光谱分析技术hu

▪ 增色效应（hyperchromic effect）:核酸变性或降 解，使得DNA或RNA溶液对紫外光的吸收明显增加 ，即 ε值（吸光系数或称消光系数）显著升高，此 现象称为增色效应。此效应是由于碱基之间电子相 互作用的改变所致，通常在260nm处测量。
▪ 减色效应（hypochromic effect）:在一定的条件 下，变性的核酸又可以复性，此时ε值又明显减少， 回复到原来的核酸分子ε值较低的水平，即此时 DNA或RNA溶液的紫外光吸收显著降低，此现象称 为减色效应，此效应也是由于碱基之间电子相互作 用的变化所引起的，通常在260nm条件下测量。
▪ λmax是化合物中电子能级跃迁时吸收的特征 波长，不同物质有不同的最大吸收峰，所以 它对鉴定化合物极为重要。吸收光谱中， λmax、λmin、肩峰以及整个吸收光谱的形状 决定于物质的性质，其特征随物质的结构而 异，所以是物质定性的依据。
▪ 测定某物质的紫外吸收光谱的曲线，可与已 知标准的紫外光谱图相对照，对照时须注意 测定的条件，如溶剂、浓度等。
▪ 可见光、紫外光吸收光谱，是由于分子中联 系较松散的价电子被激发产生跃迁从而吸收 光辐射能量形成的，即分子由基态变为激发 态，电子由一个低能级的轨道（即成键轨道 ），吸收了光能量跃迁到高能级轨道（称为 反键轨道）。
▪ 若逐渐改变照射某物质的入射光的波长，并 测定物质对各种波长光的吸收程度（吸光度 “A”或光密度“O.D”）或透射程度（透光 度“T”），以波长λ作横坐标，“A”或 “T”为纵座标，画出连续的“A~λ”或 “T~λ”曲线，即为该物质的吸收光谱曲线。
），反之则所吸收的光的频率愈低（即波长愈长）。由于吸
收是不连续的，因此在光的一定部位出现一系列吸收暗带。
因为分子转动、振动及电子能级跃迁的能量差别较大，因此
，它们的吸收光谱出现在不同的光谱区域。分子转动能级级 差小，△E＜0.05电子伏特（ev），分子转动光谱的吸收出 现在远红外或微波区。振动能级纵间的差别较大， E＝0.05 ～1.0 ev，振动光谱出现在中红外区。电子能级的级差更大 ， E＝1～20 ev，所以由电子跃迁得到的光谱出现在可见、 紫外或波长更短的光谱区。
▪ ⑴曲线上“A”处称最大吸收峰，它所对应的波长称 最大吸收波长，以λmax表示。
▪ ⑵曲线上“B”处有一谷，称最小吸收，它所对应的 波长，所对应的波长，称最小吸收波长，以λmin 表 示。
▪ ⑶曲线上在最大吸收峰旁边有一小峰“C”，称肩峰 。
▪ ⑷在吸收曲线的波长最短的一端，曲线上“D”处， 吸收相当强，但不成峰形，此处称为末端吸收。
第一节 朗伯-比尔（Lambert-beer）
1.1 朗伯-比尔（Lambert-beer）光吸收定律：
Alg 1 lg I0
T
It
✓A：吸光度，又称光密度“OD”
Leabharlann Baidu✓T：透光度， T＝I / I0 ✓I0：照射到吸收池上的光强 ✓It：透过吸收池的光强。
1.2 吸光度、溶液浓度及液层厚度之间关系：
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▪ 光是电磁波，可用波长“λ”表示，电磁波谱是由不 同性质的连续波长的光谱所组成，对于生物化学来 说，最重要的波长区域是可见光和紫外光。
▪ 光的波长是二个相邻的波峰之间的距离。
▪ 光的传播是由相互垂直的电场分量“E”和磁场分量 “H”所构成。
▪ λ＝C/ν
▪ λ——波长 C——光速 ν——频率，单位时间通过 一个定点的波数。
紫外可见吸收光谱的形成
▪ 按照量子力学原理，分子能态按一定的规律 跳跃式地变化，物质在入射光的照射下，分 子吸收光时，其能量的增加是不连续的，物 质只能吸收一定能量的光，吸收光的频率和 两个能级间的能量差要符合下列关系：
▪ E＝E2- E1＝h
▪ E1、E2分别表示初能态和终能态的能量，初能态与终能态 之间的能量差愈大，则所吸收的光的频率愈高（即波长愈短
常用的术语
▪ 紫外光谱中常用的术语有发色团、助色团、增色效应和减色 效应。
▪ 发色团：凡是与饱和碳氢化合物连接能引起n→π*、π→π* 、 n→σ* 等电子跃迁的基团称为发色团。例如：C＝C、C＝ O等发色团。
▪ 助色团：助色团是一些具有非共价键的基团（如OH、NH2 、SH等）。这些基团在波长＞200 nm处没有吸收，当它与 发色团相连接时，使发色团的吸收带向长波移动，称为红移 （或浅色效应），红移的同时吸收带的强度增加。若助色团 与发色团相连接，产生 n→π* 跃迁，使吸收波长向短波移 动，称为兰移（或深色效应）。
▪ 常用标准的紫处吸收光谱是萨德勒研究实验 公司编制的“Sadtler”紫外标准图谱集，到 七十年代末为止已收集28585个化合物紫外
光谱图，此外还有药物和非极性溶剂紫外光 谱图2000多幅。
▪ 由于化合物紫外吸收峰较少，而且峰形都很 宽，不象红外光谱是许多指纹峰，所以在用 紫外吸收光谱进行化合物定性鉴定时，应注 意：化合物相同，其紫外光谱应完全相同； 但是紫外光谱相同不一定化合物就相同，可 能仅是存在某些相同的发色团或基团，因此 在鉴定时应与红外光谱相结合。
A =εbC
✓ ε：摩尔吸光系数或克分子吸光系数，L·mol-1·cm-1 ✓ b：样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收地。 ✓ C：样品浓度，mol·L-1 ✓ 摩尔吸光系数ε是物质对某波长的光的吸收能力的量度。ε越大，吸收光
➢ 有色溶液对可见光线有选择性的吸收作用，有些无色溶
液，所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。
➢ 不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力
也不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。
➢ 利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱， 利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的
方法，称为分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称 为分光光度计。
➢ 分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广。
第二章 光谱分析技术
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节
朗伯-比尔（Lambert-beer）光吸收定律 分光光度计基本结构 光度法的误差 分光光度法的应用 原子吸收分光光度法 荧光分析法 散射光谱分析法