组织非特异性碱性磷酸酶活力的原位红外光谱检测-19届福州

收稿日期：2016-04-30 修订日期: xxxx

基金项目：国家自然科学基金委项目（21373101）、吉林省教育厅“十三五”科研项目（2016137）、吉林化工学院博士启动基金（2016002）资助。作者简介：任重远，原吉林大学博士生；现工作于吉林化工学院讲师 *通讯联系人E-mail: yqwu@

组织非特异性碱性磷酸酶活力的原位红外光谱检测

任重远1, 3，Saida Mebarek 2，René Buchet 2，吴玉清3*

1

吉林化工学院生物与食品工程学院，吉林，132022

2

Laboratory ODMB UMR 5246, UniversitéLyon I, Villeurbanne France 69622

3

吉林大学超分子结构与材料国家重点实验室，长春，130012

摘要 本文以孵育17天的小鸡胚胎中，富含组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)的细胞外微结构——基质囊泡(MVs)作为研究模型，利用焦磷酸盐(PP i )作为TNAP 酶的天然底物，在近生理条件下，以红外(IR)光谱为监测工具，原位检测MVs 水解PP i 的反应过程，根据红外谱图特征吸收峰的变化，计算TNAP 酶活力值。

关键词：基质囊泡；生物底物；IR 光谱；原位检测；酶活力 中图分类号：O657.3 文献标识码：A 文章编号：

组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)是人体骨骼矿化形成的生物标志物，其酶活力的高低能够直接反映矿化形成能力的强弱。目前，测试TNAP 酶活力的主要方法是利用其外源性荧光底物——4-硝基苯磷酸(p -NPP)、在碱性条件下(pH=10.4)监测405 nm 处荧光强度来检测TNAP 的酶活力值。但是，这种测试条件与人体生理环境下的pH 值相距甚远。因此，开发一种在生理条件下、以生理化合物作为检测底物的快速、经济的检测碱性磷酸酶活性的方法，将作为热点研究。在骨骼中，具有矿化能力的成骨细胞、成牙细胞以及肥大的软骨细胞等，能够将含有高TNAP 活性表达的基质囊泡（MVs ）释放至细胞外环境中，并从而引发矿化形成[1]；MVs 是细胞外微观结构，能够为无机磷酸离子及钙离子提供沉积位点，是矿化产物羟磷灰石（HA ）晶体形成的场所，因此MVs 也可视为新骨骼产生矿化的基本单位[2]。本文选择孵育17天的小鸡胚胎中所提取并纯化的细胞外微结构——基质囊泡(MVs)，并将其作为研究模型，红外光谱技术为检测工具，利用焦磷酸盐(PP i )作为TNAP 酶的天然底物，在近生理条件下，监测MVs 水解PP i 的反应过程。同时，根据红外谱图特征吸收峰的变化，计算TNAP 酶活力值。

PP i 作为TNAP 酶的底物，水解过程中产生2个无机磷酸盐(P i )分子，因此，我们首先对反应过程中的反应物(PP i )及产物(P i )进行红外表征。实验结果显示，在红外指纹区(1300-900 cm -1)，相同浓度(50 mM)的PP i 与无

P i 的红外光谱谱图存在明显的差异，而且它们相互之间不发生重叠。PP i 在1107 cm -1位置存在一个明显特征峰，而P i 在1076及990 cm -1分别存在两处明显的吸收峰，这是由于磷酸盐分子中HPO 42-反对称伸缩振动与对称伸缩振动所引起的[3]。

在37 °C ，pH 8.0反应条件下，利用红外光谱技术对MVs 水解PP i 过程实时监测，每隔5min 红外扫描一次，并持续60分钟。红外光谱检测结果显示，4000-1300 cm -1的光谱范围在整个水解过程中并未明显特征峰的变化。然而，在1300-900 cm -1的红外区域内却发生了明显的特征峰的变化(Fig.1)。

Fig. 1 Difference IR spectra of MVs with PP i (spectrum recorded at the indicated time minus that recorded immediately). Significant variation in the intensity of

absorption bands of PP i located at 1120-1100 cm-1 as well as other variations attributed to P i at 1075-1080 cm-1and 990 cm-1 were observed.

如红外差谱结果所示(Fig.1)，在60分钟反应内，作为底物的PP i在1107 cm-1处不但发生了明显的强度减弱，还产生了一定的红移(1120 cm-1)；与此同时，P i在1070-1080 cm-1范围内及990 cm-1位置的红外吸收峰强度随时间逐渐升高。PP i在1120 cm-1产生负吸收峰，而P i在1076 cm-1及990 cm-1两处同时产生正吸收峰。这说明，MVs能够有效水解PP i并同时产生其水解产物P i。这种连续、动态的反应过程，通过红外光谱监测能够很清晰地展示出来。基于以上实验结果，我们对TNAP酶活力进行分析。利用1100-1120 cm-1、1070-1080 cm-1及990 cm-1三处红外特征吸收峰的变化，根据Beer-Lambert 定律(A = ε⋅l⋅C)，我们可以利用光吸收强度的变化，计算出水解反应过程中反应物及产物的浓度变化，而单位时间内反应物及产物的浓度变化，即反映了TNAP水解能力(酶活力值)。通过对反应物PP i及水解产物P i的摩尔吸光系数的计算，我们获得了不同蛋白浓度MVs下TNAP酶活力的比活值(Table. 1)。(ε-PPi-1107= 2158 ± 211 M-1.cm-1, ε-Pi-1080= 1215 ± 131 M-1.cm-1, ε-Pi-990= 443 ± 50 M-1.cm-1)

Table. 1Specific activities of TNAP in the different concentration of MVs.

MVs

mg/mL

Specific Activity

U/mg

1 1.484

1.5 1.368

2 1.566

2.5 1.83

然而，原位红外检测TNAP酶活力方法在实际应用过程中仍存在局限性。例如，以α-G-1-P、β-GP等生物底物进行水解时，峰位选取不准确和谱带重叠将给酶活力的测试结果带来偏差。因此，将数据进行二维相关分析[4]，可对计算结果校准改进。

参考文献

[1] Anderson HC. The role of matrix vesicles in physiological and pathological calcification.Curr Opin

Orthop.2007 18, 428.

[2] Anderson HC, Garimella R, Tague SE. The role of matrix vesicles in growth plate development and

biomineralization. Front Biosci. 2005 10, 822.

[3] Ren ZY, Do LD, Bechkoff G, et al Direct determination of phosphatase activity from physiological substrates

in cells. PLoS One. 2015,10, e0120087.

[4] Noda I, Ozaki Y, Two-dimensional correlation spectroscopy-applications in vibrational and optical

spectroscopy. Wiley Press, Chichester, 2004.

In Situ Infrared Spectroscopic Determination of Tissue Non-Specific Alkaline Phosphatase Activity

REN Zhongyuan1, 3,Saida Mebarek 2，René Buchet 2, WU Yuqing 3*

1.College of Biology and Food Engineering, Jilin Institute of Chemical Technology, Jilin 132022, China

boratory ODMB UMR 5246, UniversitéLyon I, Villeurbanne, 69622, France

3. State Key Laboratory of Supramolecular Structure and Materials, Jilin University, Changchun, 130012, China

Abstract In this work, we chose matrix vesicles as a modeling which extracted from femurs of 17-day-old chicken embryo chondrocytes was rich in tissue nonspecific alkaline phosphatase (TNAP). To assay TNAP activity, we demonstrated the ability of IR spectroscopy to directly determine in situ a phosphatase activity using natural substrates under near physiological condition.

Keywords Matrix Vesicles; Natural Substrate; Infrared Spectroscopy; In Situ Assay; Enzymatic activity * Corresponding author