绿色荧光蛋白的结构、发光机制及其应用研究

４ 绿色荧光蛋白的发光机制
Ｙｏｕｖａｎ等ｒ１－３提出了ＧＦＰ荧光发生机制的简
单模型．这个模型中，在高ｐＨ或在生色基团附近
引入突变时，假定Ｔｙｒ６６处于酚盐形式ｉ在低ｐＨ
下，则处于酚羟基形式（图２）．
ｏ
Ｏ
二生－０
十Ｈ
图２绿色荧光蛋白发光机制示意图 生色基团通过Ｔｙｒ６６的脱质子状态（酚盐）和 质子化状态（酚羟基）的转换决定荧光发射．由于酚 的激发态酸性远大于其基态，故仅脱质子态的结构 发射荧光． 此模型为Ｙａｎｇ等［９３的晶体学证据所支持．
６）ＧＦＰ基因在生物防治中的应用 目前生物农药的杀虫效果往往得不到准确评 估．Ｙｕ—ｃｈａｒｔ Ｃｈａｏ等［１ ９１用ＧＦＰ标记ＡｃＮＰＶ．通过 荧光观察，可以避免评估ＡｃＮＰＶ杀虫剂杀虫效果 时仅仅记录有典型感染症状的害虫个体而忽视无明 显感染症状但确实已经感染或正在感染的害虫个 体，同时无需进行分子生物学鉴定即可方便地区分 杀虫剂致死和天然病原致死，从而客观准确地评价 杀虫剂的毒力． ７）ＧＦＰ基因作为一种新型免疫标记物的探索 利用ＧＦＰ的发光特性使免疫反应呈绿色荧光 从而可以直接观察，可望取代传统的标记技术，建立 特异、灵敏、简便和快速的免疫诊断新方法．岳莉莉 等成功地实现了ｇｆｐ与ＨＢＶｅ抗原基因融合后在大 肠杆菌‘”３和昆虫细胞‘２１１中高效表达，得到既能发射 荧光又具有抗原性的双功能融合蛋白，为获得一种 新型发光免疫诊断试剂奠定了基础． 总之，ＧＦＰ作为一种新型的优良标记物，已广 泛应用于生物学的各个领域．相信对ＧＦＰ研究的 进一步深入，必将为ＧＦＰ的应用开辟更广阔的前 景．
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ⅳ４ｔｕｒｅ，１９９５，３７３（６５１６）：６６３ ６６４．
［３］Ｃｒａｍｅｒｉ Ａ，Ｗｈｉｔｅｈｏｒｎ Ｅ Ａ，Ｔａｔｅ Ｅ，ｅｔ ａ１．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ·１９９６，１４（３）：
４）病原体与其宿主关系的研究 将病原体用ＧＦＰ活体标记，可以在全真条件而 不是模拟条件下实时研究病原体与其宿主的关系． Ｃａｓｐｅｒ等ｏ”将ｇｆｐ基因插入ＴＭＶ基因组，体外转 录获得感染性ＲＮＡ，并以之接种烟叶．观察发现， ＴＭＶ在接种点和整个植株均可表达ＧＦＰ．持续观 察ＧＦＰ的出现情况，发现整株感染时ＴＭＶ以两种 方式运动：细胞间慢的传播，伴随病毒复制的ｇｆＰ表 达；维管介导的快速转运，病毒不复制，ｇｆＰ不表达． Ｂａｒｒｅｔｔ等ｏ“将ｇｆＰ克隆于苜蓿银纹夜蛾核型多角 体病毒（ＡｃＭＮＰＶ）的多角体启动子下游，发现感染 ２４ ｈ后在昆虫的中肠上皮细胞和血细胞中发现绿 色荧光，表明在这些组织中病毒复制表达了极晚期 蛋白．随后的感染发生在整个体腔的气管细胞，并 进而发生在其它组织． ５）ＧＦＰ基因在生态学中的应用 将ｇｆＰ直接导入目标生物或将ｇｆＰ克隆到病 毒、细菌或质粒上，通过它们的介导而间接标记目标
生成的． 生色基团位于螺旋中部，距桶状结构的几何中
心不到０．２ ｒｉｍ，在其周围是极性和非极性的氨基酸 侧链．Ｐｈｅ６４和Ｐｈｅ４６在生色基团附近将Ｔｒｐ６３与 生色基团分开，使生色基团得到保护．
ｃ一末端的环状结构位于桶状结构外，其最后的 约７个氨基酸呈无序排列．这些氨基酸残基不形成 “桶片”，故其缺失不影响荧光特性．Ｎ一末端是桶状 结构末端的“帽子”，故其缺失会引起荧光的丢失．
Ｈａｌｅ等。妇利用ＧＦＰ标记，研究了可溶性微管 蛋白ＦｔｓＺ与其内膜受体ＺｉｐＡ间的缔合作用．他们 将ＧＦＰ与ＺｉｐＡ融合，并用ＦｔｓＺ与之直接结合，通 过荧光检测发现，ＺｉｐＡ—ＧＦＰ融合蛋白在细胞壁缢 缩前和缢缩过程中均位于ＦｔｓＺ与膜相关的特殊环 中，说明ＺｉｐＡ—ＦｔｓＺ的相互缔合是细胞分裂必需 的．ＺｉｐＡ可能直接参与ＦｔｓＺ环的形成和功能．
Ｃｕｈｉｔｔ等口３认为生色基团自身环化的驱动力来 自蛋白质三维结构的形成，由此Ｋｏｌｂ等“３提出一个 假说，即环化在新合成的多肽的折叠过程中进行． ＧＦＰ被包含体捕获后即完全失去形成生色基团的 能力，因为此时新合成的ＧＦＰ不可能正确折叠．
为了确定ＧＦＰ荧光发射中需要分子的哪些部 分，Ｄｏｐｆ等”１构建了ＧＦＰ Ｎ ｒ末端和Ｃ一末端部分缺 失的表达载体．通过表达和检测发现，ＧＦＰ的
收稿日期：１９９９—１２—０７
ｔ通讯联系人
荛喜器：易翥蠢苗茹妻踌：矬蹴翻磊黪器貉瓣掣２。０４’
万方数据
武汉大学学报（自然科学版）
第４６卷
拶。
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包含体
ＯＨ
图１ ＧＦＰ生色基团化学结构及其生物合成示意图
２～２３２个氨基酸对维持发光特性是必需的．截短 Ｃ一末端７个以上氨基酸或Ｎ一末端两个以上氨基酸， 则荧光全部丢失．但Ｈｅｌｍ等［２３的研究表明去掉了 ｃ一末端１２个氨基酸的ＧＦＰ基因与ＨＣＶ Ｃｏｒｅ抗原 基因融合，融合蛋白的荧光光谱与强度均无变化，最 大发射渡谱变宽（４９０～５１０ ｎｍ）．岳莉莉等嘲将 ＧＦＰＳ６５Ｔ Ｃ一端分别截短１２个氨基酸和７５个氨基 酸，发现截短１２个氨基酸时，对荧光特性无明显的 影响．但截短７５个氨基酸后，激发波长更短（３６０ ｎｍ），荧光微弱．她们表达的ＧＦＰ／ＨＢＶｅ抗原和 ＧＦＰ／ＨＣＶｃ抗原两种双功能融合蛋白的荧光特性
ｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）中分离纯化的绿色荧光蛋白（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ），由于其作为生物标记物 的独特优点，受到众多学者的青睐，得到广泛的研究 和应用．
１ 绿色荧光蛋白的发光特性
绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）是从水母分离出的一种天 然荧光蛋白．分子量约２７×１０３，为一个由２３８个氨 基酸残基组成的单链多肽．其荧光发射峰在５０９ Ｄｉｌｌ，最大激发波长为３９５ ｎｍ，并在４７０ ｎｎｌ处有一 肩峰．ＧＦＰ的化学性质相当稳定，其变性需在９０℃ 或ｐＨ＜４．０或ｐＨ＞１２．０的条件下用６ｍｏｌ／Ｌ盐酸 胍处理．
（２６）：１２ ５０ｌ一１２ ５０４．
Ｉｓ］Ｃｕｂｉｔｔ Ａ Ｂ，Ｈｅｌｍ Ｒ，Ａｄａｍｓ Ｓ Ｒ，ｅｔ ａ１．Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ
ｉｎｇ，Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ａｎｄ wenku.baidu.comｓｉｎｇ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏ— ｔｅｉｎｓ．Ｔｒｅｎ出Ｂｉｏｃｈｅｍ ＳＣ／，１９９５，２０（１１）：４４８－４５５． ［６３ Ｋｏｌｂ Ｖ Ａ，Ｍａｋｅｙｅｖ Ｅ Ｖ，ｗａｒｄ ｗ Ｗ，ｅｔ ａ１．Ｓｙｎｔｈｅ—
Ｃｈａｌｆｉｅ等ｎ１于１９９４年率先在大肠杆菌和线虫 中表达ＧＦＰ，随后在酵母、果蝇、Ｈｅｌａ细胞、植物、转 基因鼠、昆虫细胞等中表达成功．这些研究表明 ＧＦＰ的生色基团（Ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）在异源细胞中可自 发形成，其发光无需任何特殊的辅助因子参加．
ＧＦＰ有两个缺点：１）有两个激发峰影响了其特 异性；２）长波激发峰强度较小，不易观察．Ｈｅｉｍ
ＩＰＴＧ，Ｘ—ｇａｌ），不仅操作繁琐且价格昂贵．李寿东 等Ｈｚ］构建了以ｇｆｐＳ６５Ｔ基因作为筛选标记的新型 克隆载体，建立了以绿／白斑筛选法筛选阳性重组子 的新方法，替代ＬａｃＺ蓝／白斑筛选，不需Ｘ—ｇａｌ，经 济，简单可行．
２）目的基因的功能研究 将目的基因与ｇｆＰ基因连接后，通过观测融合 蛋白的荧光特性研究其表达和功能．哺乳动物细胞 表达两种ＤＮＡ拓扑酶．该酶的Ｎ一末端和中部结构 域序列高度保守，而其ｃ一末端结构域（ｃ—ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ，ＣＴＤ）具有种属特异性．为了确定体内核 定位是否仅有ＣＴＤ参与就可完成，Ａｄａｃｈｉ等［１”将 Ｃ一末端基因与ｇｆｐ基因连接，并在ＧＡＬｌ启动子驱 使下在酵母细胞中表达．通过检测ＧＦＰ信号，发现 两种拓扑酶的ＣＴＤ均得到表达，而且拓扑酶Ｉ— ＧＦＰ仅在细胞的有丝分裂期发现，拓扑酶Ｉ—ＧＦＰ 主要出现于细胞分裂间期．结果说明，拓扑酶的 ＣＴＤ即足以充当核定位的信号． ３）蛋白质缔合作用研究
等…利用点突变使Ｓｅｒ６５突变为Ｔｈｒ６５，结果荧光 强度比野生型增加４～６倍，吸收波长和发射波长分 别增至４９０ ｎｍ和５１０ ｎｍ．Ｃｒａｍｅｒｉ等…用ＤＮＡ改 组（ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）获得一个荧光强度比野生型大 ４２倍的突变体．
２ 绿色荧光蛋白的生色基团
ＧＦＰ的生色基团由位于第６５～６７位的３个氨 基酸：丝氨酸一脱水酪氨酸一甘氨酸形成的对羟基苯 咪唑啉酮（４－Ｐ—ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｅ一５一ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ）构成 （图１）．ＧＦＰ的生色基团是蛋白质自身催化环化的 结果．Ｈｅｉｍ等“］发现重组ＧＦＰ的发光特性需在有 分子氧存在的环境下才能出现．推测其生物合成过 程如图１所示．
争折叠彼此紧密结合，象桶板一样形成桶状结 构的外围，并且形成一个规则的氢键带．桶状结构 和位于其末端的短ａ一螺旋以及环状结构一起组成 一个单独的致密结构域，没有可供扩散的配体进入 的缝隙．这种坚实的结构保证了其稳定和抗热、抗
万变方性数剂据的特点，同时也解释了生色基团为什么只能
自身环化，因为酶是很难进入其内部催化生色基团
与Ｈｅｉｍ等０１的结果一致．
３绿色荧光蛋白的结构
Ｙａｎｇ等０１的研究表明，ＧＦＰ是由两个相当规 则的内含一个ａ一螺旋和外面包围１１个肛折叠链的 ｝桶状结构（［］－ｂａｒｒｅｌ）组成的二聚体．ｐ桶状结构直 经约３ ｎｍ，高约４ ｎｒｌｌ．ａ一螺旋片段的一部分是修饰 的酪氨酸侧链．其顶部和底部是由小片段ｎ．螺旋形 成的“帽子”．Ｏｒｍｏ［１如等也独立地得出了类似的结 论，并认为｝桶状结构从Ｎ一末端始依次是三条反平 行的｝折叠链，中心的ａ一螺旋和另外三条反平行的 产折叠链（其中由第１１８位氨基酸残基至第１２３位 氨基酸残基组成的第三条链与Ｎ一末端由第１ １位氨 基酸残基至第１３位氨基酸残基组成的ｐ折叠链平 行），然后多肽主链穿过其底部形成该结构的另一 半，即由五个｝折叠链组成的希腊花边基元（Ｇｒｅｅｋ ｋｅｙ ｍｏｔｉｆ），其顶部和底部分别是由三个和一个扭 曲的短ｎ一螺旋覆盖．
参考文献：
［１］Ｃｈａｌｆｉｅ Ｍ，Ｔｕ Ｙ，Ｅｕｓｋｉｒｅｈｅｎ Ｇ，ｅｔ“．Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｒｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ Ａ Ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓ—
ｓｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４，２６３（５１４８）：８０２—８０４．
［２３ Ｈｅｌｍ Ｒ，Ｃｕｂｉｔｔ Ａ Ｂ．Ｔｓｉｅｎ Ｒ Ｙ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｇｒｅｅｎ
３１５—３１９．
［４］Ｈｅｌｍ Ｒ．Ｐｒａｓｈｅｒ Ｄ Ｃ，Ｔｓｉｅｎ Ｒ Ｙ．Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ Ｍｕｔａ—
ｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ａｕｔｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｔｅｅｎ Ｆｌｕ—
ｏｒｅｓｅｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｐｒｏｆｆ№“Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＷＡ，１９９４，９１
抽要：源自永母的绿色荧光蛋白作为生物标记物有其独特优点．近年来的研究揭示丁其结构、发光特性和
发光机制，并使之广泛应用于生物学的各个领域．
关键词：绿色荧光蛋白；生物标记｛应甩
中圉分类号：Ｑ ７８９
文献标识码：Ａ
生物发光现象在自然界并不鲜见．人类对生物 发光现象的研究也由来已久．近年来，从水母（Ａｅ—
生万物，方进数行据生态学规律研究．Ｌｅｆｔ等“７］用ＧＦＰ标记
遗传工程微生物以监测其在水环境中的存活和去 向．朱应等［１”构建了带ｇｆｐ基因的重组棉铃虫病 毒．该病毒一次感染棉铃虫后不再重复感染，室内 饲养３代，各代均可见典型的发绿色荧光的棉铃虫， 表明病毒可以介导ＧＦＰ标记其宿主，预计将为研究 棉铃虫的迁飞和暴发规律提供强有力的手段．
５ 绿色荧光蛋白基因的应用
ＧＦＰ分子量小，能够在异源细胞中稳定表达并 发射荧光，不需要任何辅助因子参加，对细胞没有毒 性，因而得到广泛应用．
１）作为报道基因构建基因工程载体 常用的质粒克隆载体的报道基因如ＬａｃＺ，是利 用酶促催化反应，需要加入外源底物和诱导物（如
第２期
刘祖强等；绿色荧光蛋白的结构，发光机制及其应用研究
第４６卷第２期 ２０００年４月
武汉大学学报（自然科学版） Ｊ．Ｗａｈａｎ Ｕｎｉｖ．（Ｎａｔ Ｓｅｉ Ｅｄ）
文章编号：０２５３—９８８８（８０００）０８—０２１１－０４
ＶｏＩ．４６ Ｎｏ．２ Ａｐｒ．２０００，８１１～２１４
绿色荧光蛋白的结构、发光机制及其应用研究
刘祖强，胡 敏，齐义鹏＋
（武汉大学生命科学学院病毒研究所，武汉４３００７２）