第三章高效液相色谱分析

流动相极性和pH值的选择也对分离起重要作用
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相
3．操作条件
可增大分离选择性
GC：加温操作
HPLC：室温；高压（液体粘度大）
§3.2 影响液相色谱峰扩张及分离的因素
? 影响分离的因素与提高柱效的途径
? 在高效液相色谱中 , 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率 方程中的分子扩散项 B/u较小，可忽略不计，即：
阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化
十六烷基三甲铵作为对离子；
阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离
子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X- 进入流动相 后，生成疏水性离子对Y+ X -→在两相间分配。
第三章 高效液相色谱法
§3.1 高效液相色谱概述
? 高效液相色谱 ? High Performance Liquid Chromatography，HPLC ? 或高压液相色谱 ? High Pressure Liquid Chromatography ? 或高速液相色谱 ? High Speed Liquid Chromatography ? 是在经典的柱层析、薄层层析和气相色谱的基础上发展
起来
1、 HPLC与经典LC区别
? 主要区别： 固定相差别，输液设备和检测手段
区别 固定相差别
输液设备 检测手段 用途
LC HPLC
柱内径 1~3cm，固 常压输送 分析周期
定相粒径 > 100μm 流动相 ； 长、无法
且不均匀
柱效低 (H↑, 在线检测
n↓)
柱内径 2~6mm，固 高压泵 输 分析时间 定相粒径 <10μm 送流动相； 缩短、可 （球形，匀浆装柱） 柱效高 (H↓, 在线检测
?药物、农药、氨基酸、低聚核苷酸、肽和分子量较小的蛋白质 ?→应用面广
正相高效液相色谱
氨基柱 氰基柱
? 固定相是具有一定极性的填料
? 流动相是不同极性的混合溶剂，常以己烷或环己烷做 基础溶剂
为洗脱极性较强的溶质，往基础溶剂中加入具有一定极 性的溶剂如二氯甲烷、短链醇、四氢呋喃等
正相高效液相色谱主要用于分离易于水解的样品以及高 脂溶性样品（如甾醇类、磷脂类等，在水中几乎不溶）
正相（极性柱）与反相（非极性柱）的练习
正相色谱-低极性流动相
反相色谱-高极性流动相
正相色谱-中极性流动相
反相色谱-中极性流动相
溶质极性A>B>C
二、液-固吸附色谱 liquid- solid adsorption chromatograph
基本原理：各组分在固定相吸附剂上竞争性吸附与解吸
固定相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝等，较常使用的是 5～10μm的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 特点：适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具 有官能团的化合物和异构体有较高选择性；
对
挥发性、热稳定性限制
象
HPLC
分子量大、难气化、热稳定性差
及高分子和离子型样品均可检测
用途广泛，占有机物的80%
2 流
GC 惰性气体 组分与流动相无作用力，只与固定相作用
动
流动相种类较多，选择余地广
相 HPLC 液体
组分与流动相有相互作用力
为提高柱选择性、改善分离度增加 了可调控条件，对分离起很大作用
?
H=A+Cu
? 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。
? 液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低 传质阻力是提高柱效主要途径
?选低黏度流动相、适当降低柱温（降低黏度）但改善有限！
?改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。
p69- 70 H-u曲线
§3.3 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理
柠檬酸根的离子对色谱分离
Question：柠檬酸3-用离子交换色谱分离？ 柠檬酸3-在酸性条件下与磷酸三丁酸反应生成具有一定疏 水性络合物→用C-18柱分离→碱性条件下络合物解离。
ห้องสมุดไป่ตู้
n↑)
仅做为一 种分离手 段
分离和分 析
2、HPLC与GC差别
?相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 ?主要差别：分析对象、流动相及操作条件的差别
能气化、热稳定性好、且沸点较低样品
GC
高沸点、挥发性差、热稳定性差、离
子型及高分子化合物的样品不可检测
1 分
仅能分析有机物的20%
析
溶解后能制成溶液的样品，不受样品
一、液-液分配色谱 liquid- liquid partition chromatography
固定相与流动相均为液体（互不相溶） 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相
的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之， 流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。 正相与反相的出峰顺序相反？（具体顺序） 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失→较少采用；
化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到 硅胶（担体）表面的游离羟基上。
反相高效液相色谱
硅 胶 Si（CH2）n CH3
? 常在硅胶或有机聚合物（如甲基丙烯酸酯类、苯乙烯－二 乙烯基苯）作为基质，其上键合C-18或C-8烷基的非极性固 定相→ C-18柱
? 以极性强的水、甲醇、乙腈为流动相
? 1、液-液分配色谱 liquid- liquid partition chromatography ? 2、液-固吸附色谱 liquid- solid adsorption chromatography ? 3、离子对色谱 ion-pair chromatography ? 4、离子交换色谱 ion-exchange chromatography ? 5、离子色谱 ion chromatography ? 6、空间排阻色谱 steric exclusion chromatography
缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾
三、离子对色谱 ion-pair chromatograph
基本原理：离子对色谱法是分离分析强极性有机酸和有机碱
的极好方法。将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子 （对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成 疏水性离子对化合物，控制溶质离子的保留行为使其两相之 间进行分配；