简单，分离速度 快，可实现大规模生产。
环境友好
该技术使用无毒或低毒性的物质，对 环境友好，符合绿色化学的发展趋势 。
技术展望
深入研究机理
进一步深入研究双水相萃取技术的机理，提高分 离效率和选择性。
蛋白质回收率测定
测定蛋白质的回收率，评估双水相萃取技术的效 果。
3
数据分析
对实验数据进行统计分析，了解双水相萃取技术 的分离效果和影响因素。
04
双水相萃取技术的优缺点
技术优势
高分离效率
双水相萃取技术能够实现高效率的分离过程，对于一些难以分离 的物质，如蛋白质、酶等，能够实现快速、准确的分离。
低成本
收集上清液
将上清液收集到适当的容器中 ，以便后续分析。
配制双水相体系
按照所需的浓度配制双水相体 系，确保比例准确。
离心分离
将离心管放入离心机中，设定 适当的转速和时间进行离心分 离。
清洗沉淀
清洗离心管中的沉淀，确保蛋 白质的纯度和回收率。
实验结果分析
1 2
03
双水相萃取技术的实验操作
实验准备
01
02
03
实验材料
准备双水相萃取所需的试 剂和材料，如蛋白质溶液 、双水相体系、离心管等 。
实验设备
确保实验所需的设备齐全 ，如离心机、天平、量筒 等。
安全措施
确保实验环境安全，穿戴 适当的实验服和护目镜， 避免试剂溅出。
实验步骤
加入蛋白质溶液
将待分离的蛋白质溶液加入离 心管中。
应用范围广泛
该技术在生物、医药、环保等领域有 广泛应用，可用于蛋白质、酶、细胞 等的分离和纯化。
操作简便高效
双水相萃取技术操作简单，分离速度 快，可实现大规模生产。
环境友好
该技术使用无毒或低毒性的物质，对 环境友好，符合绿色化学的发展趋势 。
技术展望
深入研究机理
进一步深入研究双水相萃取技术的机理，提高分 离效率和选择性。
蛋白质回收率测定
测定蛋白质的回收率，评估双水相萃取技术的效 果。
3
数据分析
对实验数据进行统计分析，了解双水相萃取技术 的分离效果和影响因素。
04
双水相萃取技术的优缺点
技术优势
高分离效率
双水相萃取技术能够实现高效率的分离过程，对于一些难以分离 的物质，如蛋白质、酶等，能够实现快速、准确的分离。
低成本
收集上清液
将上清液收集到适当的容器中 ，以便后续分析。
配制双水相体系
按照所需的浓度配制双水相体 系，确保比例准确。
离心分离
将离心管放入离心机中，设定 适当的转速和时间进行离心分 离。
清洗沉淀
清洗离心管中的沉淀，确保蛋 白质的纯度和回收率。
实验结果分析
1 2
双水相萃取解析
➢ 一般采用室温操作： 成相系统聚合物PEG对蛋白质有稳定作用，常温下蛋 白质不会发生变性； 常温下溶液粘度较低， 容易相分离； 常温操作节省冷却费用。
4.双水相萃取技术的发展
（1）历史：
➢ 早在1896年，Beijerinck发现，当明胶与琼脂或明胶与 可溶性淀粉溶液相混时，得到一个混浊不透明的溶液，随 之分为两相，上相富含明胶，下相富含琼脂（或淀粉）， 这种现象被称为聚合物的不相溶性（incompatibility）； ➢ 20世纪60年代，瑞典Lund大学的Albertsson P A及同事 最先提出了双水相萃取技术； ➢ 1979年，西德的Kula M R等人首次将ATPE应用于生物产 品分离；
➢大量研究表明：生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统 间的各种相互作用，主要有静电作用、疏水作用和亲和作用等， 其分配系数可为各种相互作用之和。
ln m ln me ln mh ln ml
①静电作用：两相系统中若有带电溶质存在，会ห้องสมุดไป่ตู้大分子在两 相间的分配系数产生影响。（图5-15） Donnan Potential:当大分子或粒子带有静电荷时，在带有电荷 分配不相等时，就会在两相间产生电位差，称为道南电位。 ②疏水作用：某些大分子物质表面具有疏水区，溶质的表面疏 水性会对其在两相间的分配系数产生影响。
3.影响双水相分配的主要因素
高聚物的相对分子质量 高聚物的浓度 盐的种类和浓度 PH值 温度
（1）高聚物的相对分子质量：
➢在高聚物浓度保持不变的前提下，降低该高聚物的相对分子质 量，被分配的可溶性生物大分子如蛋白质或核酸，或颗粒如细 胞或细胞碎片和细胞器，将更多地分配于该相。
以PEG-Dextran体系为例，↓Dextran→K↓ ↓PEG→K↑（表5-4）
双水相萃取详细资料
三步两水相萃取酶的流程：
细胞匀浆液
第一步双水相萃取
+PEG +盐（或是葡聚糖）
分离机
下相 ） 细胞碎片
杂蛋白 （核酸、多糖）
上 相（PEG相
（目标产物）如prot、E +盐
第二步双水相萃取 静置分层
下 相（盐相） 核酸多糖
上 相（PEG相） 目标产物
杂蛋白
（亲水性较强）
+盐
第三步双水相萃取 静置分层
分子间作用力与熵增加相比占主导地位。
➢ 作用力为斥力：形成两个水相，两种高聚物分 别富集于上、下两相。
➢ 作用力为引力：也形成两个水相，但两种高聚 物都分配于一相，另一相几乎为溶剂。
➢ 作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形
成均相的高聚物水溶液
• 聚合物的不相容性：两种聚合物分子间存在斥力，在 达到平衡后，分成两相，两种聚合物分别进入到一相 中。
优点：1.与固定床反应器相比，不需载体，不存在多孔载体中的 扩散阻力，故反应速度快，生产能力较高；2.生物催化剂在两水 相系统中教稳定；3.两相间表面张力低，轻微搅拌即能形成高度 分散的系统，分散相液滴在10μm一下，有很大的表面积，有利于 底物和产物的传递。
PEG系统中细胞碎片分配到下相中较容易 分配在上相中的蛋白质可通过加入适量的盐（有时也可 加入适量的PEG），尽兴第二次双水相萃取，以除去多 糖和核酸，它们的亲水相较强因而容易分配在盐相中， 而蛋白质就留在了PEG相中；在第三步萃取中，应该使 蛋白质分配在盐相中（例如：调节pH），以使和主体 PEG分离。色素由于其疏水性，通常分配在上相。主体 PEG可循环使用，而盐相蛋白质则可用超滤方法去除残 余的PEG以提高产品的纯度。
双水相萃取名词解释
双水相萃取名词解释双水相萃取是一种分离和提取物质的物理化学方法，它基于物质在两种不相溶的水相中的分配差异来实现。
其中，一相为有机溶剂相，另一相为水相。
双水相萃取能够实现目标物质从混合物中的分离纯化，常用于生物化学、制药、环境监测等领域。
与传统的单相溶剂萃取相比，双水相萃取具有高选择度、高灵敏度、快速分离和减少环境污染等优点，在实际应用中具有广泛的应用前景。
双水相萃取的核心原理是不同物质在两相之间的分配差异。
混合物溶解在有机溶剂相中后，目标物质会因其在两相中的溶解度不同而分配到两相中。
根据目标物质在两相中的分配系数，可以通过调整两相的物理化学性质，例如溶剂种类、pH值和离子强度等，来控制目标物质的转移和分离。
在双水相萃取中，通常使用的有机溶剂相为水不溶性有机溶剂，例如丁醚、乙醚、正己烷等。
水相通常为含有盐或酸碱调节剂的水溶液。
混合物溶解在有机溶剂相中后，通过搅拌、超声波处理等方法，使混合物中的目标物质与两相中的溶剂发生混溶，然后静置使两相分层。
最后，可以通过分液、离心等方式分离出两相，从而得到纯净的目标物质。
双水相萃取在实际应用中，常常与其他分离和纯化技术相结合，例如薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱等，以实现更精确、高效的分离和纯化。
该技术不仅适用于分离化学品、天然产物、有机合成产物等有机化学领域，也可用于生物分子、生物体内代谢产物等在生物化学、制药等领域中的应用。
总之，双水相萃取是一种基于物质在两种不相溶的溶剂相中分配差异来实现目标物质的分离和纯化的物理化学方法。
它具有许多优点，广泛应用于化学、生物化学、制药和环境监测等领域，并与其他分离和纯化技术相结合，促进了科学研究和工业生产的发展。
蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术
蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术双水相萃取是一项蛋白分离和蛋白纯化技术，是利用物质在两相间的选择分配差异而进行分离提纯的，目前已经被广泛应用与医药化学、细胞生物学、生物化工和食品工业等领域。
双水相萃取技术用于提取蛋白质等生物活性物质时，具有操作简单、体系含水量高，在萃取过程中可以保持物质的构象稳定、蛋白不易失活并获得高的萃取率的特点。
1、双水相萃取技术可分离和纯化蛋白双水相萃取技术可以用于蛋白分离和蛋白纯化，包含在一些蛋白分离公司提供的服务。
早期，如在20世纪60年代，有研究者全面进行了生物大分子在双水相系统中的分配行为的研究，得到了蛋白质、酶、核酸、病毒、抗体抗原复合物以及细胞等的分配数据。
双水相系统具有温和的操作条件，对于在极性条件下易造成变性失活的蛋白质和酶的提取中表现出了很大的优势。
双水相萃取法进行蛋白分离和蛋白纯化的原理是：聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间由于分子空间阻碍作用形成了双水相。
当待分离物质进入体系后，由于各组分表面性质、电荷作用和各种力的作用和溶液环境的影响，使其在上、下相中的分配系数不同，通过调节体系参数使被分离物质在两相间选择性分配，从而实现目标组分的分离纯化。
双水相萃取技术进行蛋白分离和蛋白纯化具有以下优点：（1）易于放大，各种参数可以按照比例放大而不降低产物收率[1]；（2）双水相系统传质和平衡过程速度快，回收效率高、能耗较小；（3）易于进行连续化操作、设备简单，且可以直接与后续提纯工序相连接，无需进行特殊处理；（4）相分离条件温和，双水相体系的张力很小，有利于保持生物分子的活性，可以直接用在发酵液中；（5）影响双水相体系的因素比较复杂，可调参数多，便于改变操作条件提高纯化效果。
美迪西提供蛋白质分离纯化技术服务，可以根据客户要求，提供从小试到规模生产全程的蛋白分离纯化服务，并根据工艺的要求结合产品特点给客户定制适用的工艺和系统。
2、双水相萃取技术分离和纯化物质的研究α-淀粉酶是一类用途十分广泛的酶，在粮食、食品加工，以及医药行业等都经常使用，由于α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶，周内外很多课题组对它进行了研究。
双水相萃取全解
1、双水相体系的组成
双水相体系的主要成因——聚合物的 不相溶性
双水相现象是当两种聚合物或一种聚 合物与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合 物之间或聚合物与盐之间的分子空间阻碍 作用，无法相互渗透，当聚合物或无机盐 浓度达到一定值时，就会分成不互溶的两 相，因为使用的溶剂是水，所以称为双水 相。
① 聚合物∕聚合物双水相
影响双水相萃取平衡的主要因素有： 组成双水相体系的高聚物类型、高聚物 的平均分子量和分子量分布、高聚物的 浓度、成相盐和非成相盐的种类、盐的 离子浓度、pH值、温度等。
1）聚合物的类型
不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水 性，聚合物的疏水性按下列次序递增：葡萄 糖硫酸盐糖＜葡萄糖＜羟丙基葡聚糖＜甲基 纤维素＜聚乙二醇＜聚丙三醇，这种疏水性 的差异对目的产物的作用是重要的。
双水相萃取全解
主要内容：
一、双水相萃取的基本理论 二、双水相萃取工艺流程操作 三、影响双水相的因素 四、双水相萃取的应用 五、双水相萃取技术的发展
前言
• 双水相萃取现象最早是1896年由Bei jerinck 在琼脂与可溶性淀粉或明胶混合时发现的， 这种现象被称为聚合物的“不相溶性” (incompatibility)。
但一般来说，当双水相系统离双节线足够远 时，温度的影响很小，1-2度的温度改变不影 响目标产物的萃取分离。
大规模双水相萃取操作一般在室温下进行， 不需冷却。这是基于以下原因：
(l)常温下，溶液的粘度较低，容易分相 (2)成相聚合物PEG对某些具有生物活性溶质 如蛋白质有稳定的作用，常温下蛋白质一般不 会发生失活、变性。 (3)常温操作节省冷却费用。
6）无机盐的浓度
盐的正、负离子在两相间分配系数不 同，两相间形成电位差，从而影响带电 生物大分子的分配。无机盐浓度的不同 能改变两相间的电位差。
双水相萃取
如下图中， 如下图中，
2.2％的葡聚糖水溶液
0.72％甲基纤维素钠的水 ％ 溶液 葡聚糖与甲基纤维素钠的双水相体系
{
发现, 早在1896年,Beijerinck发现 当明胶与琼 年 发现 脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时,得到一个 混浊不透明的溶液，随之分为两相,上相富含 明胶,下相富含琼脂(或淀粉), 这种现象被称 聚合物的不相溶性（ 为聚合物的不相溶性（incompatibility） 聚合物的不相溶性 ） 从而产生了双水相体系(Aqueous two phase 双水相体系(Aqueous 双水相体系 ATPS)。 system, ATPS)。
当两种高聚物水溶液相互混合时， 当两种高聚物水溶液相互混合时， 它们之间的相互作用分为三类： 它们之间的相互作用分为三类： 互不相溶(imcompatibiliy) 互不相溶 复合凝聚(complex coacervation) 完全互溶(complete miscibility)
2.2 双水相体系的组成
pH影响蛋白质中可离解基团的离解度，而改变蛋 影响蛋白质中可离解基团的离解度，而改变蛋
白质所带电荷和分配系数。
离子环境也有影响。
5.3 疏水反应的影响 疏水反应的影响
消除电化学效应后， 消除电化学效应后，粒子表面的疏 水性占主要地位。 水性占主要地位。如被分配的蛋白 质具有疏水性的表面，则其分配 可以改变。 系数可以改变。
(4)分相时间短，自然分相时间一般 5min～15min； 为5min～15min； (5)界面张力小(10-7～ 10-4mN／m)， (1010-4mN／m)， 有助于两相之间的质量传递； 有助于两相之间的质量传递； 不存在有机溶剂残留问题， (6)不存在有机溶剂残留问题，高 聚物一般是不挥发物质， 聚物一般是不挥发物质，对人体 无害； 无害；
2.2％的葡聚糖水溶液
0.72％甲基纤维素钠的水 ％ 溶液 葡聚糖与甲基纤维素钠的双水相体系
{
发现, 早在1896年,Beijerinck发现 当明胶与琼 年 发现 脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时,得到一个 混浊不透明的溶液，随之分为两相,上相富含 明胶,下相富含琼脂(或淀粉), 这种现象被称 聚合物的不相溶性（ 为聚合物的不相溶性（incompatibility） 聚合物的不相溶性 ） 从而产生了双水相体系(Aqueous two phase 双水相体系(Aqueous 双水相体系 ATPS)。 system, ATPS)。
当两种高聚物水溶液相互混合时， 当两种高聚物水溶液相互混合时， 它们之间的相互作用分为三类： 它们之间的相互作用分为三类： 互不相溶(imcompatibiliy) 互不相溶 复合凝聚(complex coacervation) 完全互溶(complete miscibility)
2.2 双水相体系的组成
pH影响蛋白质中可离解基团的离解度，而改变蛋 影响蛋白质中可离解基团的离解度，而改变蛋
白质所带电荷和分配系数。
离子环境也有影响。
5.3 疏水反应的影响 疏水反应的影响
消除电化学效应后， 消除电化学效应后，粒子表面的疏 水性占主要地位。 水性占主要地位。如被分配的蛋白 质具有疏水性的表面，则其分配 可以改变。 系数可以改变。
(4)分相时间短，自然分相时间一般 5min～15min； 为5min～15min； (5)界面张力小(10-7～ 10-4mN／m)， (1010-4mN／m)， 有助于两相之间的质量传递； 有助于两相之间的质量传递； 不存在有机溶剂残留问题， (6)不存在有机溶剂残留问题，高 聚物一般是不挥发物质， 聚物一般是不挥发物质，对人体 无害； 无害；
第五章 双水相萃取
• 盐离子 • pH值 • 温度
五、双水相萃取工艺流程
六、双水相萃取应用
1）蛋白酶的提取、纯化 2）核酸的提取、纯化 3）细胞调节生长因子的提取：β—干扰素、EPO等 4）病毒的提取、纯化 5）生物活性物质的分析检测
七、双水相萃取的研究进展
1. 2. 廉价双水相体系的研究开发 双水相萃取与其它分离技术的结合
5.Βιβλιοθήκη 6.第五章 双水相萃取
（Aqueous Two-phase Extraction）
一、概述
1、定义——利用生物物质在
互不相溶的两水相间分配系数的 差异进行分离的过程
PEG——聚乙二醇 Dextran(DEX)——葡聚糖
图1 PEG/DEX形成的双水相的组成
2、双水相体系
1) 双水相体系的形成——高聚物分子间的作用力
思考题
1. 2. 3. 4. 何谓双水相萃取？ 双水相体系可分为那几类？目前常用的体系有那两 种？ 为什么说双水相萃取适用于生物活性大分子物质分 离？ 影响双水相萃取的因素有那些？当电解质存在，pH 是如何影响双水相萃取的？ 用双水相萃取细胞破碎（匀浆）液时，一般是把目 标产物分布在上相，而细胞碎片、杂蛋白等杂质分 布在下相，为什么？ 何谓双水相亲和萃取？
• 作用力为斥力：形成双水相体系 • 作用力为引力：形成两相，其中一相为两高聚物相，一相 为水相 • 作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形成均一相
2)双水相体系的种类
–
–
两种都是非离子型高聚物（PEG / DEX、聚丙二醇/ DEX等）
其中一种是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/葡聚糖DEX）
–
–
两种都是离子型高聚物（羧甲基纤维素/羧甲基葡聚糖钠）
双水相萃取
各种双水相系统
聚合物1 聚合物1 聚丙二醇 聚合物2 聚合物2或盐 甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇， 甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇， 聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖， 聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖，葡聚 糖 聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖 聚乙烯醇，葡聚糖， 羟甲基葡聚糖，葡聚糖 羟甲基葡聚糖， 葡聚糖 葡聚糖 葡聚糖 硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠，酒 硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠， 石酸钾钠， 石酸钾钠，磷酸钾
4、电化学分配 、 i、盐的种类及浓度 、
pH 升高, H2PO4- HPO42- PO43在PEG / K2HPO4 系统使带负电蛋白 蛋白有较高的K。 蛋白
ii、 pH 值的影响 改变两相的电位差 如体系pH 值与蛋白质的等电点相差越大， 则蛋白质在两相中分配越不均匀。 pH 值的变化也会导致组成体系的物质电 性发生变化，也会使被分离物质的电荷发 生改变，从而影响分配的进行。
6、双水相萃取的工艺流程 、 工艺流程主要由三部分构成：目的产物的萃取; 工艺流程主要由三部分构成：目的产物的萃取 PEG的循 的循 无机盐的循环。 环; 无机盐的循环。
一、目的产物的萃取： 目的产物的萃取： 第一步，匀浆液与PEG和无机盐在萃取器中混合，然后进 和无机盐在萃取器中混合， 第一步，匀浆液与 和无机盐在萃取器中混合 入分离器分相。一般使目标蛋白质分配到上相（ 入分离器分相。一般使目标蛋白质分配到上相（PEG相）， 相 而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相（ 而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相（富盐 相） 。 第二步，在上相中加盐，形成新的双水相体系， 第二步，在上相中加盐，形成新的双水相体系，将目标蛋白 质转入富盐相，从而将蛋白质与PEG分离，以利于使用超 分离， 质转入富盐相，从而将蛋白质与 分离 滤或透析将PEG回收利用。 回收利用。 滤或透析将 回收利用 的回收循环： 二、PEG的回收循环： 的回收循环 加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收PEG; ①加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收 相通过离子交换树脂， ②将PEG相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去 相通过离子交换树脂 用洗脱剂先洗去PEG，再 ， 洗出蛋白质。 洗出蛋白质。 无机盐的循环： 三、无机盐的循环： 冷却，结晶，以离心机分离收集。除此之外还有电渗析法、 冷却，结晶，以离心机分离收集。除此之外还有电渗析法、 膜分离法回收盐类或除去PEG相的盐。 相的盐。 膜分离法回收盐类或除去 相的盐
双水相萃取技术
新型功能双水相系统
温度敏感型双水 相体系
聚合物浓度的影响
聚合物分相的最低浓度为临界点，系线的 长度为零，此时分配系数为1，即组分均 匀的分配于上下相. 随着成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合 物的总浓度增大，系统远离临界点，系线 长度增加，两相性质的差别(疏水性等)增 大，蛋白质分子的分配系数将偏离临界点 处的值(K=1)，即大于1或小于1。因此,成 相物质的总浓度越高，系线越长，蛋白质 越容易分配于其中的某一相。
盐的种类影响
在双聚合物系统中，无机离子具有各自的分配系数， 不同电解质的正负离子的分配系数不同，从而产生不 同的相间电位。由于各相要保持电中性，使得带电生 物大分子，如蛋白质和核酸等分别向两相移动分配。
盐浓度的影响
盐的浓度不仅影响蛋白质的表面疏水性，而且扰 乱双水相系统，改变各相中成相物质的组成和相 体积比。 例如，PEG/磷酸盐体系中上下相的PEG和磷酸 盐浓度及Cl-在上下相中的分配平衡随添加NaCl 浓度的增大而改变，这种相组成即相性质的改变 直接影响蛋白质的分配系数，如图。 离子强度对不同蛋白质的影响程度不同，利用这 一特点，通过调节双水相系统的盐浓度，可有效 地萃取分离不同的蛋白质。
lnK=lnK0+lnKe+lnKh+lnKb+lnKs+lnKc
式中，下标e、h、b、s、c分别表示静电作用、疏水作用、生 物专一性、分子大小、形态结构对分配系数的贡献。lnK0是 包括其他因素（盐的水合作用、配体相互作用）在内的分配 系数。
静电作用
非电解质型溶质的分配系数不受静电作用的影 响，利用相平衡热力学理论可推导下述分配系数表 达式： lnK=Mλ/RT M-溶质的相对分子质量；λ-与溶质表面性质和 成相系统有关的常数;R-玻尔兹曼常数；T-绝对温度。 生物大分子物质的M值一般很大，λ的微小变化 会引起分配系数很大的变化。因此利用不同的表面 性质，可以达到快速分离非电介质型的大分子溶质 的目的。
双水相萃取
萃取温度
• 在临界点附近尤为明显。但当远离临 界点时，温度影响较小。 • 大规模生产常在常温操作，但较高升 温还是有利于降低体系黏度，利于分 相。
无机盐浓度
• 盐的正、负离子在两相间分配系数不同， 两相间形成电位差，从而影响带电生物大 分子的分配。无机盐浓度的不同能改变两 相间的电位差。
双水相萃取法在天然产物纯化中的 应用
双水相的种类
常见的能形成双水相体系的高聚物有聚乙二醇 (PEG)、聚丙二醇、甲基聚乙二醇、聚乙烯醇、聚 乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乙基羟乙基纤维素 、葡聚糖、聚丙基葡聚糖、羟丙基葡聚糖、聚蔗 糖, 无机盐有硫酸钾、硫酸铵、草酸钠、磷酸钾等 。
双水相萃取特点
① 两相的溶剂都是水 ,上相和下相的含水量 高达70%～90% ,不存在有机溶剂残留问 题 。 ② 常温常压操作 ,不会引起生物活性物质失 活或变性。 ③ 两相界面张力小,萃取时两相能够高度分 散 ,传质速度快。 ④ 溶剂对目标组分选择性强,大量杂质能与 所有固体物质一同除去 ,使分离过程简 化 ,易于工业放大和连续操作。
1.2 新型双水相萃取系统
传统双水相系统主要使用黏稠的水溶性高聚 物,后处理比较烦琐,目前乙醇、丙酮等与水互溶 的有机溶剂也被引入到双水相系统中。乙醇、丙 酮等有机溶剂具有价廉、低毒、易挥发、易回收 等特点,与高分子聚合物相比有较强的工业化优 势。采用传统工艺对中药成分进行提取和纯化存 在收率和纯度较低、工艺复杂、多种有机溶剂残 留等问题,因此利用温和的双水相系统对中草药 有效成分的提取进行研究是很有意义的工作。
双水相萃取的原理
双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一 种盐溶于同一溶剂时, 由于聚合物之间或聚合物 与盐之间的分子空间阻碍作用 ,无法相互渗透 , 当聚合物或无机盐浓度达到一定值时,就会分成不 互溶的两相 ,因为使用的溶剂是水 ,所以称为双 水相。 当物质进入双水相体系后 ,由于表面性质、电 荷作用和各种力 如憎水键、氢键和离子键等 的 作用和溶液环境的影响,使其在上、下相中的浓度 不同,即各成分在两相间的选择性分配 的纯化
双水相萃取
操作步骤
一、重点 双水相萃取放大容易：一般10ml离心管的实验结果可直接放大到工业规模。具体实验步骤： 1、配制一系列不同浓度、pH及离子强度的双水相，每个双水相改变一个参数。 2、加入料液，再加水使整个系统质量达到5~10g。离心管封口后充分混合。 3、1800－2000g下离心3－5min，使两相完全分离。 4、用吸管或移液管将上相和下相分别吸出，测定上、下相中目标产物的浓度或生物活性，计算分配系数。 5、上、下两相中目标产物的总量应与加入量对比，以检验是否存在沉淀或界面吸附现象，并可确认浓度或活 性测定中产生的系统误差。 6、分析目标产物的收率和纯化倍数，确定最佳双水相系统。 二、特点： 1、含水量高（70%～90%），适宜提取水溶性的蛋白质、酶等生物活性物质，且不易引起蛋白质的变性失活。 2、不存在有机溶剂残留问题。3、易于放大，各种参数可按比例放大而产物收率并不降低。
可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）,聚丙二醇/聚乙二醇，甲基纤维素/ 葡聚糖。双水相萃取中采用的双聚合物系统是PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。另外，聚合物与 无机盐的混合溶液也可以形成双水相，例如，PEG/磷酸钾（KPi）、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于双水相萃 取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG,下相富含无机盐。
原理
某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可以形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成 双水相系统（aqueous two-phase system,ATPS）。利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质， Albertsson于20世纪50年代后期开发了双水相萃取法（aqueous two-phase extraction），又称双水相分配法。 20世纪70年代,科学家又发展了双水相萃取在生物分离过程中的应用，为蛋白质特别是胞内蛋白质的分离和纯化 开辟了新的途径。
双水相萃取法
非电解质型溶质的分配系数不受静电作用的影响，利用相平衡 热力学理论可推导下述分配系数表达式：
lnm=-Mλ/RT
m-分配系数；M-溶质的相对分子质量；λ-与溶质表面性质和 成相系统有关的常数; R-气体常数，J/(mo1．K)；T-绝对温度， K。
因此，溶质的分配系数的对数与相对分子质量之 间呈线性关系，在同一个双水相系统中，若λ>0，不 同溶质的分配系数随相对分子质量的增大而减小。同 一溶质的分配系数随双水相系统的不同而改变，这是 因为式中的λ随双水相系统而异。
图a和b分别为PEG/Dx和PEG/KPi系统的典型相图 a
系线 两相区 双节线 双节线
b
两相区 系线
均相区
均相区
均相区
临界点
在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而 体积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即
上下相组成分别为T和B,
系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长， 两相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时， 即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中的 分配系数均为1，因此K点称为临界点(critical point)。
在生物分子回收和纯化以后，怎样从含有目标产物残余物的 水溶液中回收聚合物或盐就成为一个重要的问题。例如从 1000kg面包酵母中萃取反丁烯二酸酶需要用680kgPEG-1550和 533kgK3PO4，若不回收利用，化学品的消耗会使生产成本大幅 度上升。如果产品是蛋白质，并且分配在盐相，则盐可以在 错流过程操作方法下，用超滤或渗析膜过滤回收。如果蛋白 质积聚在聚乙二酵中，可以通过加入盐来精制，加入的盐导 致蛋白质在盐相中重新分配。PEG的分离同样可以用膜分离来 实现，即用选择性孔径大小的半透膜来截留蛋白质，同时排 除PEG进行回收。 另一种力法是通过盐析或使用水-可混溶性 的溶剂来沉淀蛋白质，但是固体(产物)的去除被存在的PEG阻 碍。也可使用离子交换和吸附，它们是通过蛋白质与基质的 选择性相互作用进行的。然而，当黏性聚合物溶液通过柱被 处理的时候，会出现高的压力降。在上述的三种方法中，膜 分离是分离和浓缩被纯化的蛋白质并同步去除聚合物的最佳 方法。
lnm=-Mλ/RT
m-分配系数；M-溶质的相对分子质量；λ-与溶质表面性质和 成相系统有关的常数; R-气体常数，J/(mo1．K)；T-绝对温度， K。
因此，溶质的分配系数的对数与相对分子质量之 间呈线性关系，在同一个双水相系统中，若λ>0，不 同溶质的分配系数随相对分子质量的增大而减小。同 一溶质的分配系数随双水相系统的不同而改变，这是 因为式中的λ随双水相系统而异。
图a和b分别为PEG/Dx和PEG/KPi系统的典型相图 a
系线 两相区 双节线 双节线
b
两相区 系线
均相区
均相区
均相区
临界点
在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而 体积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即
上下相组成分别为T和B,
系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长， 两相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时， 即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中的 分配系数均为1，因此K点称为临界点(critical point)。
在生物分子回收和纯化以后，怎样从含有目标产物残余物的 水溶液中回收聚合物或盐就成为一个重要的问题。例如从 1000kg面包酵母中萃取反丁烯二酸酶需要用680kgPEG-1550和 533kgK3PO4，若不回收利用，化学品的消耗会使生产成本大幅 度上升。如果产品是蛋白质，并且分配在盐相，则盐可以在 错流过程操作方法下，用超滤或渗析膜过滤回收。如果蛋白 质积聚在聚乙二酵中，可以通过加入盐来精制，加入的盐导 致蛋白质在盐相中重新分配。PEG的分离同样可以用膜分离来 实现，即用选择性孔径大小的半透膜来截留蛋白质，同时排 除PEG进行回收。 另一种力法是通过盐析或使用水-可混溶性 的溶剂来沉淀蛋白质，但是固体(产物)的去除被存在的PEG阻 碍。也可使用离子交换和吸附，它们是通过蛋白质与基质的 选择性相互作用进行的。然而，当黏性聚合物溶液通过柱被 处理的时候，会出现高的压力降。在上述的三种方法中，膜 分离是分离和浓缩被纯化的蛋白质并同步去除聚合物的最佳 方法。
双水相萃取专业知识
两相物性旳差别，使双水相萃取具有本身旳特征。
特征：
操作条件温和 表面张力大大低于有机溶剂相与水相间旳表面张力； 两相分散旳耗能低，分散程度高，传质面积大，传质速率快； 在温和旳萃取条件下，到达较高旳萃取效率。
安全性能高 药物生产，双水相萃取质量和安全性好； 高聚物一般为不易挥发物质，操作环境对人体无害。
这种易于放大旳优点对于新药研制 中生产工艺旳开发极为有利
双水相萃取技术旳进展
用变性淀粉PPT替代昂贵旳Dextran。PPT-PEG体系 已被用于从发酵液中分离过氧化氢、β-半乳糖甘 酶等。PPT-PEG体系比PEG-盐体系稳定，和PEGDextran体系相图非常相同，并具有下列优点：
伴随生物技术旳发展,必将增进双水 相萃取体系旳完善,从而更显示出双水 相体系萃取分离技术在生物物质分离 中旳独特优点.
在双水相系统中旳被分离物传质速度快，因而到达 分配旳时间短，但因两相密度相差小，分配困难， 是其主要矛盾。
利用离心沉淀可加紧相分离速度
体系旳选择和优化
1）、体系选择旳原则： 根据目旳pro和共存杂质旳HFS\M\pI\Z等旳差别, 综合利用静电、 疏水和添加合适种类和浓度旳盐，可选择性萃取目旳产物。
双水相旳类型： 离子型高聚物－非离子型高聚物 PEG－DEXTRAN 高聚物－相对低分子量化合物 PEG－硫酸铵
当两种高聚物水溶液混合物混合后旳总构成点 落在两相区（如：点M）可形成互不相溶旳两 相T和B。两相旳构成和密度均不同。一般，T 相为上层，高聚物PEG含量较高；B相为下层， 高聚物KPI含量较高。
双水萃相取旳理论基础
表面电荷
当盐旳正、负离子对上下相有不同旳亲和力，即 正负离子旳分配系数不同步，就会产生电位。
双水相萃取
（2）双水相体系形成的原因：
聚合物的不相溶性（空间位阻）
聚合物的不相溶性：各个聚合物分子，都倾向于在其
周围有形状、大小和极性相同的分子，同时，由于不同
类型分子间的斥力大于同它们的亲水性有关的相互吸引 力，因此聚合物发生分离，形成两个不同的相。
对于某些聚合物溶液与一些无机盐溶液相混时，只要
浓度达到一定范围时，体系形成双水相的机理尚不清楚。
这种影响与蛋白质相对分子质量也存在关系，相对分子质量越
大，影响也随之增大。
（2）高聚物的浓度：
成相物质的总浓度越高，蛋白质越容易分配于其中的某一相；
而对于细胞等颗粒来说，在临界点附近细胞大多分配于其中的
某一相。
（3）盐的种类和浓度：
盐的种类和浓度对分配系数的影响，主要反映在相间电位和
蛋白质的疏水性差异上，这是由于当双水相系统中存在这些
加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收 PEG；B)将 PEG
相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去 PEG，再洗出蛋 白质。 无机盐的循环：将含无机盐相冷却，结晶，然后用离 心机分离收集。除此之外还可用电渗析法、膜分离法回
收盐类或除去 PEG相的盐。
（3）双水相萃取在药物分离中的应用
①细胞匀浆液中 蛋白质的纯化
液膜萃取
反胶团萃取
内容提纲：
1.双水相体系 2.双水相萃取的基本原理 3.影响双水相分配的主要因素
4.双水相萃取技术的发展
5.双水相萃取操作及应用
1.双水相体系
（1）双水相系统：一定浓度的两种水溶性高聚物或一
种高聚物与盐类在水中能形成两层互不相溶的匀相水溶液， 这样的水相系统称为双水相系统。
5%PEG6000 上层组成：2%Dextran500 93%水 3%PEG6000 下层组成：7%Dextran500 90%水
双水相萃取
16
双水相系统的分类
按照物质在双水相系统的分配作用类型，可分为空 间排阻分配、电化学分配、构型相关性分配、亲和分配、 疏水分配和手性分配等类型。
分配类型 空间排阻分配 电化学分配 构型相关性 分配 亲和分配 典型相系统 PEG/EDX PEG/盐 影响因素 相系统因素 聚合物分子大小 相界面静电位 聚合物分子空间 构型 配基亲和性能 主要可调因素 溶质性质 表面积 表面电荷 空间构型 特异的亲和位 点 表面疏水性 聚合物分子量、浓度 pH、盐种类、聚合物 电荷性质 聚合物分子量、浓度、 pH、温度 配基种类、浓度、pH
10
选择双水相的原则
• 能够获得高的产物回收和生物活性回收， 高的分离纯化倍数； • 系统的物理化学性质有利于大规模的应 用，有良好的工艺性能，系统黏度低， 相分离快，达到相平衡时间短，工艺参 数容易控制，工艺条件可调性范围大； • 系统经济，成本低，无毒，适合大规模 应用。
11
双水相系统相图
PEG (%)
离子分配萃取
利用共价键将离子交换基团如 -NH2，-COOH， -PO43-， -SO42-结合在成相水溶性聚合物上，构成双 水相系统，与酶蛋白分子的相互作用进行分配的双 水相萃取，其分配行为在很大程度上与蛋白质的表 面电荷性质有关，也受到系统的各种因素，如pH、 盐浓度和种类、温度等条件的影响。由于这一类功 能团配基与酶的相互作用的选择性并不很高，萃取 效率和纯化倍数虽然比一般双水相萃取系统高，但 低于其他亲和萃取系统。 例如利用PEG-磷酸酯/磷酸盐系统进行β-干扰素 的提取，分配系数可达到630，杂蛋白几乎完全分配 在下相。 20
相图的双节点线的位置和形状与相系统组成及相系统组分的物理化 学性质有关，如聚合物的分子量和分子形状。在PEG/葡聚糖系统，如 果PEG分子量不变，增加葡聚糖的分子量，相分离所需的葡聚糖浓度 越低；两种聚合物分子量相差越大，双节点线的形状越不对称。 15 在PEG/盐系统中，PEG分子量越大，双节点线也越陡立。
双水相系统的分类
按照物质在双水相系统的分配作用类型，可分为空 间排阻分配、电化学分配、构型相关性分配、亲和分配、 疏水分配和手性分配等类型。
分配类型 空间排阻分配 电化学分配 构型相关性 分配 亲和分配 典型相系统 PEG/EDX PEG/盐 影响因素 相系统因素 聚合物分子大小 相界面静电位 聚合物分子空间 构型 配基亲和性能 主要可调因素 溶质性质 表面积 表面电荷 空间构型 特异的亲和位 点 表面疏水性 聚合物分子量、浓度 pH、盐种类、聚合物 电荷性质 聚合物分子量、浓度、 pH、温度 配基种类、浓度、pH
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选择双水相的原则
• 能够获得高的产物回收和生物活性回收， 高的分离纯化倍数； • 系统的物理化学性质有利于大规模的应 用，有良好的工艺性能，系统黏度低， 相分离快，达到相平衡时间短，工艺参 数容易控制，工艺条件可调性范围大； • 系统经济，成本低，无毒，适合大规模 应用。
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双水相系统相图
PEG (%)
离子分配萃取
利用共价键将离子交换基团如 -NH2，-COOH， -PO43-， -SO42-结合在成相水溶性聚合物上，构成双 水相系统，与酶蛋白分子的相互作用进行分配的双 水相萃取，其分配行为在很大程度上与蛋白质的表 面电荷性质有关，也受到系统的各种因素，如pH、 盐浓度和种类、温度等条件的影响。由于这一类功 能团配基与酶的相互作用的选择性并不很高，萃取 效率和纯化倍数虽然比一般双水相萃取系统高，但 低于其他亲和萃取系统。 例如利用PEG-磷酸酯/磷酸盐系统进行β-干扰素 的提取，分配系数可达到630，杂蛋白几乎完全分配 在下相。 20
相图的双节点线的位置和形状与相系统组成及相系统组分的物理化 学性质有关，如聚合物的分子量和分子形状。在PEG/葡聚糖系统，如 果PEG分子量不变，增加葡聚糖的分子量，相分离所需的葡聚糖浓度 越低；两种聚合物分子量相差越大，双节点线的形状越不对称。 15 在PEG/盐系统中，PEG分子量越大，双节点线也越陡立。
第七章-双水相萃取和反胶团萃取
两相分离则比较困难, 这是由于两相密度差低 和当处理匀浆液时, 粘度较大。由于粘度较 高PE会G/引盐更起适阻合塞用重, 力可沉采降用；自PE动G/D排eX渣多的用离喷心嘴机分。 离 机。
2.两水相反应器
在两水相系统中进行转化翻译功能, 如酶促反应, 可 以把产物移入另一相中, 消除产物抑制, 因而提高了产率。 这实际上是一种反应和分离耦合的过程, 有时也称为萃 取生物转化；如果发生的是一种发酵过程, 则也称为萃 取发酵, 因而此时也可以把两水相系统称为两水相反应 器。
在另一相中；要有合适的相比。如产物分配 在上相中，则相比要大，反之则相比要小。
这些条件不可能同时满足, 分配理论也不完 善, 常需要根据试验选择最优系统和操作条件。
三、双水相萃取技术的发展
1. PEG衍生物: 在PEG上引入亲和基团或离 子基团；
2. 采用多级萃取。
反胶团萃取
发展历史
1977 年瑞典伦德大学Albertsson 首先提出 反胶团萃取分离蛋白质 20世纪80年代生物学家们开始认识到反胶团 萃取的重要性 国内自20世纪80年代起也开展了反胶团萃取白质时,用以形成反胶团的 表面活性剂起着关键作用。
现在多数研究者采用AOT(阴离子型)为表面活性 剂。AOT是琥珀酸二(2-乙基己基)酯磺酸钠 或丁二酸二异辛酯磺酸钠(Aerosol OT)。
溶剂则常用异辛烷 (2,2,4-二甲基戊烷)。
2.反胶团的形状和大小
形状: 通常为球形，也有的为椭圆形或棒形。 大小: 半径一般为10nm，取决于反胶团的含水量W0。
➢ 设备投资费用少,操作简单,不存在有机溶剂残留问 题。
一、双水相分离理论
1.双水相的形成
❖ 熵增——混合——自发 ❖ 分子间作用力------随着Mr的增加而增大
2.两水相反应器
在两水相系统中进行转化翻译功能, 如酶促反应, 可 以把产物移入另一相中, 消除产物抑制, 因而提高了产率。 这实际上是一种反应和分离耦合的过程, 有时也称为萃 取生物转化；如果发生的是一种发酵过程, 则也称为萃 取发酵, 因而此时也可以把两水相系统称为两水相反应 器。
在另一相中；要有合适的相比。如产物分配 在上相中，则相比要大，反之则相比要小。
这些条件不可能同时满足, 分配理论也不完 善, 常需要根据试验选择最优系统和操作条件。
三、双水相萃取技术的发展
1. PEG衍生物: 在PEG上引入亲和基团或离 子基团；
2. 采用多级萃取。
反胶团萃取
发展历史
1977 年瑞典伦德大学Albertsson 首先提出 反胶团萃取分离蛋白质 20世纪80年代生物学家们开始认识到反胶团 萃取的重要性 国内自20世纪80年代起也开展了反胶团萃取白质时,用以形成反胶团的 表面活性剂起着关键作用。
现在多数研究者采用AOT(阴离子型)为表面活性 剂。AOT是琥珀酸二(2-乙基己基)酯磺酸钠 或丁二酸二异辛酯磺酸钠(Aerosol OT)。
溶剂则常用异辛烷 (2,2,4-二甲基戊烷)。
2.反胶团的形状和大小
形状: 通常为球形，也有的为椭圆形或棒形。 大小: 半径一般为10nm，取决于反胶团的含水量W0。
➢ 设备投资费用少,操作简单,不存在有机溶剂残留问 题。
一、双水相分离理论
1.双水相的形成
❖ 熵增——混合——自发 ❖ 分子间作用力------随着Mr的增加而增大
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两相系统中如有盐存在，会对大分子在两相间的分配系数发生改变
（3）疏水作用
在pH值为等电点的双水相中，蛋白质主要根据表面疏水性的差异 产生各自的分配平衡。
两水相萃取-综合
❖ 双水相萃取过程的理论基础
❖
成相聚合物分子量和浓度
盐的种类和浓度
pH和温度
三、影响双水相萃取的因素
1. 聚合物及其相对的分子量
氢键 电荷力 疏水作用 范德华力 构象效应
❖ 概述
两水相萃取
常用聚合物：
聚乙二醇－葡聚糖 聚乙二醇－无机盐系统
无毒原则
4、双水相的相图
B’
双节线形状位置和聚合物的分子量关系
双水相萃取过程的理论基础
❖表面自由能的影响
K=CT/CB
❖表面电荷的影响
两水相萃取-溶质在两相间分配
❖ 双水相萃取过程的理论基础
双水相萃取的应用-条件
要成功地运用两水相萃取的方法，应满足下列条件：
①欲提取的酶和细胞碎片应分配在不同的 相中；
②酶的分配系数应足够大，使在一定的相 体积比时，经过一次萃取，就能得到高 的收率；
③两相用离心机很容易分离。
双水相萃取的操作
❖ 萃取和平衡：由于体系的表面张力很低，分 配能在几分钟内达到平衡
两水相萃取-自由能影响
❖ 双水相萃取过程的理论基础 轻微变化引起 分配系数K发生 很大变化
适合生物大分 子分离
两水相萃取-电荷影响 Donnan 效应
双水相中溶质分配理论
（2）表面电荷的影响
Ψ
U2 U1
RT (Z Z )F
ln
K
Z B
K
Z A
ln
K
* i
ln
Ki
Z iFΨ RT
要进行两水相生物转化反应应满足下列条件 ： （×） ① 催化剂应单侧分配； ② 底物应分配于催化剂所处的相中；产物应分
配在另一相中；要有合适的相比。如产物分 配在上相中，则相比要大，反之则相比要小。 这些条件不可能同时满足，分配理论也不完 善，因此常需要根据试验选择最优系统和操 作条件。
两水相萃取
青霉素酰化酶 E.coli
PEG/盐 90
2. 两水相反应器
在两水相系统中进行转化翻译功能，如酶促反 应，可以把产物移入另一相中，消除产物抑制， 因而提高了产率。这实际上是一种反应和分离 耦合的过程，有时也称为萃取生物转化；如果 发生的是一种发酵过程，则也称为萃取发酵， 因而此时也可以把两水相系统称为两水相反应 器。
PEG = 聚乙二醇(polyethylene glycol) Kpi = 磷酸钾 DX= 葡聚糖(dextran)
双水相体系形成的原因
1. 双水相体系的成因是聚合物之间的不相溶性，即 聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗透， 具有相分离倾向，一定条件下分成两相(aqueous two-phase system, ATPS) 。一般认为，只要两 种聚合物水溶液的水溶性有所差异，混合时就可 发生相分离，并且水溶性差别越大，相分离的倾 向越大。
❖
一些无机离子的分配系数
正离子 K＋ Na＋ NH4＋ Li＋
分配系数K＋ 0.824 0.889 0.92 0.996
负离子 I－ Br－ Cl－ F－
分配系数K－ 1.42 1.21 1.12 0.912
无机盐的影响
pH6.9溶菌酶带正电， 卵蛋白带负电
U2-U1>0
4. 温度的影响
❖ 一般都可在室 温下操作。而 且室温时粘度 较冷却时低， 有助于相的分 离并节约了能 源开支。
质量传递，特别适合于生物活性物质的 分离纯化 ❖ 操作简便，能耗低，聚合物可循环使用 ，成本低 ❖ 易于放大，可直接线性放大几万倍
两水相成相、分相、聚合物回收示意图
❖ 大规模双水相萃取
由于相混合能耗低，相平衡时间短，故双水 相萃取规模放大非常容易，10mL刻度离心 管的实验结果可准确放大到处理200Kg细胞 匀浆液规模。
多步萃取
细胞匀浆液中目标产物可经过多步萃取获得较高的纯 化倍数。
双水相萃取的应用举例
分离和提纯各种蛋白质(酶），特别是胞内酶的 提取和精制。
酶
菌种
相系统
η/%
天半乳糖苷酶 E.coli
PEG/盐 87
乙醇脱氢酶
Bakers yeast PEG/盐
96
2. 加入盐分，由于盐析作用，聚合物与盐类溶液也 能形成两相。
双水相萃取
❖双水相萃取是利用物质在 不相溶的两水相间分配系 数的差异进行萃取的方法
是否分层或混合成一相，取决于： ❖熵增——与分子数目有关 ❖分子间作用力——与分子大小有关
双水相萃取的原理
❖ 依据悬浮粒子与其周围物质具有的复杂的相 互作用：
水系
数 减
❖
水解程度的影响
易一 集般 中来 于说 低， 分蛋 子白 量等 相高
分 子 量 物 质
2. pH的影响
❖ pH会影响蛋白质中可离解基团的离解度，因而改 变蛋白质所带电荷和分配系数；另外，pH还影响 系统缓冲物质磷酸盐的离解程度，从而影响分配 系数。
❖ pH微小的变化有时会使蛋白质的K改变2～3个数 量级。
❖ 不同聚合物，水相系统显示不同的疏水性，水 溶液中聚合物的疏水性依下列次序递增：葡萄 糖硫酸盐＜甲基葡萄糖＜葡萄糖＜羟丙基葡聚 糖＜甲基纤维素＜聚乙烯醇＜聚乙二醇＜聚丙 三醇，这种疏水性的差别对目的产物与相的相 互作用是重要的。
❖ 同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加。
分子量的影响
❖ ❖ ❖
性小随 蛋，分 白疏子 向水量 另性增 一增大 相加， 转，分 移亲配
双水相萃取
主讲人：董冰雪
双水相萃取
生化固液分离中最困难的操作是从细胞破碎后的浆液中移走 细胞碎片，这些碎片分布很广（0.2－1μm)，包括（细胞 壁碎片、膜碎片、完整的细胞器和未破碎的细胞）。
用离心机分离不易除掉某 些絮状小碎片
膜分离速度慢，易出现污染 和蛋白质滞留。
双水相萃取是水相中加入高分子化合物形成密度不同的 两相，用于萃取蛋白质。
（×）
① 与固定床反应器相比，不需载体，不存在多 孔载体中的扩散阻力，故反应速度较快，生 产能力较高；
② 生物催化剂在两水相系统中较稳定；两相间 表面张力低，轻微搅拌即能形成高度分散系 统，分散相液滴在10μm以下，有很大的表 面积，有利于底物和产物的传递。
思考题
❖ 何谓双水相萃取?常见的双水相构成体系有哪 些？
❖ 体系pH与蛋白质等电点相差越大，蛋白质在两相 中分配越不均匀。
pH影响-血清蛋白交错分配
不同盐系 统中，等 电点分配 系数相同
3.离子环境对蛋白质在两相体系分配的影响
❖ 在PEG/Dex中，无机盐离子在两相中也有不同的分 配(见表2-2)，因此在两相间形成电位差。由于各相 要保持电中性，这对带电生物大分子，如蛋白质和 核酸等的分配，产生很大的影响。
葡聚糖与甲基纤维素钠的双水相体系
双水相萃取
(Aqueous Two Phase Extraction)
❖ 因使用的溶剂是水，因此称为双水相，在这两 相中水分都占很大比例(85％一95％)，活性蛋 白或细胞在这种环境中不会失活，但可以不同 比例分配于两相，这就克服了有机溶剂萃取中 蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂 的缺点。
➢ ➢
性性
失 蛋，许
活 。
白不多 质溶蛋
在于白
有有质
机机都
溶溶有
剂剂极
相 中
；
强 的
易亲
变水
双水相的发现
1896年Beijerinck观察到当把明胶与琼脂或把明胶和 可溶性淀粉的水溶液混合时，先得到一混浊不透明的 溶液，随后分成两相，上相含有大部分明胶，下相含 有大部分琼脂(或可溶性淀粉)。再如下图中，2.2％的 葡聚糖水溶液与等体积的0.72％甲基纤维素钠的水溶 液相混合并静置后，可得到两个粘稠的液层。
Enzymetic reaction
enzyme
enzyme
enzyme
enzyme enzyme
substrate
product
两水相萃取
❖ 双水E相n萃zy取m过et程ic的r理ea论ct基io础n with ATPS
enzyme enzyme
enzyme
采用两水相系统进行生物转化反应有下列优点：
❖ 上下相的分离：重力沉降，离心分离 ❖ 多聚物的分离：目的蛋白在PEG上相中，相
分离后，在上相中加入盐，形成新的双水相 体系，蛋白质被萃取进入盐相，PEG得到回 收
典型的双水相萃取的工艺流程
主要由三部分构成：目的产物的萃取；PEG的 循环；无机盐的循环。
双水相萃取的优点
❖ 平衡时间短：自然成相时间5-60min ❖ 含水量高、界面张力小，有助于相间的