第二代测序技术检测试剂质量评价通用技术指导原则

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二代测序质控各参数标准

二代测序质控各参数标准一、引言二代测序（Next-GenerationSequencing，NGS）是一种高通量的基因组测序技术，广泛应用于生物医学研究、农业育种、疾病诊断等领域。

在二代测序过程中，质量控制（QualityControl，QC）是至关重要的一步，其中质控参数的设定和标准是关键。

本文将介绍二代测序质控各参数的标准。

二、样本质量评估1.完整性：样本应保持完整，无断裂或降解。

可通过测定样本的分子量、片段长度分布等指标进行评估。

2.浓度：样本浓度应在合理范围内，过高或过低的浓度都可能导致测序质量下降。

3.特异性：样本应具有特异性，不应包含其他杂质序列。

可通过序列特异性指数（Sequence-SpecificityIndex）进行评估。

三、测序数据质量评估1.序列深度：测序深度是指测得的有效序列数量。

理想情况下，测序深度应覆盖目标区域的每个碱基。

2.覆盖度：覆盖度是指测序序列对目标区域的整体覆盖程度。

理想情况下，应具有广泛的覆盖度，以保证准确性和可信度。

3.质量值分布：测序质量值应在合理范围内，过低或过高的质量值都可能导致错误率升高。

4.碱基错配率：碱基错配率是指非特异性碱基的比例。

应尽可能降低错配率，以保证结果的准确性。

四、质量控制标准1.严格控制样本质量和浓度，确保样本具有特异性。

2.确保测序深度和覆盖度达到预期要求，同时关注质量值和错配率。

3.对数据进行多维度分析，包括序列长度、GC含量、突变位点等，以确保结果的全面性和准确性。

4.根据实验需求和样本特性，制定合适的质控参数标准，并定期评估和调整。

5.建立完善的质控流程和标准，确保实验数据的可靠性和可信度。

五、结论二代测序质控各参数标准的设定和评估是质量控制的关键环节。

通过严格控制样本质量和浓度、确保测序深度和覆盖度、关注质量值和错配率、多维度分析数据等措施，可以提高二代测序的准确性和可信度。

同时，建立完善的质控流程和标准，定期评估和调整质控参数，可以确保实验数据的可靠性和可信度，为后续研究提供有力支持。

DNA第2代测序技术

• 新一代测序技术相对传统芯片测序技术的优势，最终还得依靠广告和市场营销手段的推广才能获得大众的认可。 • 近期出现的Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、 PacificBiosciences公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的纳米孔单分子技术，被认为是第三代测序技术。 • 与前两代技术相比，第三代测序技术最大的特点是单分子测序。
从1910年到现在，遗传学的发展大致可以分为三个时期：细胞遗传学时期、微生物遗传学时期和分子遗传学时期。细胞遗传学时期 • 大致是1910～1940年，这一时期通过对遗传学规律和染色体行为的研究确立了遗传的染色体学说。这一时期中虽然由美国遗传学家马勒和斯塔德勒分别在动植物中发现了 X射线的诱变作用，可是对于基因突变机制的研究并没有进展。基因作用机制研究的重要成果则几乎只限于动植物色素的遗传研究方面。
• 高通量测序另一个被广泛应用的领域是小分子RNA或非编码RNA(ncRNA)研究。测序方法能轻易的解决芯片技术在检测小分子时遇到的技术难题(短序列，高度同源)，而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量测序的长度，使得数据“不浪费”，同时测序方法还能在实验中发现新的小分子RNA。在衣藻、斑马鱼、果蝇、线虫、人和黑猩猩中都已经成功地找到了新的小分子RNA。在线虫中获得了40 万个序列，通过分析发现了18个新的小RNA分子和一类全新的小分子RNA。
• 1977年Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和 Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生。 • 尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的测序方法。经过不断的开发和测试，进入21世纪后，以Roche公司的 454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的 SOLiD技术为标志的第二代测序技术诞生了。

临床分子生物学检验技术模拟练习题(附答案)

临床分子生物学检验技术模拟练习题（附答案）一、单选题（共100题，每题1分，共100分）1、检测TB的实验室技术中，被认为是目前最先进的一种检测TB及其耐药性的方法是A、PCR技术B、荧光定量 PCR技术C、PCR-RFLP技术D、全自动结核杆菌检测技术E、DNA 测序技术正确答案：D2、属于微小缺失综合征的不包括A、Wilms瘤B、着色性干皮病C、Angelman 综合征D、Prader-Willi综合征E、WAGR综合征正确答案：B3、淋病奈瑟菌耐青霉素的分子机制与以下哪组基因有关A、katG和inhAB、gyrA和parCC、penA和ponAD、gyrA和gyrBE、rrs和rpsL正确答案：C4、下列不是影响DNA复性因素的是A、DNA浓度B、DNA的分子量C、温度D、碱基组成E、DNA 的来源正确答案：E5、硝酸纤维素和 PVDF膜结合蛋白主要靠A、疏水作用B、氢键作用C、离子键作用D、盐键作用E、酯键作用正确答案：A6、下列不能用于核酸转移作固相支持物的是A、NC膜B、尼龙膜C、化学活性膜D、滤纸E、PVC膜正确答案：E7、有关多重PCR的描述正确的是A、同一个模板，多种不同的引物B、相同的引物，多种不同的模板C、多个模板，多种引物D、引物的Tm值、反应时间和温度、反应缓冲液等尽量不一致以区分不同产物E、同一反应内各扩增产物片段的大小应尽可能相同或接近正确答案：A8、Western 印迹过程中若转移<20kD的蛋白质时应采用何种硝酸纤维素膜A、0.2μmB、0.3μmC、0.4μmD、0.5μmE、0.6μm正确答案：A9、双向电泳的样品制备目的不包括的是A、还原B、氧化C、变性D、去除蛋白质杂质E、溶解正确答案：B10、寡核苷酸探针的Tm简单计算公式为A、Tm=4(G+C)+2(A+T)B、Tm=2(G+C)+4(A+T)C、Tm=6(G+C)+4(A+T)D、Tm=2(G+C)+6(A+T)E、Tm=6(G+C)+2(A+T)正确答案：A11、骨髓移植后引起GVHD的主要效应细胞是A、T细胞B、B细胞C、基质细胞D、造血干细胞E、单核细胞正确答案：A12、阴性质控品失控的原因不包括A、扩增产物污染B、标本交叉污染C、放射性污染D、基因组DNA或质粒的污染E、试剂污染正确答案：C13、下列何种技术不可用于 PGDA、微卫星 DNA序列B、变性高效液相色谱分析法C、基因芯片D、基因测序E、Sourthern blot正确答案：E14、以等位基因特异的寡核苷酸探针杂交法诊断某常染色体隐性遗传病时，若能与突变探针及正常探针接合，则该样本为A、正常人B、杂合体患者C、携带者D、不能确定E、纯合体患者正确答案：C15、提高移植存活率的方法以下不可行的是A、HLA配型B、mH的鉴定C、ABO血型鉴定D、移植前输入补体和抗体E、移植前应用免疫抑制剂正确答案：D16、移植物抗宿主反应以下列何项为主要特征A、上皮癌的高发生率B、供者T淋巴细胞与受者同种异型抗原发生应答C、被移植的B淋巴细胞产生自身抗体D、常出现自然缓解E、被移植的T淋巴细胞产生自身抗体正确答案：B17、关于肺炎支原体的实验室检测，正确的是A、体外培养生长缓慢但阳性率很高B、免疫学方法检测的假阳性率较低C、体外培养在支原体感染的早期诊断上具有重要意义D、利用分子生物学方法可以进行流行病学调查和耐药基因分析E、PCR技术可检测到极微量的DNA，但特异性不高正确答案：D18、下列方法中不属于RNA诊断的是A、Northern blotB、RNA斑点杂交C、基因芯片D、mRNA差异显示PCR技术E、逆转录 PCR正确答案：C19、下列关于病毒基因组描述不正确的是A、基因组可以由DNA或RNA组成B、有重叠基因C、基因组大部分是用来编码蛋白质的D、有高度重复序列E、相关基因往往丛集形成一个功能单位正确答案：D20、纯DNA 的A₂₆₀/A₂₈₀比值为1.8,可使比值升高的是A、蛋白质B、酚C、氯仿D、RNAE、乙醇正确答案：D21、下列符合解脲脲原体基因组结构特征的是A、基因组大于肺炎支原体基因组B、UU为环状染色体C、终止密码子 UGA编码赖氨酸D、完全遵循遗传密码的通用性E、G+C含量丰富正确答案：B22、操纵子结构不存在于A、原核生物基因组中B、大肠杆菌基因组中C、真核生物基因组中D、病毒基因组中E、细菌基因组中正确答案：C23、下面关于线粒体的描述不正确的是A、是真核细胞重要的细胞器B、线粒体的主要功能是氧化产能C、是细胞的能量工厂D、半寿期是10天左右，其数量和体积保持不变E、线粒体中存在基因，线粒体基因突变会导致疾病的发生正确答案：D24、第一个被发现可以预测晚期转移性结直肠癌患者是否能从靶向治疗药物西妥昔单抗中获益的生物标志物是A、K-rasB、EGFR基因C、TTF-1D、CEAE、bcl-2基因正确答案：A25、目前国际唯一公认的线粒体糖尿病致病突变是A、C3254AB、T3271CC、A4833GD、A3243GE、T16189C正确答案：D26、可以用来检测具有生物活性的蛋白质的是A、native PAGEB、SDS-PAGEC、2-DED、IEFE、Western blotting正确答案：A27、人类染色体中，形态最小的是A、X染色体B、Y染色体C、22号染色体D、21号染色体E、1号染色体正确答案：D28、判断HBV复制及传染性的直接指标是检测A、HBV DNA多聚酶活力B、HBsAgC、HBV DNAD、HBeAgE、HBcAg正确答案：C29、经检查,某患者的核型为46,XY, del(6)p11-ter,说明其为何种患者A、染色体部分丢失B、染色体丢失C、嵌合体D、环状染色体E、染色体倒位正确答案：A30、著名的Ph1染色体发生的易位是A、t(9;22)(q11;q34)B、t(5;11)(q34;q22)C、t(9;22)(q34;q1l)D、t(9;21)(q33;q11)E、t(5;22)(q34;q11)正确答案：C31、线粒体基因组编码几种rRNAA、22种B、20种C、18种D、3种E、2种正确答案：E32、患者进行抗结核治疗2个月后检出结核杆菌的rpoB基因耐药突变，建议患者更换的药物是A、利福平B、左氧氟沙星C、吡嗪酰胺D、乙胺丁醇E、链霉素正确答案：A33、下列不是微流控芯片常用检测方法的是A、紫外吸收检测法B、化学发光检测法C、电泳检测法D、电化学检测法E、荧光检测法正确答案：C34、下列疾病中发病率与母亲年龄增大有关的是A、血友病 AB、着色性干皮病C、Patau 综合征D、猫叫综合征E、WAGR综合征正确答案：C35、Western 印迹过程中若转移>20kD的蛋白质时应采用何种硝酸纤维素膜A、0.25μmB、0.35μmC、0.45μmD、0.55μmE、0.65μm正确答案：C36、染色体结构畸变的基础是A、染色体核内复制B、染色体断裂及断裂后的异常重排C、姐妹染色单体交换D、染色体丢失E、染色体不分离正确答案：B37、任意引物 PCR的特点描述错误的是A、需预知靶基因的核苷酸序列B、通过随机引物与模板序列随机互补C、扩增后可直接得到靶基因的多态性指纹图谱D、可用于基因组DNA图谱构建E、可用于临床致病菌的流行病学检测、分型正确答案：A38、与异烟肼耐药无关的基因是A、katGB、ahpCC、embBD、inhAE、kasA正确答案：C39、生物传感器中的免疫传感器所使用的生物敏感材料是A、细胞B、酶C、核酸D、抗原和抗体E、微生物正确答案：D40、关于梅毒螺旋体的实验室检测，下列描述正确的是A、分子生物学方法是耐药基因分析和流行学研究的首选方法B、诊断梅毒的传统方法是体外培养C、分子生物学方法不能早期诊断梅毒感染D、血清学检查普遍用于梅毒的筛查、疗效观察和流行病学检查，对早期梅毒诊断敏感E、镜检法简便，特异性高，但不能用于皮肤黏膜损害的早期诊断正确答案：A41、可同时引起 MELAS 综合征、耳聋和糖尿病的mtDNA 突变是A、C3254AB、T3271CC、A4833GD、A3243GE、T16189C正确答案：D42、关于 Sanger双脱氧链终止法叙述错误的是A、每个 DNA模板需进行一个独立的测序反应B、需引入双脱氧核苷三磷酸(ddTNP)作为链终止物C、链终止物缺少3'-OH，使链终止D、测序反应结果是产生4组不同长度的核苷酸链E、高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离仅差一个核苷酸的单链DNA 正确答案：A43、关于 PCR-RFLP错误的是A、采用特定的限制性内切酶对 PCR产物进行处理B、对酶切后的片段长度进行分析C、判断有无点突变D、突变位点不必在限制酶识别序列中E、需先进行 PCR扩增正确答案：D44、基因诊断间接方法不包括A、基于SNP的单倍型分析B、Southern blotC、基于STR的微卫星分析D、PCR-RFLPE、RFLP连锁分析正确答案：B45、用于蛋白质检测的标本长期保存于A、8℃B、-20℃C、4℃D、-70℃E、室温正确答案：D46、下面对mtDNA中D环区(D-loop)的描述正确的是A、是结构基因，编码13个蛋白多肽B、编码22个 tRNAC、编码2种rRNA,即12S rRNA 和16S rRNAD、参与调控线粒体的复制和转录E、可折叠成茎环结构正确答案：D47、作为芯片固相载体的材料描述正确是A、主要有玻片、硅片等实性材料B、不使用硝酸纤维素膜、尼龙膜及聚丙烯膜等膜性材料C、这些载体材料不需要处理，其表面存在活性基团(如羟基或者氨基)D、可以直接固定已经合成的寡核苷酸探针E、不需要对介质表面进行化学预处理——活化正确答案：A48、点突变引起的血友病A的分子诊断方法不包括A、PCR-SSCPB、PCR-RFLPC、PCR-VNTRD、PCR-STRE、长距离 PCR正确答案：E49、单基因遗传病分子诊断的主要应用是A、症状前诊断B、耐药基因检测C、携带者诊断D、携带者筛查E、产前诊断正确答案：E50、关于mtDNA非编码序列，描述正确的是A、不参与mtDNA 的复制、转录等，属“无用”信息B、是高度重复序列C、占整个mtDNA 的15%,比例较大D、mtDNA 中有两段非编码区E、位于 mtDNA的轻链正确答案：D51、到目前为止已确定的36个NAT2 基因变异种最常见的等位基因是A、NAT2*3B、NAT2*4C、NAT2*5D、NAT2*6E、NAT2*7正确答案：B52、在器官移植中HLA 配型最重要的位点是A、HLA-DRB、HLA-AC、HLA-BD、HLA-DPE、HLA-C正确答案：A53、属于染色体结构异常的染色体病为A、Klinefelter 综合征B、Patau 综合征C、Edward综合征D、猫叫综合征E、Down综合征正确答案：D54、猫叫综合征患者的核型为A、46, XY,r(5)(p14)B、46,XY, ins(5)(p14)C、46,XY, del(5)(p14)D、46,XY,t(5;8)(p14;p15)E、46, XY, dup(5)(p14)正确答案：C55、生殖健康的内容主要包括A、计划生育咨询、信息、教育、交流及服务，人工流产的预防和流产后果管理B、产前保健、安全分娩及产后保健的教育与服务，特别是母乳喂养和母婴保健C、不孕症的预防和适当治疗生殖道感染、性传播疾病及其他生殖健康问题治疗D、关于性行为、生殖健康及父母责任的信息、教育和咨询E、以上都是正确答案：E56、核酸序列的基本分析不包括A、测序分析B、限制性酶切分析C、序列变换分析D、统计分析E、分子量、碱基组成、碱基分布正确答案：D57、下列说法正确的是A、液状石蜡切片中缩短蛋白酶K的消化时间可增加提取DNA片段的长度B、组织样本不需蛋白酶K消化即可进行核酸提取C、用于提取核酸的石蜡切片需要先用二甲苯脱蜡D、用于提取核酸的石蜡切片不需脱蜡即可进行核酸提取E、新鲜的组织样本需要先用二甲苯脱蜡才能进行核酸提取正确答案：C58、PCR反应体系不包括A、耐热的 Taq DNA 聚合酶B、cDNA 探针C、4种dNTPD、合适的缓冲液体系E、模板DNA正确答案：B59、点/狭缝杂交可以用于A、快速确定是否存在目的基因B、不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息C、用于基因定位分析D、阳性菌落的筛选E、蛋白水平的检测正确答案：A60、HCV 基因分型的“金标准”是A、基因分型检测芯片B、测序分析法C、实时荧光 PCRD、基因型特异性引物扩增法E、RFLP正确答案：B61、人类基因组的组织特点描述不正确的是A、基因组中各个基因的大小和内部组织的差异不大B、基因组含重复序列C、大部分为非编码序列D、功能相关的基因常散在分布于不同的染色体上E、每个结构基因都有单独的调控序列正确答案：A62、荧光定量 PCR检测核酸量的时间段在A、非指数期B、PCR反应的最初阶段C、PCR反应最后的时间段D、指数期的起始阶段E、指数期的终末阶段正确答案：D63、通常标记第二抗体的酶是A、ALTB、ASTC、ACPD、ACATE、AKP正确答案：E64、ICAT碘代乙酰亚胺结构与哪一种氨基酸发生耦联A、半胱氨酸B、胱氨酸C、酪氨酸D、精氨酸E、碱性氨基酸正确答案：A65、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理不正确的是A、SDS是一种阴离子去污剂B、SDS可以与蛋白质的疏水部分相结合，从而使蛋白质获得负电荷C、SDS-PAGE时蛋白质的迁移率与分子大小相关D、SDS-PAGE使具有不同等电点的蛋白质得以分离E、SDS与蛋白质结合后可以屏蔽天然蛋白质的电荷正确答案：D66、Sanger双脱氧链终止法使用的链终止物是A、dNTPB、NTPC、ddNTP正确答案：C67、核酸分子杂交的基础是A、抗原抗体结合B、甲基化C、碱基互补配对D、配体受体结合E、磷酸化正确答案：C68、核型为47，XXY 的细胞中可见到几个X染色质A、0B、3C、2D、1E、2或3正确答案：D69、线粒体基因组22个tRNA 可转录几种 tRNAA、22种B、20种C、18种D、13种E、2种正确答案：B70、下列说法错误的是A、用于RNA检测的样本短期可保存在-20℃B、用于 PCR检测的样本可用肝素作为抗凝剂C、如使用血清标本进行检测应尽快分离血清D、外周血单个核细胞可从抗凝全血制备E、用于核酸提取的痰液标本应加入 1mol/L NaOH初步处理正确答案：B71、人类基因组的碱基数目为A、2.9×10⁶bpB、3.0×10⁹bpC、4.0×10⁹bpD、4.0×10⁶bpE、4.0×10⁸bp正确答案：B72、基因芯片技术的优点不包括A、操作简便B、缩微化C、观察结果直观D、芯片检测稳定性高E、高通量正确答案：D73、一些致死性呼吸障碍、乳酸酸中毒、肝肾衰竭病例mtDNA 突变形式是A、点突变B、插入C、缺失D、拷贝数变异E、动态突变正确答案：D74、关于AR说法不正确的是A、AR基因位于Xq11.2-q12,编码雄激素受体B、AR基因的内含子含有可变数目的CAG串联重复序列C、CAG序列具有多态性D、美国黑人易患前列腺癌的主要遗传基础就是AR基因的串联重复序列较短E、阻断 AR可以延缓前列腺癌的进展正确答案：B75、发出临床检验报告前应进行结果审核，审核内容不包括A、室间质量评价是否合格B、临床医生申请的检验项目是否已全部检验C、室内质控是否在控D、检验报告是否正确E、检验结果与临床诊断是否相符正确答案：A76、HBV DNA 中最小的一个开放阅读框是A、P基因区B、S基因区C、X基因区D、前S基因区E、C基因区正确答案：C77、目前测序读长最大的测序反应是A、双脱氧终止法B、边合成边测序C、焦磷酸测序D、化学裂解法E、寡连测序正确答案：A78、第二代测序技术一般不用到A、双脱氧链终止法B、文库接头C、高通量的并行PCRD、高通量的并行测序反应E、高性能计算机对测序数据进行拼接和分析正确答案：A79、常见的进行乳液 PCR(emulsion PCR)的场所是A、芯片表面B、磁珠表面C、PTP板孔D、尼龙膜上E、毛细管内正确答案：B80、关于 Leber遗传性视神经病的描述不正确的是A、mtDNA 突变是Leber遗传性视神经病的分子基础B、属母系遗传病C、病变会累及视网膜、巩膜等，最终导致视神经变性D、目前已发现与本病相关30多个mtDNA 突变位点E、mtDNA 突变分原发突变和继发突变，只有原发突变会导致本病的发生正确答案：E81、若某人既有睾丸又有卵巢，内外生殖器间性，第二性征发育异常，则此人患有以下哪种疾病A、性逆转综合征B、真两性畸形.C、男性假两性畸形D、女性假两性畸形E、性腺发育不全正确答案：D82、关于电转膜的描述不正确的是A、半干转特别适合大分子蛋白质的转移B、转膜的顺序是膜在负极一侧，凝胶靠近正极一侧C、缓冲液 pH过低会导致部分蛋白质凝集沉淀D、转膜缓冲液中含有甲醇成分E、转膜时间不宜过长正确答案：A83、基因芯片技术的临床应用不包括A、由于蛋白质翻译后修饰改变而引起的疾病的诊断B、疾病的诊断C、基因突变的检测D、指导个体用药E、药物的筛选正确答案：A84、可作为分子遗传标记的是A、HLAB、单拷贝序列C、高表达蛋白D、RFLPE、染色体正确答案：D85、关于单基因遗传病的叙述，正确的是A、原发性高血压是单基因遗传病B、发病机制都已阐明C、受多对等位基因控制D、可进行定性诊断和定量诊断E、在群体中发病率高正确答案：D86、最常用的DNA 探针标记方法是A、随机引物标记B、切口平移标记C、3'-末端标记D、5'-末端标记E、PCR法正确答案：A87、离子交换层析有效分离蛋白质的依据是A、蛋白的pIB、蛋白的分子大小C、配体的特异性亲和力D、蛋白的溶解度E、蛋白所带电荷正确答案：E88、探针基因芯片技术的本质就是A、基因重组技术B、酶切技术C、聚合酶链反应技术D、核酸分子杂交技术E、蛋白质分子杂交技术正确答案：D89、常见的常染色体病为A、Turner综合征B、Down综合征C、WAGR综合征D、猫叫综合征E、Klinefelter综合征正确答案：B90、G-6-PD缺乏时导致机体下列哪些物质增多(↑)或减少(↓)A、H₂O₂、GSH和NADPH↑B、H₂O₂和GSH↑,NADPH↓C、H₂O₂↑,GSH和NADPH↓D、GSH和NADPH↑,H₂O₂↓E、H₂O₂和NADPH↑,GSH↓正确答案：C91、基因芯片技术的主要步骤不包括A、杂交反应B、芯片的设计与制备C、信号检测D、酶切分析E、样品制备正确答案：D92、PCR-SSCP 描述中错误的是A、检测核酸点突变的技术B、需制备成单链DNAC、根据空间构象由DNA 的碱基组成决定的原理D、不需电泳E、敏感性与待分离DNA 的长度有关正确答案：D93、单基因遗传病诊断最重要的前提是A、了解患者的家族史B、疾病表型与基因关系已阐明C、了解相关基因的基因克隆和功能分析等知识D、了解相关基因的染色体定位E、进行个体的基因分型正确答案：A94、下列叙述错误的是A、原核生物基因组具有操纵子结构B、原核生物结构基因是断裂基因C、原核生物基因组中含有插入序列D、原核生物基因组中含有重复顺序E、原核生物结构基因的转录产物为多顺反子型mRNA 正确答案：B95、羊膜穿刺的最佳时间在孕期多少周时A、4B、30C、10D、2E、16正确答案：E96、下列方法中能同时检测几种疟原虫混合感染的是A、竞争PCRB、巢式PCRC、多重PCRD、普通PCRE、PCR-RFLP正确答案：C97、关于 Western 印迹以下说法正确的是A、固相膜保存时间短B、需要对靶蛋白进行放射性核素标记C、是由凝胶电泳和固相免疫组成的D、缺点是不能对转移到固相膜上的蛋白质进行连续分析E、检测的灵敏性为0.1~1ng正确答案：C98、下列哪种质粒带有抗性基因A、F质粒B、Col质粒C、接合型质粒D、Vi质粒E、R质粒正确答案：E99、pncA基因突变与下列哪种酶活性改变相关A、糖基转移酶B、DNA 旋转酶C、泵蛋白D、吡嗪酰胺酶E、DNA 依赖RNA 聚合酶正确答案：D100、下列哪一种病毒的遗传物质为RNAA、乙肝病毒B、乳头瘤状病毒C、疱疹病毒D、人类免疫缺陷病毒E、腺病毒正确答案：D。

2020版：中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识(完整版)

2020版：中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识（完整版）病原学诊断始终是感染性疾病诊断中最重要的环节。

传统的病原学诊断是临床医师根据患者的临床表现做出一系列鉴别诊断，然后针对这些进行检测，通常一项检测只能对应一种病原体，而宏基因组学第二代测序(metagenomics next generation sequencing,以下简称二代测序)技术检测能覆盖更广范围的病原体。

本专家共识就二代测序的临床应用范围、样本采集、分析解读和诊断效能等方面进行证据总结和意见推荐。

一、证据强度和证据质量的分级定义证据强度：A为强烈推荐；B为推荐，但其他替代方案也可接受；C为推荐强度低，寻求替代方案；D为从不推荐。

证据质量：Ⅰ为证据来自随机对照试验，Ⅱ为证据来自非随机对照试验，Ⅲ为证据仅来自专家意见。

二、二代测序的临床需求与应用范围(一)背景及概述推荐意见1：若怀疑细菌、真菌、DNA病毒、寄生虫、不典型病原体感染且需进行二代测序检测时，建议采用DNA检测；若怀疑RNA病毒感染时，则建议采用RNA检测(A，Ⅱ)。

推荐意见2：对于临床疑似感染的病重、病危或免疫抑制、免疫缺陷患者，建议在完善传统实验室及分子生物学检测的同时，采集疑似感染部位的标本进行二代测序(B，Ⅱ)。

二代测序检测能覆盖较大范围的病原体，病毒、细菌、真菌、寄生虫都能被同时检测，不论临床样本培养成功与否，只要含有可检测到的DNA 或RNA即可[1,2,3,4,5,6]。

从接收样本至完成数据分析，二代测序的周转时间根据测序技术、方法和生物信息学分析方法的不同而不同，已有报道为6 h至7 d不等(平均48 h)[7,8]。

二代测序在感染性疾病诊断领域中的优势在于其能检测到其他传统手段无法检测到的病原体。

因此，二代测序可能在应用于临床疑难杂症或免疫抑制患者时有更大意义。

另外，二代测序也被报道可用于"排除"检测，即检测阴性有助于排除感染性疾病的诊断，但前提条件是测序覆盖度足够高，能确保样本中存在的病原微生物被检测出来[1]。

二代测序简介

Image Acquisition and Processing
Fluorescence Chemiluminescence
a
Sequential Sequenc e Extensio n Reaction
Polymerase
Ligase 12
2nd Generation Performance
1995 - ABI’s first automated DNA sequencer
2006 - 2nd generation DNA sequencer on market
2007 and beyond – Singleamolecule sequencing
4
Sanger’s
M eLatbheloeddprimer (1)
POLONATOR 连接酶 20G 17 × ~30×2 7天 1周 99% ~40% off
a
13
Roche/454 Life Sciences’ Genome Sequencer
a
14
Roche/454 Workflow
DNA Library Prep
DNA Fragment
End repaired
Enzyme beads
Sulfurylase Luciferase
Packing beads help toa
Pyrosequencing
4 nucleotides sequentially flow in
Incorporation of a nucleotide releases a pyrophosphate (PPi)
GS 454
技术原理聚合酶/焦磷酸酶
单运数据产量 0.4～0.6Gb

第二代测序技术检测试剂质量评价通用技术指导原则

第二代测序技术检测试剂质量评价通用技术指导原则一、前言本指导原则主要针对第二代测序（n ext gen eration seque ncing NGS）技术检测试剂（以下简称“ NGS检测试剂”产品质量提出指导性要求，涉及基本原则、主要原材料、检测流程及性能评价等方面。

本指导原则是对企业和检验人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。

应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，其相关内容也将进行适时的调整。

二、适用范围本指导原则适用于基于NGS 技术的检测试剂的质量评价。

NGS 检测试剂的预期用途包括但不限于以下内容：肿瘤相关基因异常、遗传疾病相关基因异常、胚胎植入前染色体非整倍体、胎儿染色体非整倍体及病原微生物等临床检测应用。

此类检测试剂涉及的NGS 技术包括靶向性测序和非靶向性测序：靶向性测序法是指对样本中的基因组进行部分测序，如靶基因测序、外显子（组）测序等；非靶向性测序是指对样本中潜在生物体的基因组进行测序。

原则上不建议企业应用全基因组测序进行检测，如果企业应用全基因组测序技术，应进行充分的技术适用性验证并提交报告。

待测样本可以是人源样本（如体液、组织、排泄物等）或病原微生物分离培养物（如血培养物、痰培养物等），检测对象可以是脱氧核糖核酸（DNA ）、核糖核酸（RNA ）或两者的混合物。

本指导原则尽可能覆盖所有的NGS 技术原理和测序平台，所讨论和描述的内容不限于某个特定的NGS检测试剂。

但鉴于NGS技术一直在不断升级和更新，可能会有本指导原则未能涉及的新技术。

三、基本要求（一）基本原则1.NGS 检测试剂的生产企业应获得《医疗器械生产许可证》。

研制、生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。

二代测序原理及应用

二代测序原理及应用二代测序技术是指第二代测序技术，也称为高通量测序技术。

它是指通过并行测序技术，能够在较短的时间内完成大规模DNA或RNA的测序。

二代测序技术具有高通量、高效率、低成本等特点，因此在基因组学、转录组学、表观基因组学等领域有着广泛的应用。

本文将对二代测序的原理及其应用进行介绍。

首先，我们来了解一下二代测序的原理。

二代测序技术主要包括Illumina、Ion Torrent、454等多种技术平台。

这些技术平台都是基于不同的原理进行测序的。

以Illumina为例，其原理是将DNA样品切割成短片段，然后通过桥式PCR扩增得到cluster，再通过测序芯片上的碱基逐一加入，通过荧光信号检测得到序列信息。

而Ion Torrent则是通过检测DNA合成过程中释放的氢离子来进行测序。

454则是通过测定DNA合成过程中释放的焦磷酸来进行测序。

这些原理都是基于不同的信号检测方式，但都能够实现高通量测序。

其次，我们来看一下二代测序技术的应用。

在基因组学研究中，二代测序技术可以用于揭示物种的基因组结构、功能基因的鉴定、基因组变异的分析等。

在转录组学研究中，可以通过RNA测序技术对转录本进行定量和定性分析，揭示基因的表达模式、剪接变异等信息。

在表观基因组学研究中，可以通过甲基化测序技术对DNA甲基化进行分析，揭示基因组的表观遗传信息。

此外，二代测序技术还可以用于微生物组学研究、癌症基因组学研究、个体化医疗等领域。

总之，二代测序技术作为一种高通量测序技术，具有高效、快速、低成本等优点，已经在基因组学、转录组学、表观基因组学等领域得到了广泛的应用。

随着技术的不断进步，相信二代测序技术在生命科学领域的应用将会更加广泛，为我们揭示更多生命科学的奥秘。

高通量测序：第二代测序技术详细介绍

在过去几年里，新一代DNA 测序技术平台在那些大型测序实验室中迅猛发展，各种新技术犹如雨后春笋般涌现。

之所以将它们称之为新一代测序技术（next-generation sequencing），是相对于传统Sanger 测序而言的。

Sanger 测序法一直以来因可靠、准确，可以产生长的读长而被广泛应用，但是它的致命缺陷是相当慢。

十三年，一个人类基因组，这显然不是理想的速度，我们需要更高通量的测序平台。

此时，新一代测序技术应运而生，它们利用大量并行处理的能力读取多个短DNA 片段，然后拼接成一幅完整的图画。

Sanger 测序大家都比较了解，是先将基因组DNA 片断化，然后克隆到质粒载体上，再转化大肠杆菌。

对于每个测序反应，挑出单克隆，并纯化质粒DNA。

每个循环测序反应产生以ddNTP 终止的，荧光标记的产物梯度，在测序仪的96 或384 毛细管中进行高分辨率的电泳分离。

当不同分子量的荧光标记片断通过检测器时，四通道发射光谱就构成了测序轨迹。

在新一代测序技术中，片断化的基因组DNA 两侧连上接头，随后运用不同的步骤来产生几百万个空间固定的PCR 克隆阵列（polony）。

每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。

之后进行引物杂交和酶延伸反应。

由于所有的克隆都是系在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行。

同样地，每个延伸所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行，来获取测序数据。

酶拷问和成像的持续反复构成了相邻的测序阅读片段。

Solexa 高通量测序原理--采用大规模并行合成测序法(SBS, Sequencing-By-Synthesis)和可逆性末端终结技术（Reversible Terminator Chemistry）--可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。

--具有高精确度、高通量、高灵敏度和低成本等突出优势--可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究----将接头连接到片段上，经PCR 扩增后制成Library 。

第二代测序技术流程

第二代测序技术流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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测序技术的发展历程

Illumina 2017年推出的NovaSeq系列运行速度大于现有仪器的70%，仅需1小时即可完成全基因组测序，被认为是Illumina迄今为止推出的最强大的测序仪，预示着100美元基因组时代的到来。
6. Complete Genomics测序系统
美国Complete Genomics（CG）公司成立于2005年，是全球首家提供人类基因组测序服务的生命科学公司。 CG公司独有DNA纳米球（DNA nanoball，DNB）芯片及组合探针锚定连接（combinatorial probe anchor ligetion， cPAL）这两种测序相关技术。cPAL测序的建库称为DNB，利用RCA（Rolling circle replication）让DNA扩增成线性的螺旋结构。RCA扩增：是以一小段环状寡核苷酸为模板，以dNTPs为原料，在DNA/RNA聚合酶作用下扩增产生一条长重复单链DNA/RNA。
模测序。 2.测定碱基序列需要大量完全相同的DNA拷贝。
3. 二代测序先驱-Genome Sequencer 20系统
2005年 454 Life Sciences公司基于将焦磷酸测序技术与乳液pcr及光纤芯片技术相结合，推出了Genome Sequencer 20高通量测序系统，发展大规模平行焦磷酸测序技术，实现了测序过程的高通量。
Sanger测序法的优缺点：优点： 1.sanger是直接对DNA最大优点在于读取速度很高、高精确度，而且成本相对很低。相较于化学降解测序法，对于富含G-
C的区域也不会影响测序效果。缺点： 1.必须有已经序列设计测序引物，对于未知序列必须构建克隆后才能测序，难以实现基因组水平的大规
DNA模板中的碱基序列合成新的DNA链，同时将标记物结合到新合成的DNA链中。 5. 将反应产物进行电泳分离，根据标记物的不同荧光信号或放射性同位素的存在，确定DNA序列中的碱基排列顺序。

高通量测序法

附件1肿瘤相关突变基因检测试剂（高通量测序法）性能评价通用技术审查指导原则一、前言本指导原则旨在指导注册申请人对肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。

本指导原则是针对肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。

本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要详细阐明理由，并对其科学合理性进行验证，提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。

二、适用范围本指导原则所述肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价主要是指基于高通量测序（high-throughput sequencing）即下一代测序（next generation sequencing, NGS），又称为大规模平行测序（massively parallel sequencing, MPS），体外检测人体组织中肿瘤细胞中肿瘤相关基因变异。

用于检测体细胞突变的NGS正在广泛用于肿瘤诊疗相关的分子检测，包括对特定基因的DNA/RNA进行测序，以寻找与肿瘤临床诊疗相关的突变基因的改变。

肿瘤基因突变类型包括点突变、插入、缺失、基因重排、拷贝数异常等广义的基因突变。

基于NGS测序原理的IVD检测可能包括以下步骤：样本收集，处理和保存、DNA提取、DNA处理、文库制备、测序和碱基识别、序列比对/映射、变异识别和过滤、变异注释和解读以及检测报告的生成。

同时，某些产品还可能会包括软件部分，但上述相关步骤并不一定被全部包括，应根据产品的具体设计流程来进行判断。

临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识

临床分⼦病理实验室⼆代基因测序检测专家共识临床分⼦病理实验室⼆代基因测序检测专家共识临床分⼦病理实验室⼆代基因测序检测专家共识近年⼆代基因测序（next-generation sequencing，NGS）技术快速发展，其应⽤已进展⾄临床检测，如遗传疾病、实体肿瘤、⾎液肿瘤、感染性疾病、⼈类⽩细胞抗原分析及⾮侵袭性产前筛查等。

国内外有关学会已出台相关共识与指南以推动其在临床中的应⽤。

中华医学会病理学分会和中国抗癌协会肿瘤病理专委会前期组织病理、临床、⽣物信息等专家进⾏了充分讨论，拟在NGS的操作流程、数据处理、结果解读等⽅⾯作规范和建议，以规范NGS在分⼦病理领域的应⽤。

临床分⼦病理实验室NGS样本可采⽤甲醛固定⽯蜡包埋组织（formalin-fixedparaffin-embedded，FFPE）、新鲜组织、各种体液上清液、体液离⼼细胞块、⽯蜡包埋标本和⾎浆/⾎液标本等。

本共识特⾊是基于病理评估的组织样本（FFPE、新鲜）的规范。

测序分析范围基于⽬前临床需求，本共识着重在于⽬标区域测序（panel）分析的实践。

随着技术的更新和应⽤的成熟，本共识将持续更新以满⾜临床需求。

⼀、实验室总体要求NGS检测实验室的总体设计与要求应参考《分⼦病理诊断实验室建设指南（试⾏）》、《医疗机构临床基因扩增检验实验室⼯作导则》、《个体化医学检测质量保证指南》、《肿瘤个体化治疗检测技术指南》、《个体化医学检测实验室管理办法》、《测序技术的个体化医学检测应⽤技术指南（试⾏）》进⾏。

1.NGS检测⼈员的资质要求：NGS检测技术⼈员应具备临床病理学、分⼦⽣物学的相关专业⼤专以上学历，并经过NGS 技术的理论与技能培训合格。

数据分析⼈员应具有临床医学或分⼦⽣物学或遗传学知识背景并经⽣物信息学培训。

最终报告应由中级或硕⼠以上具有病理学背景、经培训合格的本单位执业医师或者授权签字⼈（医学博⼠学位或⾼级职称）审核。

2.NGS检测实验室的区域设置要求：原则上NGS实验室应当有以下分区：样本前处理区、试剂储存和准备区、样本制备区、⽂库制备区、杂交捕获区/多重PCR区域（第⼀扩增区）、⽂库扩增区（第⼆扩增区）、⽂库检测与质控区、测序区、数据存贮区。

第二代测序技术

第二代测序技术1.概述DNA测序（DNA sequencing）作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。

早在DNA双螺旋结构（Watson and Crick,1953)被发现后不久就有人报道过DNA测序技术，但是当时的操作流程复杂，没能形成规模。

随后在1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法，同年A.M.Maxam和W.Gilbert发明了化学降解法。

Sanger法因为既简便又快速，并经过后续的不断改良，成为了迄今为止DNA测序的主流。

然而随着科学的发展，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术（Next-generation sequencing)应运而生。

第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。

这三个技术平台各有优点，454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长（read）能达到400bp；Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的1/10；SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前第二代测序技术中准确度最高的。

虽然第二代测序技术的工作一般都由专业的商业公司来完成，但是了解测序原理、操作流程等会对后续的数据分析有很重要的作用，下文将以Illumina/Solexa Genome Analyzer 测序为例，简述第二代测序技术的基本原理、操作流程等方面。

测序试剂质量标准

测序试剂质量标准一、试剂纯度测序试剂的纯度应不低于95%，其中不应含有杂质或污染物。

试剂的纯度将直接影响测序实验的准确性、可靠性和稳定性。

因此，在选择和使用测序试剂时，必须注意检查其纯度。

二、试剂活性测序试剂的活性是保证测序实验成功的重要因素。

活性不稳定的试剂会影响反应速率和产物稳定性。

因此，在选择和使用测序试剂时，应确保其活性稳定，并按照说明书正确保存和使用。

三、试剂稳定性测序试剂的稳定性对其在测序实验中的表现有很大影响。

不稳定的试剂会影响实验结果的可靠性和重复性。

因此，在选择和使用测序试剂时，应关注其稳定性，并按照说明书正确保存和使用。

四、交叉污染测序试剂的交叉污染会导致实验结果不准确或出现误差。

为了避免交叉污染，需要采取一系列措施，如使用一次性手套、器具，避免直接接触试剂等。

此外，应按照说明书正确配制和使用试剂，避免因操作不当导致交叉污染。

五、重复性测序试剂的重复性是指在不同实验条件下，使用相同试剂得到相同或类似结果的概率。

重复性好的试剂可以提高实验的可信度和可靠性。

因此，在选择和使用测序试剂时，应关注其重复性表现。

六、检测范围测序试剂的检测范围是指其能够检测的样本类型和浓度范围。

不同试剂的检测范围可能有所不同，因此在选择和使用测序试剂时，需要根据实际需求选择合适的试剂，并按照说明书正确使用。

七、特异性测序试剂的特异性是指其对目标序列的识别能力。

具有高特异性的试剂可以更准确地检测目标序列，减少误判和干扰。

因此，在选择和使用测序试剂时，需要关注其特异性表现。

八、试剂残留测序试剂的残留可能会对后续实验产生影响，特别是当实验需要重复使用同一批试剂时。

为了减少试剂残留的影响，需要采取一系列措施，如使用一次性器具、按照说明书正确配制和使用试剂等。

此外，还需要对使用过的试剂进行正确的废弃处理。

九、生物安全性测序试剂的生物安全性是指其对环境和实验者的潜在风险。

不安全的试剂可能会对环境和实验者的健康造成威胁。

高通量测序：第二代测序技术详细介绍

在过去几年里,新一代ＤNA测序技术平台在那些大型测序实验室中迅猛发展,各种新技术犹如雨后春笋般涌现。

之所以将它们称之为新一代测序技术(nｅｘt-generatiｏｎsequｅncing), 就就是相对于传统Ｓan ｇeｒ测序而言得。

Sａnger 测序法一直以来因可靠、准确,可以产生长得读长而被广泛应用,但就就是它得致命缺陷就就是相当慢。

十三年,一个人类基因组,这显然不就就是理想得速度,我们需要更高通量得测序平台。

此时,新一代测序技术应运而生,它们利用大量并行处理得能力读取多个短DNA 片段,然后拼接成一幅完整得图画。

Ｓanｇeｒ测序大家都比较了解,就就是先将基因组DNA 片断化，然后克隆到质粒载体上，再转化大肠杆菌。

对于每个测序反应,挑出单克隆,并纯化质粒ＤＮＡ。

每个循环测序反应产生以ddNTP终止得,荧光标记得产物梯度,在测序仪得9６或３８４毛细管中进行高分辨率得电泳分离。

当不同分子量得荧光标记片断通过检测器时，四通道发射光谱就构成了测序轨迹。

在新一代测序技术中,片断化得基因组DＮA 两侧连上接头,随后运用不同得步骤来产生几百万个空间固定得PCR 克隆阵列(ｐolony)。

每个克隆由单个文库片段得多个拷贝组成。

之后进行引物杂交与酶延伸反应。

由于所有得克隆都就就是系在同一平面上,这些反应就能够大规模平行进行。

同样地,每个延伸所掺入得荧光标记得成像检测也能同时进行,来获取测序数据。

酶拷问与成像得持续反复构成了相邻得测序阅读片段。

Ｓｏｌｅxａ高通量测序原理-－采用大规模并行合成测序法（ＳＢS，Sequｅnｃing-Ｂy-Synthesｉs)与可逆性末端终结技术(Reversible ＴermiｎａtｏｒＣhemistrｙ)－－可减少因二级结构造成得一段区域得缺失。

-－具有高精确度、高通量、高灵敏度与低成本等突出优势－－可以同时完成传统基因组学研究(测序与注释)以及功能基因组学(基因表达及调控,基因功能,蛋白/核酸相互作用)研究-－--将接头连接到片段上,经PCＲ扩增后制成Libｒarｙ。

二代测序法

二代测序法二代测序法是一种高通量测序技术，也被称为下一代测序技术。

它是一种快速、准确、高效的DNA测序技术，可以在短时间内对大量的DNA序列进行测序。

二代测序法的出现，极大地推动了基因组学、转录组学、表观遗传学等领域的研究进展。

二代测序法的原理是将DNA分子随机断裂成短片段，然后将这些短片段连接到适当的测序适配器上，再通过PCR扩增，最后将扩增产物进行高通量测序。

二代测序法的主要特点是高通量、高速度、低成本和高精度。

二代测序法的高通量是指可以同时测序大量的DNA分子，这使得二代测序法可以在短时间内完成大规模的测序任务。

例如，Illumina公司的HiSeq X Ten系统可以在10天内完成10万个人类基因组的测序，而这在以前的Sanger测序技术中需要数年时间才能完成。

二代测序法的高速度是指可以在短时间内完成大量的测序任务。

例如，Illumina公司的MiSeq系统可以在24小时内完成16个人类基因组的测序，而这在以前的Sanger测序技术中需要数月时间才能完成。

二代测序法的低成本是指相对于以前的测序技术，二代测序法的成本大大降低。

例如，Illumina公司的HiSeq X Ten系统可以在1000美元左右完成一个人类基因组的测序，而这在以前的Sanger 测序技术中需要数百万美元才能完成。

二代测序法的高精度是指可以在短时间内完成高质量的测序任务。

例如，Illumina公司的HiSeq X Ten系统可以在99.9%的准确率下完成一个人类基因组的测序，而这在以前的Sanger测序技术中只能达到98%的准确率。

二代测序法的应用非常广泛，包括基因组学、转录组学、表观遗传学、病毒学、微生物学、生态学等领域。

例如，在基因组学领域，二代测序法可以用于人类基因组、动植物基因组、微生物基因组等的测序；在转录组学领域，二代测序法可以用于RNA测序、miRNA测序、全基因组表达谱测序等；在表观遗传学领域，二代测序法可以用于DNA甲基化测序、组蛋白修饰测序等。

CLIA_CAP 二代测序临床检测标准操作指南

CLIA/CAP 二代测序临床检测标准操作指南2015-04-23自由度精准医疗本临床二代测序操作指南来自于Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) of 1988/College of American Pathologists (CAP) laboratory。

释义：Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) of 1988：美国临床实验室改进修正法规’88 。

这个法规里面有关于医学检验项目的一些质量规范，中国的临床行业很多项目的指标都参考过 CLIA’88 中的内容。

College of American Pathologists (CAP) laboratory：美国病理学家协会。

相较于Sanger测序，二代测序技术（新一代测序技术，NGS）拥有高通量和低单碱基成本的特点，这使其在临床检测领域拥有得天独厚的优势。

过去的数年间，相当数量的NGS服务商迅速成长，而美国病理学家协会却没有及时依照美国临床实验室改进修正法规（CLIA）编制指南来规范这个检测。

基于NGS平台的临床检测是一种新的检测方式，相较于原有检测方法，其复杂程度大大提高，因此迫切需要一个规范标准来指导各实验室进行检测。

CAP于2011年成立了NGS工作部门，商讨NGS临床检测实验检查表的内容。

本次CAP列出共计18条实验室要求的检查表，包含检测的二代测序实验过程和生物信息学分析过程。

二代测序技术（NGS）包含两个部分：实验操作部分（wet bench）和生物信息分析部分（dry bench）。

实验操作部分包括以下部分或所有的流程：病例样本的采集处理、核酸提取、片段化、生物分子标签（barcode）、目标区段/基因捕获富集、连接、扩增、文库构建、上机测序、数据产出。

生物信息分析部分主要依赖于高性能的计算机和不同的生物信息分析方法，主要流程包括：参考序列比对、组装、变异检测、注释、临床解释（依赖于是否运用诊断工具）。

美国病理学会对于二代测序临床诊断的实验室标准

美国病理学会（CAP）对于二代测序临床诊断的实验室标准相对于桑格测序来说，二代测序的较高的通量和每个碱基所消耗较低的成本,使得其快速应用于临床检测领域。

尽管在19８8年美国病理学会（CＡP)没有给出这项技术在临床诊断上的实验室标准规范。

但在过去的几年,能够提供二代测序检测服务的实验室相应的不断增加．目的:针对应用二代测序技术的临床诊断给出一个检查清单用以标准化实验操作平台和生物信息数据分析平台。

因为基于NGS的临床检测是一个新的诊断技术,而且相对于一代测序其更为复杂,所以目前亟需针对这些检测制定新的标准规范。

设计:针对NGS制定必要的规章制度，促进这项技术更好地应用于临床检测．在2011年CＡP成立了NＧS工作组委员会,以对检测清单的项目内容进行仔细研究．结果：在CAP分子病理学检测清单中总共包含针对实验操作平台和生物信息数据分析平台的18项实验室认证要求清单。

结论：这项经CＡP委员会认真考虑后所给的报告陈述了对于制定新的检测清单的重要性。

其中包含文件、批准、质保、验证、异常日志、监控升级、各个版本解释及报告、附带的发现、数据储藏、可追溯性模板、数据传送保密性等的处理。

DNＡ测序即二代测序技术(ＮGS)由七十年代的化学测序法和桑格测序法逐渐演化而来。

NGＳ与一代测序主要的不同是其可以并行的对数以百万的DＮＡ短片段同时测序而非仅有一种DNＡ片段。

在九十年代中期基于荧光毛细管凝胶电泳的自动化桑格测序的产生使得ＤNA测序普遍应用于临床诊断。

而NGS更高的通量远远超过自动化桑格测序．二代测序的较高的通量和每个碱基所消耗较低的成本,使得其快速应用于临床检测领域，尽管NGS各方面分析都更为复杂.包括数据获得和储藏的案例远超出于1988年临床检验科改善后的实验室修正案，对于后续数据计算具有较大挑战性.ＮGS检测的领域涉及遗传病、实体瘤、恶性血液病、传染性疾病，人类白细胞抗原分析,非侵害性产前诊断，胎儿染色体异常检测。