重组子筛选与鉴定
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如用Tc，Cm，Ap等选择药物，观察和确定转化子时间不 宜过长13~16h为宜，否则会现假转化菌落。药物的自然降 解也出现假菌落。
（2）插入失活筛选法——利用质粒载体的双抗药性继续筛选
用（1）的筛选获得的大量转化子中同时包括需要的重组 子，也含有非必需的非重组子
方法：将Apr的转化子影印至含抗生素Tc的平板上。由于 外源DNA片段插入载体DNA的BamHI位点导致载体Tcr基 因失活，因此带选择的重组子含有Apr Tcs的遗传表型， 而非重组子则为AprTcr。
3. 形成噬菌斑筛选法
如果在重组过程中使用的是取代型λ-载体，则噬菌斑中的 λ-噬菌体即为重组子。因而空载的λ-DNA分子不能被包装， 难以进入受体细胞产生噬菌斑。
HPT酶能催化ATP上的磷酸集团转移至潮霉素分 子上，而使之失活，所以使用潮霉素基因作为报 告基因，可赋予转化植物细胞抗潮霉素的能力。
但潮霉素能够致瘤，因而操作时应慎重。
（6）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞
即核苷酸合成代谢酶基因缺失互补。 前已述及的植物转化子筛选的氯霉素乙酰转移酶
即重组子只能在Ap板上形成菌落，而不能在Tc板上形成 菌落，而非重组子在这两种平板上都能形成菌落，比较两 种平板上对应的转化子的生长状况，即可Ap板上挑出重 组子。
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
（1）根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子
②氯霉素：Cm，Cmp，含Cat基因的菌体能转译 氯霉素乙酰转酰基酶，使Cm乙酰化而失效。抗 Cm菌落的终浓度为30µg/ml，贮存液为34mg/ml 乙醇溶液。
③卡那霉素：Km，kan，含kan抗性基因的菌体 转译能修饰km的酶，阻碍Km对核糖体的干扰， 抗Km菌落的终浓度为5µg/ml，贮存液为25mg/ml 水溶液。
gus基因的3’端与其他结构基因连接产生的嵌合基 因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍有Gus活 性，利用组织化学分析等可以定位外源基因在不 同的细胞、组织和器官类型以及发育时期的表到 情况，这是其它报告基因所不及的。
② 新霉素磷酸转移酶（NPTⅡ）基因
新霉素与卡那霉素庆大霉素均属于氨基环醇类抗 生素，结构相似，能抑制原核细胞核糖体70s起始 复合物的形成，从而阻碍蛋白质的合成，抑制细 胞生长。
（1）根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子
挑选转化子菌落时，必须根据转化处理时对照处理组菌落 生长情况来定。
一般DNA对照组和感受态细胞对照组不应生长菌落，而 感受态细胞有效性对照组应长菌落，如其中一项不符，就 有出现假转化子菌落的可能，这样的菌落不宜作为转化子， 而用于进一步实验材料。
基因工程
第七节 重组子的筛选与鉴定
一、重组子的筛选
转化子：将导入外源DNA分子后能稳定存在的细 胞称为转化子。
重组子：含有DNA分子的转化子成为重组子。
1. 根据载体选择标记基因初步筛选转化子
一般的做法是将转 化处理后的受体细 胞接种在合适的选 克隆位点 择药物的培养基上 在最适生长温度条 件下培养一定时间， 根据菌落生长的状 况即可挑选出转化 子。
① β-葡萄糖酸苷酶（Gus）基因
例如，Gus能够催化裂解人工合成的底物4-甲基伞形花酮β-D-葡萄糖苷酸，产生荧光物质4-甲基伞形花酮，通过荧 光光度计进行定量测定。
Gus基因被广泛用于植物转化子筛选，尤其是在进行外源 基因瞬间表达系统中。
转基因番茄叶片
阴性对照
① β-葡萄糖酸苷酶（Gus）基因
Luc基因在植物细胞内正常表达，可用于监测各种启动子 活性，测定与Luc基因嵌合的目的基因的表达情况，也用 于调控序列和基因的组织特异性表达。
③ 荧光素酶（LUC）基因
特点：迅速，灵敏，成本低，不存在放射性同位 素对人体健康和环境生态危害，也无内源荧光产 生的背景干扰，故Luc是一种理想的报告基因。
有些载体在设计时，在筛选标记基因年前面加上 一段负调控序列，当插入失活该负调控序列时， 其下游的筛选标记基因才能表达。
（4）显色筛选法
常用的显色剂是x-gal(5-溴 4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。
具有完整的乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶、透过 酶和乙酰基转移酶，当培养基中存在诱导物IPTG（异丙 基-β-D-半乳糖苷）和x-gal时，可产生蓝色沉淀物，使菌 体成为蓝色，如果在载体DNA上组入lacZ部分缺失的片段 lacZ’，则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌株，则在含有 x-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落，而 lacZ’得到的转化子是白色菌落。
绿色荧光蛋白在395nm波长下被激发产生绿色荧 光，故可作为报告基因。其中水母gfp被广泛用于 筛选动植转化子。
⑥ 冠瘿碱（opine）合成酶基因
主要包括胭脂碱合成酶基因和章鱼碱合成酶基因。 在植物细胞中的表达产物可催化一些特殊反应，
通过电泳分离及菲醌荧光染料染色后，即可观察 到产物的生成。 用于转植物基因细胞的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
叩头虫和不同克隆的LUS表达的不同颜色荧光。
插入了萤火虫荧光素酶 基因的烟草
④ 抗除草剂bar基因
Bar基因编码PPT-乙酰转移酶（PAT），能解除 非选择性除草剂的毒性，从而使转基因植物细胞 产生对除草剂的抗性，故可作为报告基因进行正 向选择。
用于植物转基因研究工作。
⑤ 绿色荧光蛋白基因Gfp
不能与宿主β-半乳糖苷酶的C端进行α-互补→产生白色菌落。
（5）利用报告基因筛选植物转化细胞
报告基因：在植物转基因中，载体携带的选择标 记基因经常称为报告基因。
在有选择压力的情况下，可利用报告基因在受体 细胞内的表达而筛选转化细胞；同时，报告基因 可以和某些目的基因构成嵌合基因，通过报告基 因的表达了解目的基因的表达情况及推测基因调 控序列，常用的报告基因有抗生素抗性基因及编 码某些酶类或其它特殊产物的基因等。
②二氢叶酸还原酶(DHFR)基因
DHFR催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，dhfr突变 体细胞不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代 谢途径，故不能在常规培养基上生长。
但在常规培养基中加入次黄嘌呤和胸苷，则突变 体细胞可借助核苷酸的补救合成途径维持生长。
③黄嘌吟-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)基因
① β-葡萄糖酸苷酶（Gus）基因
Gus基因最早是从E.coli 12中克隆出来的，能编码稳定的 Gus产物。与抗生素抗性基因不同的是Gus基因并非正选 择标记。
作为报告基因的重要依据：作为一种水解酶，转化植物细 胞所产生的β-葡萄糖酸苷酶，能够催化某些特殊反应的进 行，通过荧光、分光光度和组织化学的方法对这些特殊反 应产物的检测，即可确定gus报告基因的表达情况，从而 区分是否是转化子。
（1）根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子
利用载体DNA分子上的抗药性选择标记基因进行 的筛选方法，多用于大肠杆菌转化子的筛选。
①氨苄青霉素：Ap或Amp，含bla基因的菌体能
转译β-丙酰氨酶，可降解Ap，抗Ap菌落的选择剂 为终浓度30~50ng/ml，贮存液为25mg/ml水溶液。
pBR322 4362bp
ori
克隆位点
(
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
)
1. 根据载体选择标记基因初步筛选转化子
选择培养基：是根据需要检测细胞的类型配制的 培养基，对于细菌受体细胞而言，通常用LB培养 基，在LB培养基上加入适量的某种选择药物即为 选择培养基。
选择药物：由载体DNA分子上携带的选择标记基 因所决定，多与标记基因的遗传表型相对应，主 要有抗菌素和显色剂等。
（1）根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子
④链霉素：Sm，Str，含Str抗性基因的菌体转译一种能修 饰Sm的酶，抑制Sm与核糖体的结合，抗Sm菌落的终浓 度为25µg/ml，贮存液为20mg/ml水溶液。
⑤四环素：Tc，Tet，含Tc抗性基因的菌体转译能改变细 胞膜的蛋白，防止Tc进入细胞后干扰细菌蛋白质的合成， 抗Tc菌落的终浓度为12.5~15.0µg/ml，含Tc培养基中不可 加Mg盐，因Mg 盐拮抗Tc，贮存液为12.5mg/ml乙醇-水溶 液，含Tc溶液与培养液均应在暗处存放。
缺点：受体细胞通常具有较高的非特异性磷酸转 移酶底物，筛选时假阳性序列较多， NPTⅡ酶活 一般是通过卡那霉素与[γ-32p]ATP的原位磷酸化 来检测。
③ 荧光素酶（LUC）基因
Luc是一种源于萤火虫的动物蛋白基因产物，能够催化生 物发生荧光反应。Luc在Mg2+的作用下，可与荧光素和 ATP底物反应，使荧光素转变为处于激活状态的氧化荧光 素，同时发射光子，利用荧光测定仪可快速检测，故可作 为报告基因 。
Npt基因编码序列来自大肠杆菌易位子Tn5，可催 化ATP上γ-磷酸基因转移到抗生素分子的某些基 因上，从而阻碍抗生素分子与靶位点的结合，并 使抗生素失活。
② 新霉素磷酸转移酶（NPTⅡ）基因
故在含有抗生素的培养基上培养植物转化材料， 仅有携带NPTⅡ基因的转化植物细胞才能活下来， 由此区分转化子与非转化子。 NPTⅡ基因在多数 转基因植物上应用广泛。
⑦ 氯霉素乙酰转移酶（Cat）基因
氯霉素可选择性的与原核生物细胞50s亚基结合， 抑制肽酰基转移酶活性，最终抑制细胞生长。
Cat基因可以催化乙酰辅酶A转乙酰基，使氯霉素 失活，故外源DNA与供转化的Cat基因能使转基 因植物具有抗氯霉素的能力。
⑧ 潮霉素磷酸转移酶（HPT）基因
潮霉素原是一种链霉素的产物，能与70s和50s核 糖体的结合来抑制多种原核、真核生物的生长。
2. 营养缺陷型检测法
根据目的基因在受体细胞中表达产物的性质，筛 选含目的基因的克百度文库子。
如果目的基因产物能够降解某些药物使菌株呈现 出抗性标记，或者基因产物与某些药物作用是显 色反应，则可根据抗性或颜色变化直接筛选含目 的基因的克隆子。
3. 形成噬菌斑筛选法
对于λDNA载体系统而言，外源DNA插入λ噬菌体 载体后，重组DNA分子大小必须在野生型λDNA 长度的75％～105％范围内，才可以在体外包装成 具有感染活性的噬菌体颗粒，转导受体菌，在培 养基上形成噬菌斑，未转导的受体菌继续正常生 长，而区分开来。
据转化的方法不同，转基因动物细胞的筛选方式 分为HAT选择法和共转化选择法两种。
① 胸腺激酶（TK）基因
HAT选择法的原理：
利用培养基中的叶酸类似物氨基喋呤（APT）阻 断细胞核苷酸的合成途径，启动以次黄嘌呤为底 物的补救合成途径。该途径不受APT的抑制，能 继续合成出所需核苷酸。
由于在HAT培养基中不加外源胸苷，通过TK酶 的作用，tk+细胞能以其为底物合成出TTP，故tk+ 细胞可以存活，而tk-细胞不能合成而死亡。
基因和新霉素磷酸转移酶基因也可用于哺乳动物 转基因细胞的筛选。此外还有以下方法：
① 胸腺激酶（TK）基因
胸腺激酶能把胸苷转化为胸苷磷酸，以保证核苷 酸的顺利合成，其编码基因（tk）几乎在所有的 真核细胞中都能有效表达，故tk可作为遗传选择 记号，来确定哺乳动物的基因转移，相应的受体 细胞为遗传表型的缺陷型。
XGPRT是由大肠杆菌某些基因编码的一种核苷酸 代谢酶，哺乳动物缺失此酶，但却存在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（ HGPRT ）。
XGPRT能有效地把黄嘌呤转化为黄苷-磷酸，并 最终形成鸟苷磷酸，而HGPRT只能利用次黄嘌呤 和鸟嘌呤，并最终形成黄苷-磷酸（IMP），据此 特性，可作为筛选哺乳动物基因转移的一种显性 选择记号。
（2）插入失活筛选法——利用质粒载体的双抗药性继续筛选
用（1）的筛选获得的大量转化子中同时包括需要的重组 子，也含有非必需的非重组子
方法：将Apr的转化子影印至含抗生素Tc的平板上。由于 外源DNA片段插入载体DNA的BamHI位点导致载体Tcr基 因失活，因此带选择的重组子含有Apr Tcs的遗传表型， 而非重组子则为AprTcr。
3. 形成噬菌斑筛选法
如果在重组过程中使用的是取代型λ-载体，则噬菌斑中的 λ-噬菌体即为重组子。因而空载的λ-DNA分子不能被包装， 难以进入受体细胞产生噬菌斑。
HPT酶能催化ATP上的磷酸集团转移至潮霉素分 子上，而使之失活，所以使用潮霉素基因作为报 告基因，可赋予转化植物细胞抗潮霉素的能力。
但潮霉素能够致瘤，因而操作时应慎重。
（6）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞
即核苷酸合成代谢酶基因缺失互补。 前已述及的植物转化子筛选的氯霉素乙酰转移酶
即重组子只能在Ap板上形成菌落，而不能在Tc板上形成 菌落，而非重组子在这两种平板上都能形成菌落，比较两 种平板上对应的转化子的生长状况，即可Ap板上挑出重 组子。
（3）插入表达筛选法——利用目的基因插入载体后能激活 标记基因而筛选
与（2）法相反，该法是利用外源目的基因插入特 定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行 转化子的筛选。
（1）根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子
②氯霉素：Cm，Cmp，含Cat基因的菌体能转译 氯霉素乙酰转酰基酶，使Cm乙酰化而失效。抗 Cm菌落的终浓度为30µg/ml，贮存液为34mg/ml 乙醇溶液。
③卡那霉素：Km，kan，含kan抗性基因的菌体 转译能修饰km的酶，阻碍Km对核糖体的干扰， 抗Km菌落的终浓度为5µg/ml，贮存液为25mg/ml 水溶液。
gus基因的3’端与其他结构基因连接产生的嵌合基 因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍有Gus活 性，利用组织化学分析等可以定位外源基因在不 同的细胞、组织和器官类型以及发育时期的表到 情况，这是其它报告基因所不及的。
② 新霉素磷酸转移酶（NPTⅡ）基因
新霉素与卡那霉素庆大霉素均属于氨基环醇类抗 生素，结构相似，能抑制原核细胞核糖体70s起始 复合物的形成，从而阻碍蛋白质的合成，抑制细 胞生长。
（1）根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子
挑选转化子菌落时，必须根据转化处理时对照处理组菌落 生长情况来定。
一般DNA对照组和感受态细胞对照组不应生长菌落，而 感受态细胞有效性对照组应长菌落，如其中一项不符，就 有出现假转化子菌落的可能，这样的菌落不宜作为转化子， 而用于进一步实验材料。
基因工程
第七节 重组子的筛选与鉴定
一、重组子的筛选
转化子：将导入外源DNA分子后能稳定存在的细 胞称为转化子。
重组子：含有DNA分子的转化子成为重组子。
1. 根据载体选择标记基因初步筛选转化子
一般的做法是将转 化处理后的受体细 胞接种在合适的选 克隆位点 择药物的培养基上 在最适生长温度条 件下培养一定时间， 根据菌落生长的状 况即可挑选出转化 子。
① β-葡萄糖酸苷酶（Gus）基因
例如，Gus能够催化裂解人工合成的底物4-甲基伞形花酮β-D-葡萄糖苷酸，产生荧光物质4-甲基伞形花酮，通过荧 光光度计进行定量测定。
Gus基因被广泛用于植物转化子筛选，尤其是在进行外源 基因瞬间表达系统中。
转基因番茄叶片
阴性对照
① β-葡萄糖酸苷酶（Gus）基因
Luc基因在植物细胞内正常表达，可用于监测各种启动子 活性，测定与Luc基因嵌合的目的基因的表达情况，也用 于调控序列和基因的组织特异性表达。
③ 荧光素酶（LUC）基因
特点：迅速，灵敏，成本低，不存在放射性同位 素对人体健康和环境生态危害，也无内源荧光产 生的背景干扰，故Luc是一种理想的报告基因。
有些载体在设计时，在筛选标记基因年前面加上 一段负调控序列，当插入失活该负调控序列时， 其下游的筛选标记基因才能表达。
（4）显色筛选法
常用的显色剂是x-gal(5-溴 4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)。
具有完整的乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶、透过 酶和乙酰基转移酶，当培养基中存在诱导物IPTG（异丙 基-β-D-半乳糖苷）和x-gal时，可产生蓝色沉淀物，使菌 体成为蓝色，如果在载体DNA上组入lacZ部分缺失的片段 lacZ’，则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌株，则在含有 x-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落，而 lacZ’得到的转化子是白色菌落。
绿色荧光蛋白在395nm波长下被激发产生绿色荧 光，故可作为报告基因。其中水母gfp被广泛用于 筛选动植转化子。
⑥ 冠瘿碱（opine）合成酶基因
主要包括胭脂碱合成酶基因和章鱼碱合成酶基因。 在植物细胞中的表达产物可催化一些特殊反应，
通过电泳分离及菲醌荧光染料染色后，即可观察 到产物的生成。 用于转植物基因细胞的筛选。
蓝－白筛选示意图
蓝-白筛选
利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选带重组质粒的细菌。
载体：编码β-半乳糖 苷酶N端序列
（IPTG 存在下）
宿主： 编码β-半乳糖 苷酶C端序列
α-互补
细菌表达： β-半乳糖苷酶活性↑
5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落
当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→
叩头虫和不同克隆的LUS表达的不同颜色荧光。
插入了萤火虫荧光素酶 基因的烟草
④ 抗除草剂bar基因
Bar基因编码PPT-乙酰转移酶（PAT），能解除 非选择性除草剂的毒性，从而使转基因植物细胞 产生对除草剂的抗性，故可作为报告基因进行正 向选择。
用于植物转基因研究工作。
⑤ 绿色荧光蛋白基因Gfp
不能与宿主β-半乳糖苷酶的C端进行α-互补→产生白色菌落。
（5）利用报告基因筛选植物转化细胞
报告基因：在植物转基因中，载体携带的选择标 记基因经常称为报告基因。
在有选择压力的情况下，可利用报告基因在受体 细胞内的表达而筛选转化细胞；同时，报告基因 可以和某些目的基因构成嵌合基因，通过报告基 因的表达了解目的基因的表达情况及推测基因调 控序列，常用的报告基因有抗生素抗性基因及编 码某些酶类或其它特殊产物的基因等。
②二氢叶酸还原酶(DHFR)基因
DHFR催化二氢叶酸还原成四氢叶酸，dhfr突变 体细胞不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代 谢途径，故不能在常规培养基上生长。
但在常规培养基中加入次黄嘌呤和胸苷，则突变 体细胞可借助核苷酸的补救合成途径维持生长。
③黄嘌吟-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)基因
① β-葡萄糖酸苷酶（Gus）基因
Gus基因最早是从E.coli 12中克隆出来的，能编码稳定的 Gus产物。与抗生素抗性基因不同的是Gus基因并非正选 择标记。
作为报告基因的重要依据：作为一种水解酶，转化植物细 胞所产生的β-葡萄糖酸苷酶，能够催化某些特殊反应的进 行，通过荧光、分光光度和组织化学的方法对这些特殊反 应产物的检测，即可确定gus报告基因的表达情况，从而 区分是否是转化子。
（1）根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子
利用载体DNA分子上的抗药性选择标记基因进行 的筛选方法，多用于大肠杆菌转化子的筛选。
①氨苄青霉素：Ap或Amp，含bla基因的菌体能
转译β-丙酰氨酶，可降解Ap，抗Ap菌落的选择剂 为终浓度30~50ng/ml，贮存液为25mg/ml水溶液。
pBR322 4362bp
ori
克隆位点
(
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
)
1. 根据载体选择标记基因初步筛选转化子
选择培养基：是根据需要检测细胞的类型配制的 培养基，对于细菌受体细胞而言，通常用LB培养 基，在LB培养基上加入适量的某种选择药物即为 选择培养基。
选择药物：由载体DNA分子上携带的选择标记基 因所决定，多与标记基因的遗传表型相对应，主 要有抗菌素和显色剂等。
（1）根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子
④链霉素：Sm，Str，含Str抗性基因的菌体转译一种能修 饰Sm的酶，抑制Sm与核糖体的结合，抗Sm菌落的终浓 度为25µg/ml，贮存液为20mg/ml水溶液。
⑤四环素：Tc，Tet，含Tc抗性基因的菌体转译能改变细 胞膜的蛋白，防止Tc进入细胞后干扰细菌蛋白质的合成， 抗Tc菌落的终浓度为12.5~15.0µg/ml，含Tc培养基中不可 加Mg盐，因Mg 盐拮抗Tc，贮存液为12.5mg/ml乙醇-水溶 液，含Tc溶液与培养液均应在暗处存放。
缺点：受体细胞通常具有较高的非特异性磷酸转 移酶底物，筛选时假阳性序列较多， NPTⅡ酶活 一般是通过卡那霉素与[γ-32p]ATP的原位磷酸化 来检测。
③ 荧光素酶（LUC）基因
Luc是一种源于萤火虫的动物蛋白基因产物，能够催化生 物发生荧光反应。Luc在Mg2+的作用下，可与荧光素和 ATP底物反应，使荧光素转变为处于激活状态的氧化荧光 素，同时发射光子，利用荧光测定仪可快速检测，故可作 为报告基因 。
Npt基因编码序列来自大肠杆菌易位子Tn5，可催 化ATP上γ-磷酸基因转移到抗生素分子的某些基 因上，从而阻碍抗生素分子与靶位点的结合，并 使抗生素失活。
② 新霉素磷酸转移酶（NPTⅡ）基因
故在含有抗生素的培养基上培养植物转化材料， 仅有携带NPTⅡ基因的转化植物细胞才能活下来， 由此区分转化子与非转化子。 NPTⅡ基因在多数 转基因植物上应用广泛。
⑦ 氯霉素乙酰转移酶（Cat）基因
氯霉素可选择性的与原核生物细胞50s亚基结合， 抑制肽酰基转移酶活性，最终抑制细胞生长。
Cat基因可以催化乙酰辅酶A转乙酰基，使氯霉素 失活，故外源DNA与供转化的Cat基因能使转基 因植物具有抗氯霉素的能力。
⑧ 潮霉素磷酸转移酶（HPT）基因
潮霉素原是一种链霉素的产物，能与70s和50s核 糖体的结合来抑制多种原核、真核生物的生长。
2. 营养缺陷型检测法
根据目的基因在受体细胞中表达产物的性质，筛 选含目的基因的克百度文库子。
如果目的基因产物能够降解某些药物使菌株呈现 出抗性标记，或者基因产物与某些药物作用是显 色反应，则可根据抗性或颜色变化直接筛选含目 的基因的克隆子。
3. 形成噬菌斑筛选法
对于λDNA载体系统而言，外源DNA插入λ噬菌体 载体后，重组DNA分子大小必须在野生型λDNA 长度的75％～105％范围内，才可以在体外包装成 具有感染活性的噬菌体颗粒，转导受体菌，在培 养基上形成噬菌斑，未转导的受体菌继续正常生 长，而区分开来。
据转化的方法不同，转基因动物细胞的筛选方式 分为HAT选择法和共转化选择法两种。
① 胸腺激酶（TK）基因
HAT选择法的原理：
利用培养基中的叶酸类似物氨基喋呤（APT）阻 断细胞核苷酸的合成途径，启动以次黄嘌呤为底 物的补救合成途径。该途径不受APT的抑制，能 继续合成出所需核苷酸。
由于在HAT培养基中不加外源胸苷，通过TK酶 的作用，tk+细胞能以其为底物合成出TTP，故tk+ 细胞可以存活，而tk-细胞不能合成而死亡。
基因和新霉素磷酸转移酶基因也可用于哺乳动物 转基因细胞的筛选。此外还有以下方法：
① 胸腺激酶（TK）基因
胸腺激酶能把胸苷转化为胸苷磷酸，以保证核苷 酸的顺利合成，其编码基因（tk）几乎在所有的 真核细胞中都能有效表达，故tk可作为遗传选择 记号，来确定哺乳动物的基因转移，相应的受体 细胞为遗传表型的缺陷型。
XGPRT是由大肠杆菌某些基因编码的一种核苷酸 代谢酶，哺乳动物缺失此酶，但却存在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（ HGPRT ）。
XGPRT能有效地把黄嘌呤转化为黄苷-磷酸，并 最终形成鸟苷磷酸，而HGPRT只能利用次黄嘌呤 和鸟嘌呤，并最终形成黄苷-磷酸（IMP），据此 特性，可作为筛选哺乳动物基因转移的一种显性 选择记号。