双水相萃取
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水系
数 减
❖
水解程度的影响
易一 集般 中来 于说 低， 分蛋 子白 量等 相高
分 子 量 物 质
2. pH的影响
❖ pH会影响蛋白质中可离解基团的离解度，因而改 变蛋白质所带电荷和分配系数；另外，pH还影响 系统缓冲物质磷酸盐的离解程度，从而影响分配 系数。
❖ pH微小的变化有时会使蛋白质的K改变2～3个数 量级。
双水相萃取
主讲人：董冰雪
双水相萃取
生化固液分离中最困难的操作是从细胞破碎后的浆液中移走 细胞碎片，这些碎片分布很广（0.2－1μm)，包括（细胞 壁碎片、膜碎片、完整的细胞器和未破碎的细胞）。
用离心机分离不易除掉某 些絮状小碎片
膜分离速度慢，易出现污染 和蛋白质滞留。
双水相萃取是水相中加入高分子化合物形成密度不同的 两相，用于萃取蛋白质。
葡聚糖与甲基纤维素钠的双水相体系
双水相萃取
(Aqueous Two Phase Extraction)
❖ 因使用的溶剂是水，因此称为双水相，在这两 相中水分都占很大比例(85％一95％)，活性蛋 白或细胞在这种环境中不会失活，但可以不同 比例分配于两相，这就克服了有机溶剂萃取中 蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂 的缺点。
❖ 体系pH与蛋白质等电点相差越大，蛋白质在两相 中分配越不均匀。
pH影响-血清蛋白交错分配
不同盐系 统中，等 电点分配 系数相同
3.离子环境对蛋白质在两相体系分配的影响
❖ 在PEG/Dex中，无机盐离子在两相中也有不同的分 配(见表2-2)，因此在两相间形成电位差。由于各相 要保持电中性，这对带电生物大分子，如蛋白质和 核酸等的分配，产生很大的影响。
❖ 上下相的分离：重力沉降，离心分离 ❖ 多聚物的分离：目的蛋白在PEG上相中，相
分离后，在上相中加入盐，形成新的双水相 体系，蛋白质被萃取进入盐相，PEG得到回 收
典型的双水相萃取的工艺流程
主要由三部分构成：目的产物的萃取；PEG的 循环；无机盐的循环。
双水相萃取的优点
❖ 平衡时间短：自然成相时间5-60min ❖ 含水量高、界面张力小，有助于相间的
❖ 不同聚合物，水相系统显示不同的疏水性，水 溶液中聚合物的疏水性依下列次序递增：葡萄 糖硫酸盐＜甲基葡萄糖＜葡萄糖＜羟丙基葡聚 糖＜甲基纤维素＜聚乙烯醇＜聚乙二醇＜聚丙 三醇，这种疏水性的差别对目的产物与相的相 互作用是重要的。
❖ 同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加。
分子量的影响
❖ ❖ ❖
性小随 蛋，分 白疏子 向水量 另性增 一增大 相加， 转，分 移亲配
两相系统中如有盐存在，会对大分子在两相间的分配系数发生改变
（3）疏水作用
在pH值为等电点的双水相中，蛋白质主要根据表面疏水性的差异 产生各自的分配平衡。
两水相萃取-综合
❖ 双水相萃取过程的理论基础
❖
成相聚合物分子量和浓度
盐的种类和浓度
pH和温度
三、影响双水相萃取的因素
1. 聚合物及其相对的分子量
质量传递，特别适合于生物活性物质的 分离纯化 ❖ 操作简便，能耗低，聚合物可循环使用 ，成本低 ❖ 易于放大，可直接线性放大几万倍
两水相成相、分相、聚合物回收示意图
❖ 大规模双水相萃取
由于相混合能耗低，相平衡时间短，故双水 相萃取规模放大非常容易，10mL刻度离心 管的实验结果可准确放大到处理200Kg细胞 匀浆液规模。
氢键 电荷力 疏水作用 范德华力 构象效应
❖ 概述
两水相萃取
常用聚合物：
聚乙二醇－葡聚糖 聚乙二醇－无机盐系统
无毒原则
4、双水相的相图
B’
双节线形状位置和聚合物的分子量关系
双水相萃取过程的理论基础
❖表面自由能的影响
K=CT/CB
❖表面电荷的影响
两水相萃取-溶质在两相间分配
❖ 双水相萃取过程的理论基础
要进行两水相生物转化反应应满足下列条件 ： （×） ① 催化剂应单侧分配； ② 底物应分配于催化剂所处的相中；产物应分
配在另一相中；要有合适的相比。如产物分 配在上相中，则相比要大，反之则相比要小。 这些条件不可能同时满足，分配理论也不完 善，因此常需要根据试验选择最优系统和操 作条件。
两水相萃取
PEG = 聚乙二醇(polyethylene glycol) Kpi = 磷酸钾 DX= 葡聚糖(dextran)
双水相体系形成的原因
1. 双水相体系的成因是聚合物之间的不相溶性，即 聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗透， 具有相分离倾向，一定条件下分成两相(aqueous two-phase system, ATPS) 。一般认为，只要两 种聚合物水溶液的水溶性有所差异，混合时就可 发生相分离，并且水溶性差别越大，相分离的倾 向越大。
❖
一些无机离子的分配系数
正离子 K＋ Na＋ NH4＋ Li＋
分配系数K＋ 0.824 0.889 0.92 0.996
负离子 I－ Br－ Cl－ F－
分配系数K－ 1.42 1.21 1.12 0.912
无机盐的影响
pH6.9溶菌酶带正电， 卵蛋白带负电
U2-U1>0
4. 温度的影响
❖ 一般都可在室 温下操作。而 且室温时粘度 较冷却时低， 有助于相的分 离并节约了能 源开支。
2. 加入盐分，由于盐析作用，聚合物与盐类溶液也 能形成两相。
双水相萃取
❖双水相萃取是利用物质在 不相溶的两水相间分配系 数的差异进行萃取的方法
是否分层或混合成一相，取决于： ❖熵增——与分子数目有关 ❖分子间作用力——与分子大小有关
双水相萃取的原理
❖ 依据悬浮粒子与其周围物质具有的复杂的相 互作用：
（×）
① 与固定床反应器相比，不需载体，不存在多 孔载体中的扩散阻力，故反应速度较快，生 产能力较高；
② 生物催化剂在两水相系统中较稳定；两相间 表面张力低，轻微搅拌即能形成高度分散系 统，分散相液滴在10μm以下，有很大的表 面积，有利于底物和产物的传递。
思考题
❖ 何谓双水相萃取?常见的双水相构成体系有哪 些？
双水相萃取的应用-条件
要成功地运用两水相萃取的方法，应满足下列条件：
①欲提取的酶和细胞碎片应分配在不同的 相中；
②酶的分配系数应足够大，使在一定的相 体积比时，经过一次萃取，就能得到高 的收率；
③两相用离心机很容易分离。
双水相萃取的操作
❖ 萃取和平衡：由于体系的表面张力很低，分 配能在几分钟内达到平衡
两水相萃取-自由能影响
❖ 双水相萃取过程的理论基础 轻微变化引起 分配系数K发生 很大变化
适合生物大分 子分离
两水相萃取-电荷影响 Donnan 效应
双水相中溶质分配理论
（2）表面电荷的影响
Ψ
U2 U1
RT (Z Z )F
ln
K
Z B
K
Z A
ln
K
* i
ln
Ki
Z iFΨ RT
多步萃取
细胞匀浆液中目标产物可经过多步萃取获得较高的纯 化倍数。
双水相萃取的应用举例
分离和提纯各种蛋白质(酶），特别是胞内酶的 提取和精制。
酶
菌种
相系统
η/%
天冬氨酸酶
E.coli
PEG/盐 96
β-半乳糖苷酶 E.coli
PEG/盐 87
乙醇脱氢酶
Bakers yeast PEG/盐
96
青霉素酰化酶 E.coli
PEG/盐 90
2. 两水相反应器
在两水相系统中进行转化翻译功能，如酶促反 应，可以把产物移入另一相中，消除产物抑制， 因而提高了产率。这实际上是一种反应和分离 耦合的过程，有时也称为萃取生物转化；如果 发生的是一种发酵过程，则也称为萃取发酵， 因而此时也可以把两水相系统称为两水相反应 器。
➢ ➢
性性Leabharlann Baidu
失 蛋，许
活 。
白不多 质溶蛋
在于白
有有质
机机都
溶溶有
剂剂极
相 中
；
强 的
易亲
变水
双水相的发现
1896年Beijerinck观察到当把明胶与琼脂或把明胶和 可溶性淀粉的水溶液混合时，先得到一混浊不透明的 溶液，随后分成两相，上相含有大部分明胶，下相含 有大部分琼脂(或可溶性淀粉)。再如下图中，2.2％的 葡聚糖水溶液与等体积的0.72％甲基纤维素钠的水溶 液相混合并静置后，可得到两个粘稠的液层。
Enzymetic reaction
enzyme
enzyme
enzyme
enzyme enzyme
substrate
product
两水相萃取
❖ 双水E相n萃zy取m过et程ic的r理ea论ct基io础n with ATPS
enzyme enzyme
enzyme
采用两水相系统进行生物转化反应有下列优点：
数 减
❖
水解程度的影响
易一 集般 中来 于说 低， 分蛋 子白 量等 相高
分 子 量 物 质
2. pH的影响
❖ pH会影响蛋白质中可离解基团的离解度，因而改 变蛋白质所带电荷和分配系数；另外，pH还影响 系统缓冲物质磷酸盐的离解程度，从而影响分配 系数。
❖ pH微小的变化有时会使蛋白质的K改变2～3个数 量级。
双水相萃取
主讲人：董冰雪
双水相萃取
生化固液分离中最困难的操作是从细胞破碎后的浆液中移走 细胞碎片，这些碎片分布很广（0.2－1μm)，包括（细胞 壁碎片、膜碎片、完整的细胞器和未破碎的细胞）。
用离心机分离不易除掉某 些絮状小碎片
膜分离速度慢，易出现污染 和蛋白质滞留。
双水相萃取是水相中加入高分子化合物形成密度不同的 两相，用于萃取蛋白质。
葡聚糖与甲基纤维素钠的双水相体系
双水相萃取
(Aqueous Two Phase Extraction)
❖ 因使用的溶剂是水，因此称为双水相，在这两 相中水分都占很大比例(85％一95％)，活性蛋 白或细胞在这种环境中不会失活，但可以不同 比例分配于两相，这就克服了有机溶剂萃取中 蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂 的缺点。
❖ 体系pH与蛋白质等电点相差越大，蛋白质在两相 中分配越不均匀。
pH影响-血清蛋白交错分配
不同盐系 统中，等 电点分配 系数相同
3.离子环境对蛋白质在两相体系分配的影响
❖ 在PEG/Dex中，无机盐离子在两相中也有不同的分 配(见表2-2)，因此在两相间形成电位差。由于各相 要保持电中性，这对带电生物大分子，如蛋白质和 核酸等的分配，产生很大的影响。
❖ 上下相的分离：重力沉降，离心分离 ❖ 多聚物的分离：目的蛋白在PEG上相中，相
分离后，在上相中加入盐，形成新的双水相 体系，蛋白质被萃取进入盐相，PEG得到回 收
典型的双水相萃取的工艺流程
主要由三部分构成：目的产物的萃取；PEG的 循环；无机盐的循环。
双水相萃取的优点
❖ 平衡时间短：自然成相时间5-60min ❖ 含水量高、界面张力小，有助于相间的
❖ 不同聚合物，水相系统显示不同的疏水性，水 溶液中聚合物的疏水性依下列次序递增：葡萄 糖硫酸盐＜甲基葡萄糖＜葡萄糖＜羟丙基葡聚 糖＜甲基纤维素＜聚乙烯醇＜聚乙二醇＜聚丙 三醇，这种疏水性的差别对目的产物与相的相 互作用是重要的。
❖ 同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加。
分子量的影响
❖ ❖ ❖
性小随 蛋，分 白疏子 向水量 另性增 一增大 相加， 转，分 移亲配
两相系统中如有盐存在，会对大分子在两相间的分配系数发生改变
（3）疏水作用
在pH值为等电点的双水相中，蛋白质主要根据表面疏水性的差异 产生各自的分配平衡。
两水相萃取-综合
❖ 双水相萃取过程的理论基础
❖
成相聚合物分子量和浓度
盐的种类和浓度
pH和温度
三、影响双水相萃取的因素
1. 聚合物及其相对的分子量
质量传递，特别适合于生物活性物质的 分离纯化 ❖ 操作简便，能耗低，聚合物可循环使用 ，成本低 ❖ 易于放大，可直接线性放大几万倍
两水相成相、分相、聚合物回收示意图
❖ 大规模双水相萃取
由于相混合能耗低，相平衡时间短，故双水 相萃取规模放大非常容易，10mL刻度离心 管的实验结果可准确放大到处理200Kg细胞 匀浆液规模。
氢键 电荷力 疏水作用 范德华力 构象效应
❖ 概述
两水相萃取
常用聚合物：
聚乙二醇－葡聚糖 聚乙二醇－无机盐系统
无毒原则
4、双水相的相图
B’
双节线形状位置和聚合物的分子量关系
双水相萃取过程的理论基础
❖表面自由能的影响
K=CT/CB
❖表面电荷的影响
两水相萃取-溶质在两相间分配
❖ 双水相萃取过程的理论基础
要进行两水相生物转化反应应满足下列条件 ： （×） ① 催化剂应单侧分配； ② 底物应分配于催化剂所处的相中；产物应分
配在另一相中；要有合适的相比。如产物分 配在上相中，则相比要大，反之则相比要小。 这些条件不可能同时满足，分配理论也不完 善，因此常需要根据试验选择最优系统和操 作条件。
两水相萃取
PEG = 聚乙二醇(polyethylene glycol) Kpi = 磷酸钾 DX= 葡聚糖(dextran)
双水相体系形成的原因
1. 双水相体系的成因是聚合物之间的不相溶性，即 聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗透， 具有相分离倾向，一定条件下分成两相(aqueous two-phase system, ATPS) 。一般认为，只要两 种聚合物水溶液的水溶性有所差异，混合时就可 发生相分离，并且水溶性差别越大，相分离的倾 向越大。
❖
一些无机离子的分配系数
正离子 K＋ Na＋ NH4＋ Li＋
分配系数K＋ 0.824 0.889 0.92 0.996
负离子 I－ Br－ Cl－ F－
分配系数K－ 1.42 1.21 1.12 0.912
无机盐的影响
pH6.9溶菌酶带正电， 卵蛋白带负电
U2-U1>0
4. 温度的影响
❖ 一般都可在室 温下操作。而 且室温时粘度 较冷却时低， 有助于相的分 离并节约了能 源开支。
2. 加入盐分，由于盐析作用，聚合物与盐类溶液也 能形成两相。
双水相萃取
❖双水相萃取是利用物质在 不相溶的两水相间分配系 数的差异进行萃取的方法
是否分层或混合成一相，取决于： ❖熵增——与分子数目有关 ❖分子间作用力——与分子大小有关
双水相萃取的原理
❖ 依据悬浮粒子与其周围物质具有的复杂的相 互作用：
（×）
① 与固定床反应器相比，不需载体，不存在多 孔载体中的扩散阻力，故反应速度较快，生 产能力较高；
② 生物催化剂在两水相系统中较稳定；两相间 表面张力低，轻微搅拌即能形成高度分散系 统，分散相液滴在10μm以下，有很大的表 面积，有利于底物和产物的传递。
思考题
❖ 何谓双水相萃取?常见的双水相构成体系有哪 些？
双水相萃取的应用-条件
要成功地运用两水相萃取的方法，应满足下列条件：
①欲提取的酶和细胞碎片应分配在不同的 相中；
②酶的分配系数应足够大，使在一定的相 体积比时，经过一次萃取，就能得到高 的收率；
③两相用离心机很容易分离。
双水相萃取的操作
❖ 萃取和平衡：由于体系的表面张力很低，分 配能在几分钟内达到平衡
两水相萃取-自由能影响
❖ 双水相萃取过程的理论基础 轻微变化引起 分配系数K发生 很大变化
适合生物大分 子分离
两水相萃取-电荷影响 Donnan 效应
双水相中溶质分配理论
（2）表面电荷的影响
Ψ
U2 U1
RT (Z Z )F
ln
K
Z B
K
Z A
ln
K
* i
ln
Ki
Z iFΨ RT
多步萃取
细胞匀浆液中目标产物可经过多步萃取获得较高的纯 化倍数。
双水相萃取的应用举例
分离和提纯各种蛋白质(酶），特别是胞内酶的 提取和精制。
酶
菌种
相系统
η/%
天冬氨酸酶
E.coli
PEG/盐 96
β-半乳糖苷酶 E.coli
PEG/盐 87
乙醇脱氢酶
Bakers yeast PEG/盐
96
青霉素酰化酶 E.coli
PEG/盐 90
2. 两水相反应器
在两水相系统中进行转化翻译功能，如酶促反 应，可以把产物移入另一相中，消除产物抑制， 因而提高了产率。这实际上是一种反应和分离 耦合的过程，有时也称为萃取生物转化；如果 发生的是一种发酵过程，则也称为萃取发酵， 因而此时也可以把两水相系统称为两水相反应 器。
➢ ➢
性性Leabharlann Baidu
失 蛋，许
活 。
白不多 质溶蛋
在于白
有有质
机机都
溶溶有
剂剂极
相 中
；
强 的
易亲
变水
双水相的发现
1896年Beijerinck观察到当把明胶与琼脂或把明胶和 可溶性淀粉的水溶液混合时，先得到一混浊不透明的 溶液，随后分成两相，上相含有大部分明胶，下相含 有大部分琼脂(或可溶性淀粉)。再如下图中，2.2％的 葡聚糖水溶液与等体积的0.72％甲基纤维素钠的水溶 液相混合并静置后，可得到两个粘稠的液层。
Enzymetic reaction
enzyme
enzyme
enzyme
enzyme enzyme
substrate
product
两水相萃取
❖ 双水E相n萃zy取m过et程ic的r理ea论ct基io础n with ATPS
enzyme enzyme
enzyme
采用两水相系统进行生物转化反应有下列优点：