绿色荧光蛋白的结构、发光机制及其应用研究
绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白GFP的研究与应用摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一种极具潜力的标记物，有着广泛的应用前景。
通过阅读吴沛桥的《绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用》这篇文献，对GFP有了进一步了解。
关键词：绿色荧光蛋白（GFP）；性质；原理；应用1 引言发光是海洋无脊椎动物中普遍存在的现象，一些腔肠动物包括水母、水螅和珊瑚等受到机械性干扰时都可发射绿色荧光，而栉水母类发射蓝色荧光。
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。
1962 年,Shimomura 等从维多利亚多管水母（Aequoria victoria）中分离纯化生物发光蛋白质——水母蛋白, 并观察到一个在紫外光下发出“非常明亮, 浅绿色荧光”的副产物。
1974 年,Shimomura等纯化得到了这种自发荧光的蛋白（即GFP）。
2008年10月8日，瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会将2008年度诺贝尔化学奖授予日裔美国科学家下村修（Osamu Shimomura）、美国科学家马丁·查尔非(Mratin Chalfie)以及美国华裔科学家钱永健(Rorge Y.Tsien)，他们三人因为在绿色荧光蛋白的发现以及改造方面做出了突出成就。
2 GFP的理化性质从水母体内分离到的GFP基因，长达2.6kD，由3个外显子组成，分别编码69、98和71个氨基酸。
GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白。
GFP性质极其稳定，耐高温，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。
其变性需在90℃或pH<4.0或pH>12.0的条件下用6mol/L盐酸胍处理，一旦恢复中性环境或去除变性剂，虽然变性的蛋白质并不能完全复性，但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。
更重要的是，它们在pH7.0~pH12.2的范围内的吸收、发射光谱也是相同的。
绿色荧光蛋白及其在细胞生物学研究中的应用
绿色荧光蛋白及其在细胞生物学研究中的应用绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）是一种从水母Aequorea victoria中分离出来的荧光蛋白质，可以发射绿色荧光。
由于GFP具有结构简单，对细胞无毒性和较强稳定性等特点，因此被广泛应用于细胞生物学和生命科学研究中。
以下是关于GFP及其在细胞生物学研究中的应用的介绍。
一、荧光蛋白及GFP的来源荧光蛋白质是一种含有环状芳香族氨基酸残基的蛋白质，能够吸收外部能量并将其转化为荧光发射。
GFP最初是在1955年，美国南加州大学的Osamu Shimomura研究水母发光机制时发现的。
GFP由238个氨基酸组成，分子量约27kDa。
GFP基因被克隆后即可在其他生物中表达，使它成为了生物体内最常用的荧光标记物之一。
二、GFP的结构和原理GFP的荧光由3个氨基酸残基Tyr（酪氨酸）、Ser（丝氨酸）和Gly（甘氨酸）构成的环状结构决定。
当氧气与Tyr形成共轭键时，便使荧光激发能量被吸收，并在GFP分子腔内缓慢扩散，直至荧光发射。
三、GFP在细胞生物学中的应用1、荧光定位GFP被广泛用于生命科学中细胞定位的研究。
由于GFP具有细胞膜透性和结构稳定性等特性，可以将其组装到生物体内，使其具有明亮的绿色荧光。
通过转化所需的基因序列来表达GFP，可以使研究人员直接在活细胞中观察到融合GFP蛋白质的定位和空间分布状况。
2、蛋白质交互作用GFP也被用作蛋白质交互作用的研究工具。
在这种情况下，GFP被连接到研究的蛋白质上，而研究人员观察到GFP与其他蛋白质结合的情况，从而确定蛋白质之间是否相互作用。
3、表达和异常行为GFP还可用于研究蛋白质的表达和异常行为。
通过表达GFP基因，可以探究研究对象的分泌情况、活动状态、质量控制和分解情况等。
4、细胞轨迹追踪GFP被广泛应用于细胞追踪研究中。
通过转染GFP基因，可以实时跟踪特定细胞类型的运动和位置，比如细胞分裂、游走和迁移等。
绿色荧光蛋白及其在细胞生物学中的应用
绿色荧光蛋白及其在细胞生物学中的应用绿色荧光蛋白(GFP)是生物学中非常著名的一个标记蛋白，它可以帮助科学家们观察、追踪细胞内部分子的运动和位置变化。
本文将介绍GFP的结构、功能以及在细胞生物学中的应用。
GFP结构与功能GFP来自于海葵(海洋无脊椎动物)中的一种发光蛋白，它的结构中含有一个环状结构(环状柄)和一个β桶(β-barrel)。
环状柄中含有一个色素分子，称为染料环，贡献了GFP的光学特性。
β桶的作用是保护染料环，并使它的光学特性达到最佳状态。
GFP有着非常特殊的性质，它可以在自然光下发出荧光，荧光颜色为绿色。
当其暴露在213-488nm的紫外线照射下，GFP就会发射从蓝、绿到黄的荧光波长。
GFP的这种特性使得它成为了生物学家们进行光学研究的最佳工具。
1. 显微镜下的成像GFP是一种非常强的标记蛋白，通过将其融合到目标物分子上，可以非常清晰地显示该分子的位置和运动。
利用显微镜技术，研究人员可以观察到细胞器、蛋白质、RNA等生命大分子在细胞内的运动和相互作用，从而揭示其在生物学中的重要作用。
2. 基因表达与细胞注释通过将GFP基因转染到细胞中，可以实现在特定细胞和组织中进行特定基因的表达。
同时，在转染GFP的细胞中，人们也可以通过显微镜监测到特定细胞的位置和分布，用于细胞的标记与识别。
3. 胚胎发育研究GFP还可以用于观察和研究胚胎发育过程中各种细胞分子的运动和定位。
通过将GFP融合到发育过程中的标志性分子中，研究人员可以观察到该分子在胚胎发育的不同阶段中的表达和变化，从而揭示胚胎发育的机制。
总结GFP的发现和应用开创了一种全新的标记技术，使科学家们能够更深入地探究生命大分子的运动、位置和相互作用。
GFP的强烈荧光使得其在细胞生物学研究中具有广泛的应用价值，特别是在显微镜下的成像、基因表达与细胞注释以及胚胎发育研究中。
可以预见，在不久的将来，GFP的应用将会更加广泛，并将继续推动生命科学研究的进步。
gfp的应用原理步骤
gfp的应用原理步骤1. 简介GFP（Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白）是一种来自于蓝绿色发光苔藓（Aequorea victoria）的一种蛋白质，它能发出绿色荧光。
GFP在生物领域具有广泛的应用，特别是作为荧光标记的工具，用来研究细胞生物学和生物化学等方面的问题。
本文将介绍GFP的应用原理步骤。
2. GFP的应用原理GFP的应用主要基于其特殊的结构和发光机制。
GFP的分子结构中包含一个环状的花青质染色体，通过紫外线或蓝光激发后，花青质染色体接受能量并发出绿色荧光。
GFP的应用原理步骤可以大致归纳为以下几个方面：2.1. GFP的基因表达与转染要应用GFP进行生物学研究，首先需要将GFP的基因导入到待研究的目标细胞中。
通常使用基因转染技术，将GFP基因导入细胞质或细胞核中，并使其被目标细胞所表达。
2.2. GFP的定位与追踪一旦GFP基因在目标细胞内表达成功，GFP蛋白质将被合成并定位在细胞的特定位置。
通过显微镜观察，可以实时追踪GFP蛋白的定位，揭示细胞器、细胞结构以及其他目标的位置和形态。
2.3. GFP的功能分析GFP的应用不仅仅局限于细胞定位的研究，还可以用于功能分析。
通过将GFP 蛋白与其他感兴趣的蛋白质进行融合，可以观察到蛋白质在细胞内的表达和功能活性，从而研究蛋白质的功能和相互作用。
2.4. GFP的动力学分析还可以利用GFP技术进行动力学研究，通过观察GFP蛋白在细胞内的动态变化，如运动轨迹、生长速度、参与细胞分裂等，揭示细胞的生物学过程和机制。
3. GFP的应用步骤应用GFP进行细胞生物学和生物化学研究的步骤如下：步骤1：选择适当的表达载体选择合适的表达载体，将GFP基因插入其中，并与目标蛋白的编码序列进行融合，以实现目标蛋白的表达和GFP的定位。
步骤2：转染目标细胞采用合适的转染技术将表达载体导入目标细胞，并使用适当的筛选标记（如抗生素抗性基因）筛选成功转染的细胞。
dfhbi 1t类绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）是一种具有绿色荧光的蛋白质，广泛应用于生物学领域的标记和成像技术中。
绿色荧光蛋白的研究和应用已经成为生命科学领域中的热点和前沿课题。
在这篇文章中，我们将深入探讨绿色荧光蛋白的种类、结构、功能和应用。
1. 绿色荧光蛋白的种类绿色荧光蛋白是由Aequorea victoria（水母）发光器官中分离出来的一种蛋白质。
根据不同的来源和结构特点，绿色荧光蛋白可以分为多种类别，包括标准GFP、改良GFP、超变荧光蛋白和环状GFP等。
每种类型的绿色荧光蛋白都具有不同的荧光特性和适用范围。
2. 绿色荧光蛋白的结构绿色荧光蛋白的结构是其功能的基础。
它是一个由238个氨基酸组成的蛋白质，包括一个β桶结构和一个共轭双键序列。
在特定的条件下，它可以通过自发性氧化反应形成荧光色团，并发出绿色的荧光。
绿色荧光蛋白的结构和光学特性为其在生物标记和成像领域的应用奠定了基础。
3. 绿色荧光蛋白的功能作为一种生物标记物，绿色荧光蛋白的主要功能是在转基因生物中标记特定的细胞、器官或组织，以便于研究者对其进行观察和分析。
通过转基因技术，研究人员可以将绿色荧光蛋白基因导入到目标生物体中，从而实现对其活体成像和实时监测。
绿色荧光蛋白在蛋白质定位、蛋白质-蛋白质相互作用和基因表达调控等方面也发挥着重要作用。
4. 绿色荧光蛋白的应用绿色荧光蛋白的广泛应用领域包括但不限于以下几个方面：a. 细胞成像与实时监测：通过转基因技术将绿色荧光蛋白标记到感兴趣的细胞中，可以实现对其活体成像和实时监测，从而揭示生物体内细胞的运动、分化和凋亡等过程。
b. 蛋白质定位与跟踪：通过融合绿色荧光蛋白与感兴趣蛋白质，可以实现对蛋白质在生物体内的定位与跟踪，从而研究其功能和代谢途径。
c. 蛋白质-蛋白质相互作用研究：利用双融合蛋白技术或FRET技术，可以实现对蛋白质-蛋白质相互作用的实时观察和分析，为研究蛋白质分子机制提供了有力工具。
发光细菌GFP的表达机理及应用
发光细菌GFP的表达机理及应用发光细菌GFP是绿色荧光蛋白的简称，是由Aequorea victoria这种水母所产生的一种蛋白质。
GFP不但具有高度的应用价值，而且还是生物学研究中最有用的分子标记之一。
本文将从发光细菌GFP的表达机理、应用以及未来发展等方面进行介绍。
一、发光细菌GFP的表达机理GFP是一种由238个氨基酸组成的蛋白质，主要在海水深处生活的Aequorea victoria珊瑚中产生。
GFP通过吸收紫外线光激发，产生荧光。
GFP能在任何类型的生物组织内发光，不会产生有害影响。
除了绿色之外，GFP还能产生黄色、蓝色、紫色、红色等颜色的荧光。
这些颜色的荧光由不同种类的GFP进行表达，这些不同种类的GFP都具有不同的结构和光学特性。
GFP的结构包含一个由11肽段组成的β桶状结构和一个由α螺旋段组成的关键性结构域。
通过对这个结构域的分子工程改造，研究人员可以对GFP进行改造，使其在其他物种内表达并发光。
二、发光细菌GFP的应用GFP已成为生物医学领域的热门研究课题。
由于GFP可以与其他蛋白质相结合，并且不会对细胞造成任何影响，能够用于实现对生物系统的准确研究。
GFP可以制作成质粒，通过质粒转染等方法，将其导入到需要研究的细胞内。
利用GFP可准确观察到细胞内各种蛋白质分子的定位和表达等情况。
1、生物病理学：GFP在生物病理学领域已经有了广泛的应用。
与其他标记方法相比，GFP标记具有许多优势。
第一，当有多种标记时，GFP在背景噪音中更易于辨认；第二，直接观察细胞在活体状态下的各种功能，例如细胞的表面形态、细胞器的运动等。
2、分子生物学：GFP已经成为分子生物学中最重要的分子标记技术之一。
通过观察GFP标记蛋白分子的表达、定位和交互关系，有助于更好地理解生物化学反应。
利用GFP标记，研究人员可以更好地分离和分析蛋白质、DNA和RNA，进一步深入研究生物化学反应。
3、神经科学：大多数神经科学家利用GFP生物标记技术，将化学物质或电压灵敏的通道与GFP合并。
GFP-绿色荧光蛋白的来源和应用
GFP:绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein,简称GFP)是一种在美国西北海岸所盛产的水母中所发现的一种蛋白质。
它之所以能够发光,是因在其包含238个氨基酸的序列中,第65至67个氨基酸(丝氨酸—酪氨酸—甘氨酸)残基,可自发地形成一种荧光发色团。
发光机理:当蛋白质链折叠时,这段被深埋在蛋白质内部的氨基酸片段,得以“亲密接触”,导致经环化形成咪唑酮,并发生脱水反应。
但此时还不能发射荧光,只有当有分子氧存在的条件下,发生氧化脱氢,方能导致绿色荧光蛋白发色团的“成熟”,形成可发射荧光的形式。
上述绿色荧光蛋白发色团的形成过程,系由几位科学家分别研究完成的。
绿色荧光蛋白不仅无毒,而且不需要借助其他辅酶,自身就能发光,可以让科学家在分子水平上研究活细胞的动态过程。
当绿色荧光蛋白的基因和我们感兴趣的有机体内所拟研究的蛋白质基因相融合时,蛋白质既能保持其原有的活性,绿色荧光蛋白的发光能力也不受影响。
钱永健的贡献钱永健及其合作者,还解决了绿色荧光蛋白的晶体结构问题,从而允许能够较合理地对具不同性质的变体合成进行设计。
这些新变体有的荧光更强,有的呈黄色,有的呈蓝色,有的呈红色,有的可激活、可变色。
这意味着除绿色以外,还可以用其他颜色荧光蛋白标示不同的蛋白质和细胞。
GFP的发光特性GFP吸收的光谱,最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder).GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察.GFP的性质GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强,特别在450～490nm蓝光波长下更稳定.GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复.而一些弱还原剂并不影响GFP荧光.中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定,脱水剂戊二酸或甲醛等.GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析.但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白.由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的.在生物技术中的应用1.分子标记除用于特定蛋白的标记定位外，GFP亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。
绿色荧光蛋白
GFP作为标记蛋白的优点
①荧光稳定 ②检测方便 ③无种属特异性，也无有细胞种类和位置的限制 ④GFP对受体细胞基本无毒害 ⑤易于构建载体，不受假阳性干扰 ⑥不需任何反应底物和辅助因子 ⑦可制成永久标本
绿色荧光蛋白
绿色荧光蛋白的分子生物学 及其应用
绿色荧光蛋白的研究史
1962年Shimomure等首先从维多利亚水母(Aequorea Victoria) 中分离出了GFP (Green-Fluorescent Protein) 。
维多利亚水母 (Aequorea Victoria)
A test tube containing a sample of a cyan (greenish-blue) fluorescent protein from a sea anemone illuminated by ultra-violet light from below.
பைடு நூலகம்
GFP发色团的骨架在左边。蛋白质链形成一个圆柱形罐头（蓝色），子链的一部分 直接从中间穿过（绿色），发色团刚好在罐头盒的中间，它被保护起来以免受周围环境 的影响。这种保护对于发射荧光是必需的。一但发色团吸收一个光子，激活的水分子通 常就会夺取它的能量。但是在蛋白质内部改为发射能量稍低的光子来释放能量，使它得 到了保护。发色团（右图）由蛋白质链上的三个氨基酸：甘氨酸，酪氨酸和苏氨酸（或 丝氨酸）自发形成。
绿色荧光蛋白的研究史
1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了 GFP，开创了GFP应用研究的先河。
对绿色荧光蛋白(GFP)的了解及应用
对绿色荧光蛋白的了解及应用学院：生命科学学院姓名：马宗英年级：2011学号：2011012923前言绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，是一种具有奇妙特性的“光学蛋白质”。
这种蛋白质从成分和结构上来说，没有丝毫的特殊性，它的组成单元是20种常见的氨基酸，二级结构也是普通的α螺旋和β片层。
但是，这种蛋白质却具有一个非常特别的性质——发出绿色荧光。
【关键词】绿色荧光蛋白生命科学应用一、绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白最早是由下村修等人于1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现的。
其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，吸收蓝光的部分能量，发出绿色荧光。
野生型水母GFP的一级序列已由其cDNA序列推导出来[1]，它至少存在4种同源GFP，但这些突变并不影响GFP的基本功能，只是使突变的GFP具有了新的性质。
生色团是GFP发出荧光的物质基础，也是GFP结构中的一个重要组成部分。
GFP的生色团位于氨基酸序列64~69位的六肽内,65~67位的丝氨酸、脱氢酪氨酸、甘氨酸通过共价键形成的对羟基苯甲基咪唑环酮是一个独特的、相当稳定的环状三肽结构,构成了GFP生色团的核心[2],见图1。
图2为生色团的形成机制。
图1 多管水母中GFP生色团的化学结构和附近序列图2生色团的形成机制目前人们对GFP的荧光发光机制并不十分清楚，大家只是认为，GFP是生物发光过程中的能量受体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机制也有很大差异。
二、GFP在生命科学中的应用1、作为蛋白质标签（protein tagging）利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签（protein tagging），即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染到合适的细胞中进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内的活体观察。
绿色荧光蛋白的研究现状与应用
绿色荧光蛋白的研究现状与应用【摘要】绿色荧光蛋白（GFP）最早发现于水母体中，是一种十分重要的蛋白质。
由于其众多的优点，现已在分子生物和细胞生物的研究中应用十分广泛。
随着技术的进步和研究的进一步深入，GFP基因也在许多其他方面将发挥着越来越重要的作用。
【关键词】绿色荧光蛋白；生色团；报告基因2008年10月8日，瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会授予三位科学家：日裔美国科学家下村修(Osamu Shimomura)、美国科学家马丁?查尔非(Martin Chalfie)和美国华裔科学家钱永健(Roger Y．Tsien)诺贝尔化学奖，以表彰他们在绿色荧光蛋白(GFP)研究方面做出的突出贡献。
1 绿色荧光蛋白的理论研究1.1绿色荧光蛋白的发现绿色荧光蛋白最早于1962年在维多利亚多管发光水母体内被发现，同时它也存在于水螅和珊瑚等腔肠动物体内。
它的内源基团可以在蓝光或紫外光激发下发射绿光，属于生物发光蛋白。
绿色荧光蛋白在水母体内之所以能发光，主要依靠水母素的辅助。
水母素和GFP之间能发生了能量转移，在钙的刺激下，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。
1.2绿色荧光蛋白的结构和发光原理1992年Prasher等克隆了GFP基因的cDNA并分析了其一级结构。
野生型GFP基因组全长2600bp，由3个外显子和2个内含子组成，编码238个氨基酸，分子量约28kDa。
GFP的三维立体结构是由11个β折叠围在四周形成一个中空的圆柱体，1条α折叠贯穿在圆柱体的中间，其中有一段位于65-67位的3个氨基酸残基（Ser-Tyr-Gly）形成的杂环咪唑啉结构组成生色团，位于圆筒中央并附着在α螺旋上。
绿色荧光蛋白的发光原理是位于氨基酸第65位的Ser的羧基和67位的Gly的酰基经过亲核反应生成咪唑基，66位的Tyr通过脱氢使芳香团与咪唑基结合，形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团发出荧光。
GFP的最大和次大的激发波长分别是395nm和475nm。
gfp荧光蛋白发光原理
gfp荧光蛋白发光原理【原创实用版】目录1.GFP 荧光蛋白的概述2.GFP 荧光蛋白的发光原理3.GFP 荧光蛋白的应用领域正文一、GFP 荧光蛋白的概述GFP（Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白）是一种源自水母的荧光蛋白，具有在紫外光下吸收能量并在可见光下发射出绿色荧光的特性。
自从 1962 年被科学家发现以来，GFP 已经成为生物学和生物医学研究领域的重要工具，被广泛应用于蛋白质表达、细胞追踪和生物成像等方面。
二、GFP 荧光蛋白的发光原理GFP 荧光蛋白的发光原理主要基于其特殊的分子结构。
GFP 蛋白由20 个氨基酸残基组成，这些氨基酸残基在空间上形成了一个特殊的结构，使得 GFP 蛋白具有荧光性质。
GFP 蛋白在紫外光的照射下，会吸收紫外光的能量，并使蛋白质分子中的电子跃迁到激发态。
在激发态下，电子会通过一系列的振动和旋转，最终回到基态。
当电子回到基态时，多余的能量以光的形式释放出来，形成绿色荧光。
值得注意的是，GFP 荧光蛋白在不同的环境下，其发光强度和颜色可能会发生变化。
为了提高 GFP 荧光蛋白的稳定性和发光效率，科学家们通过基因工程技术，开发出了许多 GFP 的改进型，例如增强型 GFP（EGFP）、快速熒光蛋白（RFP）和黄色荧光蛋白（YFP）等。
三、GFP 荧光蛋白的应用领域GFP 荧光蛋白及其改进型在生物学和生物医学研究领域具有广泛的应用。
以下是 GFP 荧光蛋白的一些主要应用领域：1.蛋白质表达：GFP 荧光蛋白可以作为融合蛋白的标签，用于检测蛋白质的表达水平和定位。
2.细胞追踪：通过将 GFP 荧光蛋白融合到细胞膜蛋白上，可以实现对细胞在活体状态下的实时追踪和成像。
3.生物成像：GFP 荧光蛋白在生物成像领域具有重要应用，可以用于实时监测细胞内的生物过程和信号传导。
4.药物筛选：GFP 荧光蛋白可以用作药物筛选的指标，通过检测荧光蛋白的活性变化，评估药物对蛋白质功能的影响。
绿色荧光蛋白的结构和应用
绿色荧光蛋白的结构和应用【摘要】文章就绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）的一级结构和其发光基团的形成机理进行了分析，给出了GFP的三维结构，并对GFP的优点、改进方法和实际应用进行概括。
【关键词】GFP 结构改进应用2008年10月8日，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu Shimomura（下村修）、哥伦比亚大学的Marin Chalfie和加州大学圣地亚哥分校的Roger Y.Tsien（钱永健）因发现并发展了绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）而获得2008年度诺贝尔化学奖。
GFP也因此进入了更多人的视角。
一、GFP的一级结构和发色团形成机理GFP是存在于水母、珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，是Shimomura等人从Aequorea victoria中发现的。
GFP含238个氨基酸残基，分子量27kDa。
野生型GFP的核苷酸序列和氨基酸序列在1992年即被Prasher等人测定[1]。
表1为其氨基酸序列。
GFP不含辅基，也不需要辅助因子，在22℃左右，氧条件下，用蓝光光源激发下可发出绿色荧光[2]。
其发色团形成于肽链65至67位的Ser-Tyr-Gly，是分子内自催化环化生成的对羟基吡唑啉酮。
首先肽链折叠，Gly67酰胺亲核进攻Ser65的羧基，并脱去一分子水形成咪唑啉酮，最后在氧作用下Tyr66的α，β-键脱氢，此时芳基和咪唑啉酮形成大的共轭体系，发色团成熟，可以吸收辐射并发出荧光[3]。
图1为示意图。
图1：GFP 发色团形成机理表 1：GFP 的氨基酸序列Tsien还根据发色团组分的不同将野生型GFP和其突变体分为了7类，如含中性酚类和酚离子混合发色团的蛋白，含吲哚类的蛋白，含咪唑类的蛋白，具有大π共轭电子体系的酚负离子的蛋白等[3]。
虽然它们的激发波长、吸收波长等荧光性质具有很大不同，但其发光机理都与它们的一级结构密切相关，发色团形成机理类似。
绿色荧光蛋白在生物科研中的应用与发展
绿色荧光蛋白在生物科研中的应用与发展绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）是一种广泛用于生物科研的工具蛋白，它源自于一种发光生物——海葵。
GFP具有自发的荧光特性，能够发出绿色的荧光信号，并且能够与其他蛋白质一起被观察、追踪。
GFP的发现与利用，为生命科学领域带来了一场革命，被广泛应用于光遗传学、分子标记、细胞成像等多个领域。
在本文中，我们将介绍GFP的应用及其在生物科研中的发展情况。
一、GFP的发现与基本原理1992年，日本科学家下村脩祐在对海葵的研究中，发现有一种名为GFP的蛋白质，它能够在紫外光的照射下自发发出绿色荧光。
1994年，美国生物学家马丁·查尔芬（Martin Chalfie）和罗杰·钱（Roger Tsien）证实了GFP的自发荧光特性，并通过转基因技术成功将GFP导入到非常规高等生物体系中，开创了GFP的应用前景。
GFP的发光原理与其他荧光染料不同，它并不需要诱导剂的作用或化学反应的参与。
GFP的分子结构由238个氨基酸组成，可以自行折叠成一个波浪形的结构，其中蛋白“心脏”的中心是一个色团，称为色素环（chromophore），这个环的结构与化学状态有机会决定了GFP发射绿光荧光的特性。
GFP的发光特性具有“自发、可重复、非侵入性、可监测、可定量化、标记靶点准确”的优点，成为生物科学研究中广泛使用的荧光标记分子。
二、GFP在光遗传学的应用光遗传学是指应用光敏感蛋白和分子工程技术对生物活动进行精准控制和实时监测的技术。
GFP在光遗传学研究中被广泛应用，主要用于驱动离子通道、激酶和离子泵的表达。
通过对这些因子的定向表达，可以研究光敏感信号的传递、光学信息的处理和细胞感知。
GFP的分子可以通过基因克隆技术导入到目标细胞或组织中，与其他光敏感蛋白一起被利用为光敏受体。
结合光学影像技术，研究人员可以通过光刺激来操作蛋白质的表达、离子流动、膜的通透性等，从而研究细胞和生物体系中各种生理或病理情况的变化。
绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用
9、药物研发：在药物研发领域，GFP可以用于标记和追踪目标药物分子。通过 观察GFP的荧光信号，可以研究药物分子的体内分布、药代动力学和毒性等指 标。同时，利用GFP还可以筛选和优化药物作用靶点及候选药物的有效性和安 全性。
谢谢观看
绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用
01 引言
03 GFP的发现
目录
02 研究进展 04 GFP的分类和功能
目录
05 研究现状与不足
07 应用领域
06 未来研究方向
引言
绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，简称GFP）是一种重要的生物 标志物，它在生物学研究中被广泛用于标记和追踪目标细胞、蛋白质及其相互 作用。GFP的发现和应用为生物科学研究开辟了新的途径，本次演示将介绍 GFP的研究进展及其在各个领域的应用。
7、发育生物学：在发育生物学领域，GFP可以用于标记和追踪胚胎期和成体期 不同组织的细胞生长、分化和迁移。通过观察GFP的荧光信号，可以研究器官 形成、组织修复和再生等过程。
8、微生物学：在微生物学领域，GFP可以用于标记和追踪细菌、真菌和寄生虫 等微生物。通过观察GFP的荧光信号，可以研究微生物的感染、传播和抗感染 免疫等过程。
GFP的分类和功能
根据来源和结构差异，GFP可以分为多种类型，包括海洋水母型GFP、珊瑚型 GFP、发光细菌型GFP等。这些不同类型的GFP具有不同的光谱特性和应用范围。 其中，海洋水母型GFP具有较高的荧光亮度和良好的溶解性，是生物科学研究 中最常用的类型。
GFP的功能主要包括两个方面：作为报告基因和作为标签蛋白。作为报告基因， GFP可以用于监测基因的表达和蛋白质的定位。作为标签蛋白，GFP可以用于 研究蛋白质的结构和功能，以及细胞生物学中细胞标记、追踪和分选等方面。
绿色荧光蛋白(GFP) 的特性及其在分子生物学研究中 的应用
2 GFP 的光谱特性
❖ GFP吸收的光谱, 最大峰值为395nm(紫外)，并有一个峰值为470nm的副峰（蓝 光）；发射光谱最大峰值为509nm(绿光），并带有峰值为540nm的侧峰 （Shouder).GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,因此为荧光素 FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察。尽管450~490 nm(蓝 光)是GFP的副吸收峰,但由于长波能量低,细胞忍受能力强,因此更适合于活体检 测。Chroma技术公司(Chroma Technology Corp.Brattlebore,VT 05301,USA)已 研制出一系列适合于GFP观察的滤光片组合。利用重组突变[10,11,12]和数字联 想分光显微镜( Digital ImagingSpectroscopy)技术[13,14,15]可以诱发GFP色基 突变,改变GFP光谱特性。Heim R等[16,17]获得了野生型GFP的一系列随机突变, 其激发波长和发射波长都发生了变化(表1)。如获得的蓝色荧光突变,就是原GFP 分子中第66个氨基酸由酪氨酸突变成的组氨酸,但荧光信号减弱了近50%。 Delagrave S获得的红色漂移(Red-shifed)突变,与野生型GFP相比,其激发波长向 红色方向漂移了近100 nm[18]。具有不同光谱特性的GFP突变体的获得,使在同 一细胞中同时分析两种不同蛋白或启动子成为可能,可以用于发育细胞学、药物 筛选、分析诊断等研究。
❖ 体观察到GFP荧光,集中在细胞质或核周围部。紫外光下液 泡显蓝色荧光,蓝光下叶绿体显红色荧光,出现黄色荧光是叶 绿体红色荧光与GFP绿色荧光的重叠效果。HuW也报道,用 电击法和PEG法同时转化玉米和拟南芥菜(Arabidopsis)原生 质体,GFP在玉米原生质体中表达,但PEG介导比电击法转化 效率高,而拟南芥菜原生质体中未观察到GFP表达[33]。不过 Sheen J等利用基因枪(Microprojectile bombardment)轰击 拟南芥菜完整叶片和根组织,观察到活体GFP荧光。Niedz RP等用电击法转化甜橙(Citrus sinensis)原生质体,450~490 nm蓝光下观察到20%~60%原生质体发生较强绿色荧光[34]。 此外,也有GFP在菸草、水稻中表达的报道。GFP在多种原 核和真核生物细胞中表达,表明GFP色基形成的翻译后修饰 过程并非需要原有水母(A.victoria)细胞中任何其它成份或共 因子。亦表明GFP作为报告基因,其表达不受生物类型、基 因型或细胞组织类型的限制,具有广泛的利用前景。
绿色荧光蛋白——结构及应用
生物制药与研究2017·08124Chenmical Intermediate当代化工研究绿色荧光蛋白——结构及应用＊孙艺佩（山东省实验中学 山东 250000）摘要：绿色荧光蛋白（GFP）有稳定、灵敏度高、无毒害、载体便于构建等优点，因此在各个领域已经有了广泛的应用，在细胞生物学与分子生物学领域中，基因常被用作一个报导基因作为生物探针，拿来映证某些假设的实验方法；在医学领域，常用利用绿色荧光蛋白观测肿瘤发生、生长和转移等过程。
本文就绿色荧光蛋白的发现与应用背景、结构、生色机理、相对于其他荧光分子的优点和在各领域的应用进行了综述。
关键词：绿色荧光蛋白（GFP）；荧光生色机理；生色团；技术应用中图分类号：Q 文献标识码：AGreen Fluorescent Protein——Structure and ApplicationSun Yipei(Experimental High School of Shandong Province, Shandong, 250000)Abstract ：Green fluorescent protein ( GFP ) has the advantages of stability, high sensitivity, no toxicity, easy construction and so on. Therefore,it has been widely used in various fields. In the field of cell biology and molecular biology, genes are often used as a reporter gene as a biological probe to show some hypothetical experimental methods. In the medical field, the green fluorescent protein is used to observe the process of occurrence, growth and metastasis of tumor. In this paper, the discovery and application background, structure, chromogenic mechanism, advantages compared to other fluorescent molecule and application in all fields of green fluorescent protein were reviewed.Key words ：green fluorescent protein (GFP)；fluorescent chromogenic mechanism ；chromophore ；application of technology引言绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）是一类能被蓝紫光激发而发出绿色荧光的蛋白，1962年，下村修等人于维多利亚管状水母中第一次发现并提取出了绿色荧光蛋白。
绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用
绿色荧光蛋白GFP的研究进展及应用绿色荧光蛋白的研究进展及应用姜丽摘要：源于多管水母属等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白(GFP)，是一种极具应用潜力的标记物，有着极其广泛的应用前景。
绿色荧光蛋白的发现具有划时代的重要意义，它不仅为当代生物学研究提供了极为实用的基本研究手段，并且在此基础上改造发展和发现了一些列荧光蛋白，扩展了应用范围。
现就 GFP的理化性质、荧光特性、改进和应用研究进行了综述。
关键词：荧光蛋白(GFP) ；荧光特性；进展；应用一、什么是绿色荧光蛋白(GFP)?发光是海洋无脊椎动物中普遍存在的现象，一些腔肠动物包括水母、水螅和珊瑚等受到机械性干扰时都可发射绿色荧光，而栉水母类发射蓝色荧光。
绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。
1962年Shimomura等首先从多管水母 (Aequoriavictoria) 中分离出一种分子量为20kD的称为 Aequorin的蛋白。
由于水母整体荧光及提取的蛋白质颗粒荧光都呈绿色，因此，人们将这种蛋白命名为绿色荧光蛋白。
随后，人们从不同动物体内提取出了各种不同的GFP，其中研究较为深入的是来自多管水母科(Aequorleidae)和海紫罗兰科 (Renillidae)的GFP，即AequoriaGFP和RenillaGFP。
二、GFP的理化性质、荧光性质及其进展2.1GFP的理化性质从水母体内分离到的GFP基因，长达2．6kD，由3个外显子组成，分别编码 69、98和 71个氨基酸。
GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白。
AequoriaGFP分子量约 27×l03，一级结构为一个由238个氨基酸残基组成的单链多肽；而 RenillaGFP是分子量为54kD的同型二聚体。
两种 GFP有不同的激发光谱，AequoriaGFP在395nm具有最高光吸收峰，肩峰为473rim；RenillaGFP在498Bin具有强烈的光吸收，肩峰为470nin。
绿色荧光蛋白的结构、发光机制及其应用研究
绿色荧光蛋白的结构、发光机制及其应用研究
刘祖强;胡敏;齐义鹏
【期刊名称】《武汉大学学报：自然科学版》
【年(卷),期】2000(46)2
【摘要】源自水母的绿色荧光蛋白作为生物标记物有其独特优点 .近年来的研究揭示了其结构、发光特性和发光机制。
【总页数】4页(P211-214)
【关键词】绿色荧光蛋白;生物标记;应用;结构;发光机制
【作者】刘祖强;胡敏;齐义鹏
【作者单位】武汉大学生命科学学院病毒研究所
【正文语种】中文
【中图分类】Q510.1;Q510.2
【相关文献】
1.助熔剂种类对绿色荧光粉(Ce0.67,Tb0.33)MgAl11O19晶体结构、形貌及发光强度的影响 [J], 文小强;王林生;王玉香;周健;赖华生
2.绿色荧光蛋白的发光机制 [J], 王伟;刘祥林;李久蒂
3.绿色荧光蛋白GFP发光基团类似物的合成研究 [J], 梁霆;孙宇峰;周舒扬;陈静宇;郭祥峰
4.Ca_8Mg(SiO_4)_4Cl_2∶Eu^(2+),Ce^(3+),Mn^(2+)绿色荧光粉发光性能及其应用研究 [J], 刘永;周亚运;杨慧;张秋函;谭慧英;汪正良
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Ｈａｌｅ等。妇利用ＧＦＰ标记，研究了可溶性微管 蛋白ＦｔｓＺ与其内膜受体ＺｉｐＡ间的缔合作用．他们 将ＧＦＰ与ＺｉｐＡ融合，并用ＦｔｓＺ与之直接结合，通 过荧光检测发现，ＺｉｐＡ—ＧＦＰ融合蛋白在细胞壁缢 缩前和缢缩过程中均位于ＦｔｓＺ与膜相关的特殊环 中，说明ＺｉｐＡ—ＦｔｓＺ的相互缔合是细胞分裂必需 的．ＺｉｐＡ可能直接参与ＦｔｓＺ环的形成和功能．
与Ｈｅｉｍ等０１的结果一致．
３绿色荧光蛋白的结构
Ｙａｎｇ等０１的研究表明，ＧＦＰ是由两个相当规 则的内含一个ａ一螺旋和外面包围１１个肛折叠链的 ｝桶状结构（［］－ｂａｒｒｅｌ）组成的二聚体．ｐ桶状结构直 经约３ ｎｍ，高约４ ｎｒｌｌ．ａ一螺旋片段的一部分是修饰 的酪氨酸侧链．其顶部和底部是由小片段ｎ．螺旋形 成的“帽子”．Ｏｒｍｏ［１如等也独立地得出了类似的结 论，并认为｝桶状结构从Ｎ一末端始依次是三条反平 行的｝折叠链，中心的ａ一螺旋和另外三条反平行的 产折叠链（其中由第１１８位氨基酸残基至第１２３位 氨基酸残基组成的第三条链与Ｎ一末端由第１ １位氨 基酸残基至第１３位氨基酸残基组成的ｐ折叠链平 行），然后多肽主链穿过其底部形成该结构的另一 半，即由五个｝折叠链组成的希腊花边基元（Ｇｒｅｅｋ ｋｅｙ ｍｏｔｉｆ），其顶部和底部分别是由三个和一个扭 曲的短ｎ一螺旋覆盖．
生万物，方进数行据生态学规律研究．Ｌｅｆｔ等“７］用ＧＦＰ标记
遗传工程微生物以监测其在水环境中的存活和去 向．朱应等［１”构建了带ｇｆｐ基因的重组棉铃虫病 毒．该病毒一次感染棉铃虫后不再重复感染，室内 饲养３代，各代均可见典型的发绿色荧光的棉铃虫， 表明病毒可以介导ＧＦＰ标记其宿主，预计将为研究 棉铃虫的迁飞和暴发规律提供强有力的手段．
收稿日期：１９９９—１２—０７
ｔ通讯联系人
荛喜器：易翥蠢苗茹妻踌：矬蹴翻磊黪器貉瓣掣２。０４’
万方数据
武汉大学学报（自然科学版）
第４６卷
拶。
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包含体
ＯＨ
图１ ＧＦＰ生色基团化学结构及其生物合成示意图
２～２３２个氨基酸对维持发光特性是必需的．截短 Ｃ一末端７个以上氨基酸或Ｎ一末端两个以上氨基酸， 则荧光全部丢失．但Ｈｅｌｍ等［２３的研究表明去掉了 ｃ一末端１２个氨基酸的ＧＦＰ基因与ＨＣＶ Ｃｏｒｅ抗原 基因融合，融合蛋白的荧光光谱与强度均无变化，最 大发射渡谱变宽（４９０～５１０ ｎｍ）．岳莉莉等嘲将 ＧＦＰＳ６５Ｔ Ｃ一端分别截短１２个氨基酸和７５个氨基 酸，发现截短１２个氨基酸时，对荧光特性无明显的 影响．但截短７５个氨基酸后，激发波长更短（３６０ ｎｍ），荧光微弱．她们表达的ＧＦＰ／ＨＢＶｅ抗原和 ＧＦＰ／ＨＣＶｃ抗原两种双功能融合蛋白的荧光特性
Ｃｈａｌｆｉｅ等ｎ１于１９９４年率先在大肠杆菌和线虫 中表达ＧＦＰ，随后在酵母、果蝇、Ｈｅｌａ细胞、植物、转 基因鼠、昆虫细胞等中表达成功．这些研究表明 ＧＦＰ的生色基团（Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）在异源细胞中可自 发形成，其发光无需任何特殊的辅助因子参加．
ＧＦＰ有两个缺点：１）有两个激发峰影响了其特 异性；２）长波激发峰强度较小，不易观察．Ｈｅｉｍ
５ 绿色荧光蛋白基因的应用
ＧＦＰ分子量小，能够在异源细胞中稳定表达并 发射荧光，不需要任何辅助因子参加，对细胞没有毒 性，因而得到广泛应用．
１）作为报道基因构建基因工程载体 常用的质粒克隆载体的报道基因如ＬａｃＺ，是利 用酶促催化反应，需要加入外源底物和诱导物（如
第２期
刘祖强等；绿色荧光蛋白的结构，发光机制及其应用研究
Ｃｕｈｉｔｔ等口３认为生色基团自身环化的驱动力来 自蛋白质三维结构的形成，由此Ｋｏｌｂ等“３提出一个 假说，即环化在新合成的多肽的折叠过程中进行． ＧＦＰ被包含体捕获后即完全失去形成生色基团的 能力，因为此时新合成的ＧＦＰ不可能正确折叠．
为了确定ＧＦＰ荧光发射中需要分子的哪些部 分，Ｄｏｐｆ等”１构建了ＧＦＰ Ｎ ｒ末端和Ｃ一末端部分缺 失的表达载体．通过表达和检测发现，ＧＦＰ的
ＩＰＴＧ，Ｘ—ｇａｌ），不仅操作繁琐且价格昂贵．李寿东 等Ｈｚ］构建了以ｇｆｐＳ６５Ｔ基因作为筛选标记的新型 克隆载体，建立了以绿／白斑筛选法筛选阳性重组子 的新方法，替代ＬａｃＺ蓝／白斑筛选，不需Ｘ—ｇａｌ，经 济，简单可行．
２）目的基因的功能研究 将目的基因与ｇｆＰ基因连接后，通过观测融合 蛋白的荧光特性研究其表达和功能．哺乳动物细胞 表达两种ＤＮＡ拓扑酶．该酶的Ｎ一末端和中部结构 域序列高度保守，而其ｃ一末端结构域（ｃ—ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ，ＣＴＤ）具有种属特异性．为了确定体内核 定位是否仅有ＣＴＤ参与就可完成，Ａｄａｃｈｉ等［１”将 Ｃ一末端基因与ｇｆｐ基因连接，并在ＧＡＬｌ启动子驱 使下在酵母细胞中表达．通过检测ＧＦＰ信号，发现 两种拓扑酶的ＣＴＤ均得到表达，而且拓扑酶Ｉ— ＧＦＰ仅在细胞的有丝分裂期发现，拓扑酶Ｉ—ＧＦＰ 主要出现于细胞分裂间期．结果说明，拓扑酶的 ＣＴＤ即足以充当核定位的信号． ３）蛋白质缔合作用研究
４）病原体与其宿主关系的研究 将病原体用ＧＦＰ活体标记，可以在全真条件而 不是模拟条件下实时研究病原体与其宿主的关系． Ｃａｓｐｅｒ等ｏ”将ｇｆｐ基因插入ＴＭＶ基因组，体外转 录获得感染性ＲＮＡ，并以之接种烟叶．观察发现， ＴＭＶ在接种点和整个植株均可表达ＧＦＰ．持续观 察ＧＦＰ的出现情况，发现整株感染时ＴＭＶ以两种 方式运动：细胞间慢的传播，伴随病毒复制的ｇｆＰ表 达；维管介导的快速转运，病毒不复制，ｇｆＰ不表达． Ｂａｒｒｅｔｔ等ｏ“将ｇｆＰ克隆于苜蓿银纹夜蛾核型多角 体病毒（ＡｃＭＮＰＶ）的多角体启动子下游，发现感染 ２４ ｈ后在昆虫的中肠上皮细胞和血细胞中发现绿 色荧光，表明在这些组织中病毒复制表达了极晚期 蛋白．随后的感染发生在整个体腔的气管细胞，并 进而发生在其它组织． ５）ＧＦＰ基因在生态学中的应用 将ｇｆＰ直接导入目标生物或将ｇｆＰ克隆到病 毒、细菌或质粒上，通过它们的介导而间接标记目标
参考文献：
［１］Ｃｈａｌｆｉｅ Ｍ，Ｔｕ Ｙ，Ｅｕｓｋｉｒｅｈｅｎ Ｇ，ｅｔ“．Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｒｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ Ａ Ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓ—
ｓｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４，２６３（５１４８）：８０２—８０４．
［２３ Ｈｅｌｍ Ｒ，Ｃｕｂｉｔｔ Ａ Ｂ．Ｔｓｉｅｎ Ｒ Ｙ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｇｒｅｅｎ
生成的． 生色基团位于螺旋中部，距桶状结构的几何中
心不到０．２ ｒｉｍ，在其周围是极性和非极性的氨基酸 侧链．Ｐｈｅ６４和Ｐｈｅ４６在生色基团附近将Ｔｒｐ６３与 生色基团分开，使生色基团得到保护．
ｃ一末端的环状结构位于桶状结构外，其最后的 约７个氨基酸呈无序排列．这些氨基酸残基不形成 “桶片”，故其缺失不影响荧光特性．Ｎ一末端是桶状 结构末端的“帽子”，故其缺失会引起荧光的丢失．
４ 绿色荧光蛋白的发光机制
Ｙｏｕｖａｎ等ｒ１－３提出了ＧＦＰ荧光发生机制的简
单模型．这个模型中，在高ｐＨ或在生色基团附近
引入突变时，假定Ｔｙｒ６６处于酚盐形式ｉ在低ｐＨ
下，则处于酚羟基形式（图２）．
ｏ
Ｏ
二生－０
十Ｈ
图２绿色荧光蛋白发光机制示意图 生色基团通过Ｔｙｒ６６的脱质子状态（酚盐）和 质子化状态（酚羟基）的转换决定荧光发射．由于酚 的激发态酸性远大于其基态，故仅脱质子态的结构 发射荧光． 此模型为Ｙａｎｇ等［９３的晶体学证据所支持．
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ⅳ４ｔｕｒｅ，１９９５，３７３（６５１６）：６６３ ６６４．
［３］Ｃｒａｍｅｒｉ Ａ，Ｗｈｉｔｅｈｏｒｎ Ｅ Ａ，Ｔａｔｅ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ·１９９６，１４（３）：
等…利用点突变使Ｓｅｒ６５突变为Ｔｈｒ６５，结果荧光 强度比野生型增加４～６倍，吸收波长和发射波长分 别增至４９０ ｎｍ和５１０ ｎｍ．Ｃｒａｍｅｒｉ等…用ＤＮＡ改 组（ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）获得一个荧光强度比野生型大 ４２倍的突变体．
２ 绿色荧光蛋白的生色基团
ＧＦＰ的生色基团由位于第６５～６７位的３个氨 基酸：丝氨酸一脱水酪氨酸一甘氨酸形成的对羟基苯 咪唑啉酮（４－Ｐ—ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｅ一５一ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ）构成 （图１）．ＧＦＰ的生色基团是蛋白质自身催化环化的 结果．Ｈｅｉｍ等“］发现重组ＧＦＰ的发光特性需在有 分子氧存在的环境下才能出现．推测其生物合成过 程如图１所示．
争折叠彼此紧密结合，象桶板一样形成桶状结 构的外围，并且形成一个规则的氢键带．桶状结构 和位于其末端的短ａ一螺旋以及环状结构一起组成 一个单独的致密结构域，没有可供扩散的配体进入 的缝隙．这种坚实的结构保证了其稳定和抗热、抗
万变方性数剂据的特点，同时也解释了生色基团为什么只能
自身环化，因为酶是很难进入其内部催化生色基团
第４６卷第２期 ２０００年４月
武汉大学学报（自然科学版） Ｊ．Ｗａｈａｎ Ｕｎｉｖ．（Ｎａｔ Ｓｅｉ Ｅｄ）
文章编号：０２５３—９８８８（８０００）０８—０２１１－０４
ＶｏＩ．４６ Ｎｏ．２ Ａｐｒ．２０００，８１１～２１４
绿色荧光蛋白的结构、发光机制及其应用研究
刘祖强，胡 敏，齐义鹏＋
（武汉大学生命科学学院病毒研究所，武汉４３００７２）
ｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）中分离纯化的绿色荧光蛋白（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ），由于其作为生物标记物 的独特优点，受到众多学者的青睐，得到广泛的研究 和应用．
１ 绿色荧光蛋白的发光特性
绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）是从水母分离出的一种天 然荧光蛋白．分子量约２７×１０３，为一个由２３８个氨 基酸残基组成的单链多肽．其荧光发射峰在５０９ Ｄｉｌｌ，最大激发波长为３９５ ｎｍ，并在４７０ ｎｎｌ处有一 肩峰．ＧＦＰ的化学性质相当稳定，其变性需在９０℃ 或ｐＨ＜４．０或ｐＨ＞１２．０的条件下用６ｍｏｌ／Ｌ盐酸 胍处理．