第七章 分子发光分析法1

光源
电 源 稳压器
第一单色器
λex
样品液池
第二单色器
λex
负高压
光电倍增管
（PMT）
信号放大系统
数据处理及显示 （工作站系统）
图3.2 荧光分析基本装置方块示意图
（1）荧光激发光谱的测绘 激发光谱 测定激发光谱时，先固定第二单色器的波长，使 测定的荧光波长保持不变，后改变第一单色器的波 长由 200nm ～ 700nm 扫描。以显示系统测出的相对荧 光强度为纵坐标，以相应的激发光波长为横坐标作 图，所绘出的曲线就是该荧光物质的激发光谱。 激发光谱反映了激发光波长与测定荧光强度之 间的关系，为荧光分析选择最佳激发光提供依据。
2、荧光与分子结构
强荧光分子都具有大的共轭π键结构﹑供电子取 代基和刚性平面结构等，而饱和的化合物与只有孤立 双键的化合物，不呈现显著的荧光。 (1)共轭π键体系 最强且最有用的荧光物质多是 含有低能π-π*跃迁的有机芳香族化合物及其金属离 子配合物，电子共轭度越大，越容易产生荧光；环越 大，发光峰红移程度越大，发光也往往越强。 共轭环数相同的芳香族化合物，线性环结构的荧 光波长比非线性者要长.例如蒽和菲，后者为“角” 形结构，荧光峰位于350nm，而线性结构的蒽为400nm。
2、荧光发射光谱
荧光发射光谱简称荧光光谱 （1）荧光光谱的测绘 固定第一单色器波长，使激发光波长和强度保持 不变，后改变第二单色器波长，从 200nm ～ 700nm 进 行扫描，所获得的光谱就是荧光光谱。它表示在该 物质所产生的荧光中，各种不同波长组分的相对强 度，为进行荧光分析选择最佳测定波长提供依据。
O O
O
O
O
COO
COO
荧光素发荧光
酚酞不发荧光
有些物质的同分异构体有不同的荧光特性， 如1，2－二苯乙烯，反式是平面构型的强荧光物质， 顺式为非平面构型则不发荧光.如果非刚性配位体与 金属离子配位后变为平面构型，就可能出现荧光或荧 光加强.例如，8－羟基喹啉是弱荧光物质，在一定条 件下与Al 3+、Mg 2+等离子配位后荧光显著增强，从 而拓展了荧光分析的应用范围。
VR 5 4 3 S2 2 1 υ=0 IC
VR
ISC
激活
VR 4 3 T 2 2 0=υ 1
3 S1 2 υ= 0 1
4 3 2 1 υ=0
T1
VR VR R
S0
4 3 1 2 υ=0 λex
① λex
② ③ 荧光 延迟荧光
④ 磷光
⑤
图3.1分子荧光和磷光产生示意图
（3）延迟荧光 延迟荧光 , 其寿命与该物质的分子磷光相 当。不论何种荧光都是从S1态的最低振动能级 跃迁至 S0 态的各振动能级产生的 . 所以，同一 物质在相同条件下观察到的各种荧光其波长完 全相同（如图3.1 ③、④）只是发光途径和寿 命不同 . 延迟荧光在激发光源熄灭后，可拖后 一段时间，但和磷光又有本质区别，同一物质 的磷光波长总比发射荧光的波长长。
（2）荧光激发光谱的特性 ①第二单色器不论怎样改变固定波长，同一荧 光物质激发光谱的性质在其它条件一定时并不改变， 变化的只是曲线高低，即测定的灵敏度发生变化。 ②同一物质的最大激发波长与最大吸收波长一致 . 这是因为物质吸收具有特定能量的光而激发，吸收 强度高的波长正是激发作用强的波长。 实际上并不完全一致，因为激发光包含着光源 以及单色器的特性，荧光分光光度计并不能保证在 各波长处以完全相同的强度激发。
如果两个价电子的自旋方向相反，S=(1/2)+1/2=0，多重态M=1，该分子便处于单重态。 当两个电子的自旋方向相同时，M=3，分子处 于三重态。 基态为单重态的分子用S0表示。S0态的一个电 子受激跃迁到与它最近的较高分子轨道上且不改 变自旋，即成为单重第一激发态S1，当受到能量 更高的光激发且不改变自旋，就会形成单重第二 电子激发态S2。 如果电子在跃迁过程中改变了自旋方向，使分 子具有两个自旋平行的电子，则该分子便处于第 一激发三重态T1或第二激发三重态T2。
2、荧光与分子结构
表3.1中，苯和萘的荧光位于紫外区，蒽位于兰区、丁省位 于绿区、戊省位于红区，且均比苯的量子产率高。
Фf λex/λem(nm)
苯
萘 蒽 丁省
0.11
0.29 0.46
205/278
286/321 365/400
0.60 戊省 0.52
390/480 580/640
（2）刚性平面结构 强荧光物质的分子多 数具有刚性平面结构，这样，可以减少分子 自身的振动，并使分子与溶剂或其它溶质的 相互作用减少，降低了碰撞去激的可能性或 程度。
• 分子荧光和分子磷光属于光致发光，是由 两种不同发光机理过程中产生的。 • 普通荧光在光照停止后几乎立即停止，而 磷光寿命较长，往往能延续一段易测出来 的时间后停止。
第二节 分子荧光分析法
一、分子荧光和磷光的产生 1、电子自旋状态的多重性（multiplicity） 一个所有电子自旋都配对的分子的电 子态称为单重态（singlet state），用“S” 表示；激发态分子中电子自旋平行的电子态 称为三重态（triplet state），用“T”表 示。 电子自旋状态的多重性M=2S+1，其中S 是电子的总自旋量子数，它是分子中所有价 电子自旋量子数的矢量和。
（2）荧光光谱的特性 ①荧光光谱形状与激发波长无关 ②荧光光谱和吸收光谱有很好的镜像关系. 吸收光谱其形状决定于该分子S1态中各振动能级 能量间隔的分布情况（称该分子的第一吸收带）。 荧光光谱的形状决定于S0态中各振动能级的能量 间隔分布。由于分子的S0态和S1态中各振动能级的分 布情况相似，因此，荧光光谱和吸收光谱的形状相似。
（3）取代基效应 影响不明显的取代基有-NH3、-R、-SO3H等.-CN 取代的芳烃通常都有荧光. 取代基的位臵也有影响，对位、邻位取代增强荧 光，间位取代抑制荧光。 双取代和多取代基的影响较难预测，取代基之间 如果能形成氢键增加分子的平面性，则荧光增强.两 种性质和作用不同的取代基共存时，其中有一个起主 导作用。 不论何种类型的取代，随着共轭体的增大，其影响 相应减小。
二、分子荧光的性质
1、荧光激发光谱 图3.2荧光分析基本装臵示意图中，第一 单色器的作用是给荧光物质选择具有特定波长 的激发光。第二单色器的作用是滤除荧光液池 的反射光、瑞利散射光、拉曼光以及溶液中干 扰物质产生的荧光，只允许被测物质的特征性 荧光照射到检测器上进行光电信号转换，从而 消除杂光的干扰，提高测定的选择性。
1、荧光强度与浓度 当测定体系和测定条件确定之后，K′、 Фf 、I0以及摩尔吸光系数ε和液层厚度b均 为常数设K=K′ФfI0εb，则： If = K C (3.5) (3.4) 、(3.5)式就是进行荧光分析的定量 关系式。
1、荧光强度与浓度
I0 It I0 It
（a）A＜0.05
If
(b) A＞0.05
If
图3.4 溶液浓度对荧光强度测定的影响
一个发光体系中的发光分子数远远小于吸光分 子数，为什么荧光分析法的灵敏度比吸光光度法的 灵敏度还要高2～3个数量级呢？ 答：当荧光物质溶液的浓度C一定时，对吸光光度 法： 吸光度A=εbC= -lgI/I0, 增加I0，I也增加，I/I0基本不变化，A基本恒定。 而对荧光分析：If =K′Фf I0[1-(1-A)]= K′Фf I0A = K′Фf I0εbC 增加I0，虽然吸光度A=εbC基本恒定，但 相对荧光 强度If会大幅度增加。所以，荧光分析法的灵敏度 比吸光光度法的灵敏度还要高2～3个数量级。
3、分子荧光和磷光的产生及其类型 （1）分子荧光 处于S1或T1态的分子返回S0态时伴 随发光现象的过程称为辐射去激，分子从 S1态的最低振动能级跃迁至S0态各振动能级 时所产生的辐射光称为荧光，其几率大， 辐射过程快，一般在10-8秒左右完成，因而 称为快速荧光或瞬时荧光，简称荧光。
斯托克斯位移 分子发射荧光的波长总比激发光长， 能量比激发光小，这种现象称为斯托克斯 位移，用符号“S”表示，它是荧光物质最 大激发光波长与最大发射荧光波长之差， 但习惯上用波长的倒数即波数之差表示如 下： 1 1
第七章 分子发光分析法
1 2 3 4
概述
分子磷光和荧光的产生
分子磷光分析法 化学发光分析法 实验技术 分子发光分析法应用简介
5
6
第一节 概述
分子发光：某些物质的分子吸收各种能量跃 迁到较高的电子激发态后，在返回基态的 过程中，伴随有光辐射。 • 物质因吸收光能而激发发光的现象，称为 光致发光， • 吸收电能之后的发光现象叫做电致发光， • 若吸收化学反应能激发发光，称为化学发 光， • 而发生在生物体内有酶类物质参与的化学 发光反应则称为生物发光。
吸 光 系 数
（a）
（b）
（c）
荧光 吸光 吸光
荧 光 相 对 强 度
250
源自文库330
400
500
λ /nm
蒽分子乙醇溶液的吸收光谱（a、b）和荧光 光谱（c）
三、分子荧光的参数 1.荧光寿命τ 荧光寿命和荧光量子产率是荧光物质的 重要发光参数。荧光寿命是处于激发态的荧 光体返回基态之前停留在激发态的平均时间。
（3）取代基效应 取代基的种类和位臵对荧光体 的荧光光谱和强度有较强的影响。 给电子取代基加强荧光，如：-OH,-OR,-CN,NH2,-NHR,-NR2,-OCH3等。 得电子取代基通常使荧光减弱，使磷光加强。 例如：>C=O、-COOH、-NO2、-SH等。 另外，芳环上取代上F、Cl、Br、I之后，使 系间窜跃加强，其荧光强度随卤素原子量的增加而减 弱，磷光相应增强，这种效应称为重原子效应。
各状态能量高低为： S2>T2>S1 >T1>S0, T1是亚稳态,平均寿命在10-4～10秒； 且T1→S0形式的跃迁有可能导致磷光光谱的 产生。
2、无辐射跃迁 （1） 振动驰豫 产生振动驰豫的时间极为短暂， 约为10-12秒。 （2） 内转换 内转换发生的时间在10-11～10-13秒。 （3）系间窜跃 不同多重态之间的无辐射跃迁叫系 间窜跃。需要10-6秒的时间。易于在S1和T1间进 行，发生系间窜跃的根本原因在于各电子能级中 振动能级非常靠近，势能面发生重叠交叉，而交 叉地方的位能是一样的。当分子处于这一位臵时， 既可发生内部转换，也可发生系间窜跃，这决定 于分子的本性和所处的外部环境条件。
s 10 (
7
ex

em
)
式中，λex、λem分别为最大激发光和最 大发射荧光波长（nm）。 其物理意义:荧光未发射之前，在荧光 寿命期间能量的损失。斯托克斯位移越大， 激发光对荧光测定的干扰越小，当它们相 差大于20nm以上时，激发光的干扰很小， 可进行荧光测定。
（2）分子磷光 当受激分子降至S1的最低振动能级后， 如果经系间窜跃至T1态，并经T1态的最低振 动能级回到S0态的各振动能级，此过程辐射 的光称为磷光。 磷光的波长比荧光更长些，其寿命通 常在10-4～10秒间。图3.1为分子荧光和磷 光产生示意图。
2、荧光量子产率φf 荧光量子产率φf反 映了荧光物质发射荧光的能力，其值越大物质 的荧光越强。
Фf 接近零，该物质为非荧光物质， Фf 接近1，该物质为强荧光物质。所以，荧光物 质的Фf通常大于0小于1。
四、荧光强度的主要影响因素 1、荧光强度与浓度 荧光物质浓度很稀时，所发射的荧光相对强度 If可用（3.3）表示： If = KˊФf I0(1-e—A) 随着荧光体浓度增大，吸光度A增大，If也增 大.但A无限增大时，e—A趋于零.所以，浓度增大到 一定程度后若再增加，If不再增加. 荧光体浓度很稀，吸光度A<0.05时，e—A=1-A, 因 此： If=K′ФfI0[1-(1-A)]=K′ФfI0εbC (3.4)
（4）电子跃迁类型 含有氮、氧、硫杂原子的有机物如喹啉和芳酮 类物质都含未键合的非键电子n，电子跃迁多 为n -π*型，系间窜跃强烈，荧光很弱或不发 荧光，易与溶剂生成氢键或质子化从而强烈地 影响它们的发光特性。
3、荧光猝灭
荧光分子与溶剂或其它物质分子作用使荧光强度 减弱的现象称为荧光猝灭，能使荧光强度降低的物 质称为荧光猝灭剂。 荧光猝灭分为静态猝灭和动态猝灭，静态猝灭 的特征是基态荧光分子M和猝灭剂Q发生反应，生成 非荧光性物质MQ，使M失去荧光特性：